專利名稱：羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及腫瘤靶向治療藥物，具體涉及羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒及其用途。該納米微?？蛇M(jìn)一步制備肝臟腫瘤特異性靶向治療藥物
背景技術(shù)：
據(jù)報(bào)道,肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第5位、死因第3位，在我國(guó)則已經(jīng)成為惡性腫瘤的第2位殺手，肝癌總的5年生存率不足5 %，每年新發(fā)病564000例，死亡549000例。目前原發(fā) 肝癌的治療首選手術(shù)切除，手術(shù)切除率為15%-20%，肝癌根治性切除的5年復(fù)發(fā)率高達(dá)61.5%。對(duì)于不能手術(shù)切除的肝癌，介入治療是首選的治療方法，遠(yuǎn)期療效并不理想，5年的生存率僅6%左右。近年來肝移植治療肝癌的逐漸增多，其優(yōu)勢(shì)不僅在于完整切除腫瘤，除去腫瘤生長(zhǎng)的基礎(chǔ)病變，而且從根本上改善患者肝臟功能，尤其對(duì)于不能手術(shù)切除或不能耐受肝切除的肝癌，肝移植是目前唯一的外科根治治療手段，但是術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致低存活率嚴(yán)重制約肝癌肝移植的發(fā)展。Calne等研究發(fā)現(xiàn)37. 5%肝癌肝移植術(shù)后2月-5年死于腫瘤復(fù)發(fā)，5年生存率為18.6%，主要與殘存具有生物活性的癌細(xì)胞通過體液、血液和淋巴攜帶轉(zhuǎn)移至某一部位生長(zhǎng)繁殖有關(guān)。雖然肝切除或肝移植術(shù)后通過全身或局部化療預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)，在一定程度上提高術(shù)后生存率，但目前常用的化療藥物敏感性差，缺乏靶向性，全身毒副作用大，導(dǎo)致心、肝、腎等重要臟器功能損害，阻礙其臨床廣泛應(yīng)用，因此研制新的靶向性和抗腫瘤作用強(qiáng)，能與肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合，局部藥物聚集、緩釋，全身毒副反應(yīng)小的藥物是肝癌治療及預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移研究的重點(diǎn)之一。納米粒子(nanoparticles)具有比表面積大,表面原子數(shù)、表面能和表面張力隨粒徑的下降急劇增加，各納米單位間存在著或強(qiáng)或弱的相互作用，這些特點(diǎn)使納米粒子具有小尺寸效應(yīng)，表面效應(yīng)及很強(qiáng)的吸附性和生物活性，表現(xiàn)出許多優(yōu)異性能和全新的功能，可作為藥物的載體，改變藥物體內(nèi)分布特征，提高了藥物吸收利用度和穩(wěn)定性，改善藥物性質(zhì)和靶向性，藥物緩釋，藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，藥物劑量減少，減輕或避免毒副作用，且利于儲(chǔ)存，是近年來腫瘤治療新的發(fā)展領(lǐng)域，已顯示出其良好的優(yōu)勢(shì)。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)-阿霉素納米微粒靜脈或磁性阿霉素白蛋白納米微粒(IOO-IOOOnm)肝動(dòng)脈給藥后注入肝腫瘤小鼠體內(nèi)，由于肝臟Kupffer細(xì)胞具有高吞噬活性，吞噬載藥納米微粒后在肝內(nèi)起到藥物儲(chǔ)存庫(kù)作用，緩慢釋放抗腫瘤藥物，與游離阿霉素相比，抗腫瘤效果顯著。馬錢子為馬錢科植物馬錢或皮氏馬錢的成熟種子，具有散結(jié)消腫，通絡(luò)止痛之功效，常用于治療各種炎癥和痹癥。馬錢子堿(Brucine)是馬錢子主要成分之一，是一種弱堿性生物堿，水溶性差，作為活血通絡(luò)和“以毒攻毒”代表藥物，對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞功能有劑量依賴性的功能調(diào)節(jié)作用，具有明顯的抑瘤作用和很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，近期有研究發(fā)現(xiàn)馬錢子堿與馬錢子堿-聚乳酸納米微粒顯著抑制SMMC-7721人肝癌細(xì)胞從S期進(jìn)入G2、M期，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，而且馬錢子堿-聚乳酸納米微粒抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果顯著優(yōu)于馬錢子堿單體，為馬錢子堿及其靶向治療肝細(xì)胞肝癌的深入研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但由于馬錢子堿是劇毒中藥，其治療量與中毒量非常接近，全身用藥劑量大，毒副作用強(qiáng)。如何進(jìn)一步改善馬錢子堿的靶向性和腫瘤局部藥物聚集、持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，降低全身毒副反應(yīng)，是提高馬錢子堿抗肝癌效應(yīng)的關(guān)鍵所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種新的腫瘤靶向治療藥物，具體涉及羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒及其在制備腫瘤靶向治療藥物中的用途。本發(fā)明利用納米技術(shù)制備羧基化聚乙二醇聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒，該納米微粒能克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，增強(qiáng)馬錢子堿在腫瘤組織特異性積聚，提高它的腫瘤 親和性和抗腫瘤效應(yīng)，降低全身應(yīng)用毒副作用。具體而言，本發(fā)明的羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒，其特征在于，以馬錢子堿為活性成分，以生物降解材料羧基化聚乙二醇(carboxylationpolyethylene glycol,CPEG)和聚乳酸(polylactic acid,PLA)作為藥物輔料制成馬錢子堿-羧基化聚乙二醇/聚乳酸嵌段共聚物納米微粒(Brucine/CPEG/PLA Nanoparticles,BCPNS)，該納米微粒中攜載馬錢子堿含量為4. 2% 4. 6%，包封率為67% 82%。本發(fā)明中，羧基化聚乙二醇、聚乳酸嵌段共聚后其重量比為羧基化聚乙二醇聚乳酸=1.5 2. 5，馬錢子堿與羧基化聚乙二醇/聚乳酸嵌段共聚物的重量比為I : 20;本發(fā)明中，納米微粒攜載馬錢子堿濃度為800ii g/ml ；本發(fā)明中，納米微粒的粒徑為183. 2-322. 2nm ；本發(fā)明中，藥物釋放結(jié)果為Bru_NP在48小時(shí)內(nèi)釋放完全，24小時(shí)累積釋放超過80%。本發(fā)明采用超聲乳化-化學(xué)交聯(lián)法制備馬錢子堿-羧基化聚乙二醇/聚乳酸嵌段共聚物納米微粒，將羧基化聚乙二醇/聚乳酸嵌段共聚物、二氯甲烷和馬錢子堿同時(shí)溶解于有機(jī)溶劑中，與8%聚乙烯醇混合形成初乳，干燥揮去二氯甲烷，離心除去聚集體，超濾除去游離馬錢子堿，制得納米微粒；其包括步驟將馬錢子堿和PLA-PEG-C00H油相和8%聚乙烯醇水溶液水相混合，用高剪切乳勻機(jī)分散，12000rpm轉(zhuǎn)速下剪切5min得分散液，再將該分散液在300w功率超聲條件下繼續(xù)乳化，超聲，得初乳液；將初乳液倒入處方量的稀釋液中，攪拌后，進(jìn)行液中干燥，揮去CH2Cl2,將液中干燥后的乳液離心去除聚集體，收集上清液得馬錢子堿納米乳液；將馬錢子堿納米乳液裝入超濾離心管中離心，進(jìn)行濃縮并除去游離馬錢子堿后，用純化水洗滌濃縮液，再超濾離心，獲得馬錢子堿納米濃縮液，6°Co輻照滅菌，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明進(jìn)行了馬錢子堿納米微粒組織分布與抗腫瘤作用試驗(yàn)馬錢子堿納米微粒經(jīng)尾靜脈注射24h后，在小鼠主要臟器分布相似，組織中以肝臟及脾臟濃度最高，其次是肺、腎、肌肉，心、腦、胃、脂肪含量最低，結(jié)果表明，本發(fā)明的馬錢子堿納米粒顯著抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，隨藥物濃度的增加，肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用明顯，呈現(xiàn)劑量依賴性；其抑制 肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)與誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡有關(guān)，其作用機(jī)制與上調(diào)肝癌細(xì)胞Fas蛋白和mRNA表達(dá)有關(guān)。本發(fā)明的納米微粒利用羧基化的聚乙二醇與聚乳酸形成嵌段共聚物，共聚物末端含有水溶性聚合物聚乙二醇鑲嵌，能顯著提高體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)時(shí)相，能明顯避免馬錢子堿脂質(zhì)體體內(nèi)釋藥速度過快，難以在局部達(dá)到有效抗癌藥物濃度等缺陷。比較現(xiàn)有技術(shù)公開的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(大白兔)藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)研究，其中，馬錢子堿溶液給藥2小時(shí)后血中已經(jīng)測(cè)不出Brucine，慢分布半衰期7. 5分鐘，而將馬錢子堿包封于脂質(zhì)體后，給藥12小時(shí)后血中仍然保持一定的濃度分布，消除半衰期比前者延長(zhǎng)6. 6分鐘，但藥物釋放仍然過快，而且肝臟靶向性不強(qiáng)，難以在局部達(dá)到有效的藥物濃度。本發(fā)明的納米微?？蛇M(jìn)一步制備抗腫瘤納米藥物，或控釋或靶向聚集抗腫瘤藥物，用于肝臟腫瘤靶向治療，其同時(shí)具有腫瘤靶向性、抗腫瘤效應(yīng)和控釋藥物的作用。本發(fā)明的羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒，具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)I.制備工藝簡(jiǎn)便，包封率高，藥物釋放穩(wěn)定，成球性好，所制備的納米藥物微粒在理化性質(zhì)等方面符合腫瘤靶向治療的需要。2.利用羧基化聚乙二醇和聚乳酸的釋藥性質(zhì)，以馬錢子堿、羧基化聚乙二醇和聚乳酸嵌段交聯(lián)為骨架結(jié)構(gòu)制備納米微粒，避免了單獨(dú)用聚乙二醇釋藥速度過快，體內(nèi)滯留時(shí)間短，難以在腫瘤局部達(dá)到有效抗癌藥物濃度等缺陷。3.成功用羧基化聚乙二醇和聚乳酸形成嵌段共聚物，控制納米藥物在體內(nèi)釋放和降解速度，在藥物緩釋，降低馬錢子堿藥物毒性方面具有顯著的安全意義。4.納米藥物材料選擇生物相容性好、可降解的聚合物聚乳酸作為骨架載體，聚合物末端由含有水溶性聚合物PEG鑲嵌，達(dá)到體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)的控釋效果。


圖I.羧基化聚乙二醇/聚乳酸嵌段共聚物的1H-NMR測(cè)定圖譜。圖2.馬錢子堿-羧基化聚乙二醇/聚乳酸納米微粒透射和掃描電鏡圖，其中，透射電鏡X 10，000;掃描電鏡X 50，000。圖3馬錢子堿納米微粒體粒徑分布圖。圖4.馬錢子堿納米微粒體外藥物釋放圖。圖5.馬錢子堿納米微粒對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721生長(zhǎng)抑制作用。圖6.馬錢子堿納米微粒作用于人肝癌細(xì)胞72h凋亡相關(guān)蛋白Fas表達(dá)，其中，A :與C組同等劑量空白納米粒；B :與D組同等劑量空白納米粒；C 160 U g/ml馬錢子堿納米粒；D 320 μ g/ml馬錢子堿納米粒。圖7.馬錢子堿納米微粒對(duì)肝癌細(xì)胞粘附能力影響。圖8.馬錢子堿納米微粒對(duì)肝癌細(xì)胞遷徙能力影響。圖9.馬錢子堿納米微粒對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力影響。圖10.馬錢子堿納米微粒藥代動(dòng)力學(xué)。圖11.馬錢子堿納米微粒在荷瘤裸鼠體內(nèi)組織分布。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I制備羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒
權(quán)利要求
1.羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒，其特征在于，以馬錢子堿為活性成分，以羧基化聚乙二醇和聚乳酸作為藥物輔料制成馬錢子堿-羧基化聚乙二醇/聚乳酸嵌段共聚物納米微粒，該納米微粒中攜載馬錢子堿含量為4. 2% 4. 6%，包封率為67% 82%，馬錢子堿與羧基化聚乙二醇/聚乳酸嵌段共聚物的重量比為I : 20。
2.按權(quán)利要求I所述的羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒，其特征在于，所述的羧基化聚乙二醇/聚乳酸嵌段共聚物中的重量比為羧基化聚乙二醇聚乳酸=1.5 2. 5。
3.按權(quán)利要求I所述的羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒，其特征在于，所述的納米微粒攜載馬錢子堿濃度為800ii g/mlo
4.按權(quán)利要求I所述的羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒，其特征在于，所述的納米微粒的粒徑為183. 2-322. 2nm。
5.權(quán)利要求I的羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒的制備方法， 其特征是，其包括步驟將羧基化聚乙二醇/聚乳酸嵌段共聚物、二氯甲烷和馬錢子堿同時(shí)溶解于有機(jī)溶劑中，與8%聚乙烯醇混合形成初乳，干燥揮去二氯甲燒，離心除去聚集體，超濾除去游離馬錢子堿，制得羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒。
6.權(quán)利要求I或2或3或4所述的羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒在制備抗腫瘤納米藥物中的用途。
7.按權(quán)利要求4所述的用途，其特征是，所述的抗腫瘤納米藥物為控釋或靶向聚集的抗腫瘤納米藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒及其用途。本發(fā)明以馬錢子堿為活性成分，以羧基化聚乙二醇和聚乳酸作為藥物輔料制成，該納米微粒中攜載馬錢子堿含量為4.2％～4.6％，包封率為67％～82％。本發(fā)明的馬錢子堿納米微粒，用于抗肝癌治療，通過外周靜脈給藥后，羧基化聚乙二醇/聚乳酸嵌段共聚物納米載體能夠增加馬錢子堿在肝臟腫瘤組織聚集，使藥物在局部緩慢釋放，延長(zhǎng)藥物對(duì)腫瘤組織的作用時(shí)間，提高局部藥物濃度，降低馬錢子堿全身毒性。具有腫瘤組織藥物聚集、藥物釋放穩(wěn)定，抗癌效果好，安全等優(yōu)勢(shì)。該納米藥物的發(fā)明具有很好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K47/34GK102716086SQ20111008448
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者撒忠秋, 李琦, 楊林, 殷佩浩, 盛霞, 秦建民, 陳慶華, 高科攀, 黃濤 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院, 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院