專利名稱：膜定位葡萄球菌腸毒素a及其基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種膜定位葡萄球菌腸毒素A及其基因序列。
背景技術(shù)：
超抗原(superantigen，SAg)是Janice White等在1989年研究了金黃色葡萄球菌腸毒素Staphylococcal enterotoxin, SE)對(duì)T淋巴細(xì)胞具有很強(qiáng)的刺激作用后提出的免疫學(xué)新概念。目前報(bào)道的可用于臨床抗腫瘤作用的SAg只有SE，而SE是由金黃色葡萄球菌分泌的一組具有超抗原活性的細(xì)菌毒素，SE是目前已知的人淋巴細(xì)胞最強(qiáng)的刺激劑和最有力的細(xì)胞因子誘生劑。是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的超抗原，也是目前研究最多、臨床使用最為廣泛的SAg。SE主要包括有金黃色葡萄球菌腸毒素A (SEA)、金黃色葡萄球菌腸毒素B (SEB)、金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)。盡管超抗原具有強(qiáng)大的誘生抗腫瘤效應(yīng)，但目前只有個(gè)別超抗原進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，主要原因是超抗原對(duì)機(jī)體的毒副作用較大。僅需極微量(1 IOng/ mL)的超抗原就可以激活大量T細(xì)胞，分泌多種足量的細(xì)胞因子，使機(jī)體免疫調(diào)節(jié)紊亂，導(dǎo)致一些急性和慢性疾病的發(fā)生，如毒素中毒綜合征(高熱、皮疹和休克)、自身免疫性疾病 (風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕熱、川奇病和非特異性皮炎)等。同時(shí)，超抗原誘發(fā)的超抗原依賴的細(xì)胞介導(dǎo)白勺細(xì)胞毒作用(Superantigen-dependent cell-mediated cytotoxicity, SDCC)對(duì)表達(dá)MHC II類分子的正常細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷作用。因此不解決SEA對(duì)機(jī)體的毒副作用， SEA就難以進(jìn)入臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上提出的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于，構(gòu)建一種膜定位葡萄球菌腸毒素 A(SEAtm)基因，所表達(dá)的膜定位葡萄球菌腸毒素A能夠有效地定位于細(xì)胞膜表面。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案本發(fā)明一方面涉及一種膜定位葡萄球菌腸毒素A(SEAtm)，所述膜定位葡萄球菌腸毒素A含有如下氨基酸序列的片段METDTLLLWVLLLWVPGS
TGDSEKSEEINEKDLRKKSE
LQGTALGNLKQIYYYNEKAK
TENKESHDQFLQHTILFKGF
FTDHSWYNDLLVDFDSKDIV
DKYKGKKVDLYGAYYGYQCA
GGTPNKTACMYGGVTLHDNN
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KVQRGLIVFHTSTEPSVNYDLFGAQGQYSNTLLRIYRDNKTINSENMHIDIYLYTSGSGGGGSGGGGSGGGGSDNLLPSffAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV。本發(fā)明另一方面還涉及一種膜定位葡萄糖菌腸毒素A的基因，其含有如下基因序列0 GCCTCGAGATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTT60 CCACTGGTGACAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAAAAAGATTTGCGAAAAAAGTCTG120 AATTGCAGGGAACAGCTTTAGGCAATCTTAAACAAATCTATTATTACAATGAAAAAGCTA180 AAACTGAAAATAAAGAGAGTCACGATCAATTTTTACAGCATACTATATTGTTTAAAGGCT240 TTTTTACAGATCATTCGTGGTATAACGATTTATTAGTAGATTTTGATTCAAAGGATATTG300 TTGATAAATATAAAGGGAAAAAAGTAGACTTGTATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTG360 CGGGTGGTACACCAAACAAAACAGCTTGTATGTATGGTGGTGTAACGTTACATGATAATA420 ATCGATTGACCGAAGAGAAAAAAGTGCCGATCAATTTATGGCTAGACGGTAAACAAAATA
480 CAGTACCTTTGGAAACGGTTAAAACGAATAAGAAAAATGTAACTGTTCAGGAGTTGGATC540 TTCAAGCAAGACGTTATTTACAGGAAAAATATAATTTATATAACTCTGATGTTTTTGATG600 GGAAGGTTCAGAGGGGATTAATCGTGTTTCATACTTCTACAGAACCTTCGGTTAATTACG660 ATTTATTTGGTGCTCAAGGACAGTATTCAAATACACTATTAAGAATATATAGAGATAATA720 AAACGATTAACTCTGAAAACATGCATATTGATATATATTTATATACAAGTGGATCCGGTG780 GAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCCT840 GGGCCATTACCTTAATCTCAGTAAATGGAATTTTTGTGATATGCTGCCTGACCTACTGCT900 TTGCCCCAAGATGCAGAGAGAGAAGGAGGAATGAGAGATTGAGAAGGGAAAGTGTACGCC960 CTGTATAAAGATCTGC本發(fā)明另外一方面還涉及一種載體或質(zhì)粒，其特征在于上述基因片段。本發(fā)明還涉及上述載體或質(zhì)粒在細(xì)菌、生物體內(nèi)所表達(dá)的產(chǎn)物。本發(fā)明另外一方面還涉及構(gòu)建構(gòu)建載體的方法，其特征在于包括如下步驟1、擴(kuò)增葡萄糖菌腸毒素A基因全長(zhǎng)片段；2、擴(kuò)增 CD80 基因；3、使用中性linker將SEA和CD80跨膜區(qū)序列融合；4、將融合的片段克隆到載體中。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，上述載體構(gòu)建方法所使用的中性linker片段為 GGGGSGGGGSGGGGS。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，上述序列融合優(yōu)選采用重疊引物進(jìn)行融合。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，融合時(shí)所使用的重疊引物為SEA-Forward GCTCTAGAGCATGAAAAAAACAGCAT TTAC ；
SEA-Reverse GGGATCCACTTGTATATAAATATATATCAAT ；CD80-Reverse CCGCTCGAGTTATACAGGGCGTACACT ；CD80-Forwardl GGTGG CTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCC ；CD80-Forward2 CGGGATCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT。本發(fā)明還涉及膜定位葡萄糖菌腸毒素A和/或其基因片段在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明的膜定位葡萄球菌腸毒素A具有以下優(yōu)點(diǎn)SEAtm 一方面能夠使表達(dá)的SEA 有效的錨定與細(xì)胞表面，充分發(fā)揮超抗原的作用，另一方面可以大大地降低SEA的毒性和免疫耐受現(xiàn)象的出現(xiàn)。轉(zhuǎn)染的pIRES2-SEAtm質(zhì)粒能夠在細(xì)胞中高效表達(dá)，同時(shí)利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)到SEAtm，能夠定位到細(xì)胞表面。


圖1 左側(cè)圖免疫熒光技術(shù)檢SEAtm，顯示其特意的定位于細(xì)胞表面；中間圖轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的pIRES2-EGFP-SEAtm中綠色熒光蛋白發(fā)出的熒光，證明細(xì)胞中本質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染；右側(cè)圖使用染核的染料復(fù)染細(xì)胞，并將不同激發(fā)波長(zhǎng)下的圖片重疊，即可看到膜定位的SEAtm，復(fù)染的細(xì)胞核，以及細(xì)胞整體發(fā)出的EGFP綠色熒光。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。1. SEA基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建用酚-氯仿抽提法提取產(chǎn)SEA標(biāo)準(zhǔn)葡萄球菌FRI 100的基因組DNA，采用SEA全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)gene bank的SEA序列設(shè)計(jì)SEA (D227A)的引物，引物序列為上游 5，-CGGGATCCAAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAAAAAG-3，；下游5，-CGGAATTCTTAACTTGTATATA AATATATATCAATATG-3，。引物分別包括了 BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)，其中下游引物長(zhǎng)度38 個(gè)堿基，包含終止碼，其中下游引物，包含一個(gè)使SEA全長(zhǎng)基因的752位堿基由A突變?yōu)镃的點(diǎn)突變，從而使SEA蛋白的227位氨基酸殘基由D變?yōu)锳。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ； 94°C變性30s ；50°C退火30s ；68°C延伸lmin，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。目的片段克隆到載體T-easy 中，進(jìn)行電泳和測(cè)序。電泳結(jié)果顯示從標(biāo)準(zhǔn)葡萄球菌FRI 100中克隆出了長(zhǎng)度為700bp的 SEA基因全長(zhǎng)片段，其測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的SEA序列完全相同。2.⑶80基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)gene bank中CD80基因cDNA序列設(shè)計(jì)CD80上下游引物CD80-F :GCCATGGG CCACACACGGAGGCAGGGAACATC, CD80-R :ACCCGGGTTATACAGGGCGTACACTTTCCCTTG,引物中橫線引入NcoI和SmaI酶切位點(diǎn)。用酚P氯仿抽提法提取的人肝癌cDNA為模板，Taq酶為聚合酶用相應(yīng)引物擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，(94°C變性30sec，55°C退火30sec， 72°C延伸lmin)共30個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸10min，4°C保存。目的片段克隆到載體T-easy中，進(jìn)行電泳和測(cè)序，電泳結(jié)果顯示從人肝癌cDNA中克隆出了長(zhǎng)度為SMbp的⑶80基因全長(zhǎng)片段，其測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的人⑶80基因cDNA序列完全相同。3. CD80穿膜區(qū)的構(gòu)建采用重疊引物設(shè)計(jì)法，設(shè)計(jì)了兩條上游引物，在CD80跨膜區(qū)序列的上游，引入中性 1 inker (GGGGSGGGGSGGGGS)，將 SEA 與 CD80tm連接通過(guò) 1 inker 將 SEA 和人的 CD80 跨膜區(qū)序列融合，構(gòu)建了能夠表達(dá)在細(xì)胞膜表面的跨膜型SEA(SEAtm)。所使用的引物序列如下SEA-Forward GCTCTAGAGCATGAAAAAAACAGCAT TTAC ；SEA-Reverse GGGATCCACTTGTATATAAATATATATCAAT ；CD80-Reverse CCGCTCGAGTTATACAGGGCGTACACT ；CD80-Forwardl GGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCC ；CD80-Forward2 CGGGATCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT。采用Reverse引物先后與!^orwardl和R)rward2引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，以攜帶SEA 和CD80cDNA的質(zhì)粒為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增SEA基因和linker_CD80tm。擴(kuò)增SEA基因時(shí)，采用的退火溫度和延伸溫度分別為50°C和68°C，反應(yīng)體系在94°C變性5min后，再進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，條件為94°C 30s, 50°C 50s及68°C lmin，最后再于72°C延伸7min。擴(kuò)增 CD80TM時(shí)，將延伸時(shí)間縮短為30s，其余的條件不變。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下含目的片段的凝膠，按試劑盒說(shuō)明書(shū)回收DNA產(chǎn)物。采用將2個(gè)基因片段分別進(jìn)行雙酶切，克隆到PLXSN的B10 I和Bgl II位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH5 α，在含有氨芐青霉素(100mg/L)、X-gal (20g/L)和 IPTG(200g/L)的 LB 平板上，于 37°C培養(yǎng) 15h，再挑去克隆進(jìn)行鑒定。4.膜定位SEA序列的構(gòu)建根據(jù)GeneBank中免疫球蛋白Lambda鏈引導(dǎo)序列及標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌FRI1000 的SEA基因序列，分別設(shè)計(jì)上、下游引物tmSEA-FOl GCCTCGAGATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAG ；tmSEA-F02 GCAGATCTTTATACAGGGCGTACACTTTCCC TTCTC ；tmSEA-R GCAGATCTTTATACAGGGCGTACACTTTCCCTTC TC,分別包含XhoI和Bgl II酶切位點(diǎn)。以KS-tmSEA作為模板，首先采用tmSEA-FOl和SEA-R引物克隆SEA片段。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸10min，4°C保存。在基因序列的5’端加入kappa鏈的leading sequence ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTT，將獲得的片段采用 Xho I和Bgl II雙酶切，克隆至Ij pIRES2-EGFP的Xho I和BamH I位點(diǎn)。5. SEAtm表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)將清潔、滅菌處理的蓋玻片鋪于12孔板的底部，接種有融合基因轉(zhuǎn)錄的腫瘤細(xì)胞。20 24h待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，取出蓋玻片，用0. Olmol/LPBS沖洗兩遍，再以40g/L多聚甲醛固定30min，用間接免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞染色，一抗為小鼠抗SEAmAb (Sigma公司)， 二抗為Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgGdnvitrogen公司)。采用Hoechst 33258襯染細(xì)胞核，以 500mL/L緩沖甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察并照相，確定膜定位SEA(SEAtm)的細(xì)胞定位。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)SEA能夠定位到細(xì)胞表面，熒光檢測(cè)見(jiàn)過(guò)見(jiàn)附圖1。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1. 一種膜定位葡萄糖菌腸毒素A，其特征在于其含有如下氨基酸序列的片段METDTLLLWVLLLWVPGSTGDSEKSEEINEKDLRKKSELQGTALGNLKQIYYYNEKAKTENKESHDQFLQHTILFKGFFTDHSWYNDLLVDFDSKDIVDKYKGKKVDLYGAYYGYQCAGGTPNKTACMYGGVTLHDNNRLTEEKKVPINLWLDGKQNTVPLETVKTNKKNVTVQELDLQARRYLQEKYNLYNSDVFDGKVQRGLIVFHTSTEPSVNYDLFGAQGQYSNTLLRIYRDNKTINSENMHIDIYLYTSGSGGGGSGGGGSGGGGSDNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV。
2.一種膜定位葡萄糖菌腸毒素A的基因片段，其特征在于其含有如下基因序列 0 GCCTCGAGATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTT60 CCACTGGTGACAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAAAAAGATTTGCGAAAAAAGTCTG 120 AATTGCAGGGAACAGCTTTAGGCAATCTTAAACAAATCTATTATTACAATGAAAAAGCTA 180 AAACTGAAAATAAAGAGAGTCACGATCAATTTTTACAGCATACTATATTGTTTAAAGGCT 240 TTTTTACAGATCATTCGTGGTATAACGATTTATTAGTAGATTTTGATTCAAAGGATATTG 300 TTGATAAATATAAAGGGAAAAAAGTAGACTTGTATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTG 360 CGGGTGGTACACCAAACAAAACAGCTTGTATGTATGGTGGTGTAACGTTACATGATAATA 420 ATCGATTGACCGAAGAGAAAAAAGTGCCGATCAATTTATGGCTAGACGGTAAACAAAATA 480 CAGTACCTTTGGAAACGGTTAAAACGAATAAGAAAAATGTAACTGTTCAGGAGTTGGATC 540 TTCAAGCAAGACGTTATTTACAGGAAAAATATAATTTATATAACTCTGATGTTTTTGATG 600 GGAAGGTTCAGAGGGGATTAATCGTGTTTCATACTTCTACAGAACCTTCGGTTAATTACG 660 ATTTATTTGGTGCTCAAGGACAGTATTCAAATACACTATTAAGAATATATAGAGATAATA 720 AAACGATTAACTCTGAAAACATGCATATTGATATATATTTATATACAAGTGGATCCGGTG 780 GAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCCT 840 GGGCCATTACCTTAATCTCAGTAAATGGAATTTTTGTGATATGCTGCCTGACCTACTGCT 900 TTGCCCCAAGATGCAGAGAGAGAAGGAGGAATGAGAGATTGAGAAGGGAAAGTGTACGCC 960 CTGTATAAAGATCTGC
3.一種載體或質(zhì)粒，其特征在于含有如權(quán)利要求2所述的基因片段。
4.權(quán)利要求3所述載體或質(zhì)粒在細(xì)菌、生物體內(nèi)所表達(dá)的產(chǎn)物。
5.構(gòu)建權(quán)利要求3所述載體的方法，其特征在于包括如下步驟擴(kuò)增葡萄糖菌腸毒素A基因全長(zhǎng)片段； 擴(kuò)增⑶80基因；使用中性linker將SEA和⑶80跨膜區(qū)序列融合； 將融合的片段克隆到載體中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體構(gòu)建方法，其特征在于所述的中性linker片段為 GGGGSGGGGSGGGGS。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的載體構(gòu)建方法，其特征在于采用重疊引物進(jìn)行融合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的載體構(gòu)建方法，其特征在于重疊引物為 SEA-Forward GCTCTAGAGCATGAAAAAAACAGCATTTAC ； SEA-Reverse GGGATCCACTTGTATATAAATATATATCAAT ； CD80-Reverse CCGCTCGAGTTATACAGGGCGTACACT ； CD80-Forwardl GGTGG CTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCC ； CD80-Forward2 CGGGATCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT。
9.權(quán)利要求1所述的膜定位葡萄糖菌腸毒素A在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2所述的膜定位葡萄糖菌腸毒素A的基因片段在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種膜定位葡萄球菌腸毒素A(SEAtm)及其基因序列，該膜定位葡萄球菌腸毒素A一方面能夠使表達(dá)的SEA有效的錨定與細(xì)胞表面，充分發(fā)揮超抗原的作用，另一方面可以大大地降低SEA的毒性和免疫耐受現(xiàn)象的出現(xiàn)，提高了其在抗腫瘤中的臨床應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K38/16GK102199199SQ201110084560
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者葉菁, 吳雅嵐, 李增山, 袁媛, 隋延仿 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)