專利名稱：高效表達和高抗病毒活性的豬α干擾素基因及其表達蛋白的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術中基因表達領域，特別涉及一種高效表達和高抗病毒活性的豬α 干擾素基因，還涉及其表達蛋白的用途。
背景技術：
干擾素(IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、免疫調節(jié)作用的細胞因子。IFN可分為兩個型(I型和II型)，IFN-α屬于I型干擾素，是機體細胞抵抗病毒感染的第一道防線， 具有三大功能抗病毒作用、抗腫瘤作用和免疫調節(jié)作用。Lefevre等1990年首先克隆了豬 IFN-α (pIFN-α )基因并將其成熟蛋白基因在大腸桿菌中表達，具有較強的抗病毒活性。 隨后國內外學者用腺病毒、大腸桿菌、酵母等表達了 pIFN-α，對其生物學活性進行了大量研究。本課題組也曾將PlFN-α克隆入真核表達載體pVAXl°，轉染ΗΕΚ493Α細胞后表達的 PIFN-α 活性較低，僅為 lX106_°U/0. ImL0豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，俗稱〃豬藍耳病"，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起，病毒感染后可以導致母豬流產、返情、產死胎或弱仔、仔豬死亡及各種年齡的豬不同程度的呼吸道癥狀，并且能破壞豬的免疫系統(tǒng)，引起混合感染或繼發(fā)感染。我國于1995年底爆發(fā)此病，并迅速蔓延到全國多個省份。在許多規(guī)?；i場，PRRS陽性率很高，有的可達80%以上。自2006年以來，我國部分地區(qū)豬場發(fā)生了由PRRSV變異株導致的高致病性藍耳病。該病在臨床上以發(fā)病豬高熱、呼吸困難、皮膚發(fā)紅為主要特征，具有更高的發(fā)病率和死亡率，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了極為嚴重的經濟損失。

發(fā)明內容
為了解決以上問題，本發(fā)明提供了一種高效表達和高抗病毒活性的，特別是能有效抑制高致病性PRRSV的豬α干擾素基因。本發(fā)明還提供了所述豬α干擾素基因通過分子生物學技術克隆至真核表達載體獲得的重組質粒。本發(fā)明還提供了所述豬α干擾素基因的制備方法。本發(fā)明還提供了所述豬α干擾素基因表達蛋白的用途。本發(fā)明是通過以下措施實現的
一種高效表達和高抗病毒活性的豬α干擾素基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所
7J\ ο一種序列2的基因通過分子生物學技術克隆至真核表達載體獲得的重組質粒。一種所述的豬α干擾素基因的合成方法，包括以下步驟 1、將真核質粒PVAX1°改造為pMVAXl°
由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882，在上游引入AiI酶切位點和pCMV即刻早期啟動子的一段序列，在下游引入T7啟動子序列和feoRI酶切位點，人工拼接后的核苷酸序列如序列表中序列1所示，將此段基因序列通過Ai酶切位點插入pVAXl°載體中，轉化感受態(tài)細菌，提取質粒經篩選得到SstV ^oRI雙酶切陽性克隆，命名為pMVAXl° ；
所述 pCMV 即刻早期啟動子的一段序列為5，-GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCA TCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3’， 所述 T7 啟動子序列為5，-AATACGACTCACTATAGGG-3，； 2、構建表達pIFN-α的重組真核質粒pMVAXl°-pIFN-a 2. 1設計一對擴增pIFN-a成熟蛋白的基因序列的特異性引物，引物序列如下 pIFN-a -Fwd :5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGCTGCGACCTGCCTCAGA-3，， pIFN-a -Rev :5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATCACTCCTTCTTCCTGAGT-3’， 在上游引物pIFN-a -Fwd的5’端引入限制性內切酶位點和Kozak序列，在下游引物pIFN-a -Rev的5’端引入損ol限制性內切酶位點；
2. 2從豬的脾或血淋巴細胞提取RNA，經反轉錄后得到cDNA，采用RT-PCR技術擴增出 pIFN-a的成熟蛋白基因的PCR產物；
2. 3用feoRI/IAoI雙酶切pMVAXl°，膠回收得包含序列1的載體基因片段1，ρIFN- a 的成熟蛋白基因的PCR產物經feoRI/ZAoI雙酶切并膠回收得到編碼pIFN-a成熟蛋白的基因片段2，將載體基因片段1和基因片段2連接，轉化感受態(tài)細菌，培養(yǎng)，挑取菌落于卡那霉素抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質粒，進行^01 1/損01雙酶切鑒定，篩選出陽性克隆，得 pMVAXl°-pIFN- α，真核質粒pVAXl°中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。步驟2.2 中 PCR反應體系為 25μ 中，含 cDNA lPL，Mg2+ 1. 5mmol/L,dNTP 200Mmol/ L, IOXLA PCR Buffer 2. 5μ , pIFNa -Fwd 和 pIFNa -Rev 濃度均為 400nmol/L, TaKaRa LA Taq 2U ；反應條件為預變性95°C 5min，然后進行35個循環(huán)，循環(huán)條件為95°C 45s，62°C 45s, 72°C Imin ；然后72°C延伸lOmin，取出產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。步驟2. 2中RNA的提取步驟如下無菌采集豬的脾臟或血液，用淋巴細胞分離液分離脾或者血液淋巴細胞，用10%胎牛血清的1640液在37°C含(X)2 5v%的環(huán)境中培養(yǎng)lh，然后加入50(^g/mL的植物血凝素PHA刺激12h，用TRIzol試劑提取總RNA。一種所述的豬α干擾素基因的表達蛋白在制備治療豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應用。本發(fā)明的有益效果是
(1)用改造過的真核質粒？￥4乂1°即？1^々乂1°表達？0^-(1成熟蛋白基因，突破了通過 pVAXl°載體表達pIFN-α過程中遇到的表達量較低和活性較差的局限性；
(2)體外抗病毒試驗證明，本發(fā)明構建的pIFN-α表達活性很高，轉染Wg pMVAXl°-pIFN- α至ΗΕΚ493Α細胞的裂解物，用VSV檢測IFN的活性單位高達 2X 107 0U/0. ImL,當活性在IOOU以上時能夠明顯抑制高致病性PRRSV在Marc_145細胞上的增殖，專用于對高致病性PRRSV等病毒性疾病的預防治療及減少豬場的經濟損失。


圖1為本發(fā)明改造真核質粒pVAXl°為pMVAXl°及克隆pIFN-α成熟蛋白基因入 PMVAXl0的示意圖，
圖2為本發(fā)明重組質粒pMVAXl°5^I/^boRI雙酶切鑒定圖譜，其中 M 為 DL2，000 DNA Marker,
41為重組陽性質粒pMVAXl°的5^1/^boRI雙酶切結果，
圖3為本發(fā)明重組質粒pMVAXl°-pIFN-a的feoRI/ZAoI雙酶切鑒定圖譜，其中 M 為 DL2，000 DNA Marker,
1和2為兩個不同重組陽性質粒pMVAXl°-pIFN-a的雙酶切結果。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發(fā)明的豬α干擾素基因進行進一步說明。.將真核質粒pVAXl°改造為pMVAXl° 1.1插入基因的人工合成
參考GenBank公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列(GenBank No: V00882), 在上游引入AiI酶切位點和pCMV即刻早期啟動子的一段序列，在下游引入Τ7啟動子序列和feoRI酶切位點，將這段基因序列拼接在一起交由TaKaRa公司人工合成，具體編碼的包含Rabbit β -Globin Intron II基因的核苷酸序列見序列表中序列1，并克隆入T載體。所述pCMV 即刻早期啟動子的一段序列為 5，-GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACG CCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3’，
所述 T7 啟動子序列為 5，-AATACGACTCACTATAGGG-3，； 1. 2 pMVAXf的構建及鑒定
從T載體上5^1/^boRI雙酶切目的基因并膠回收，與同樣經過Ai雙酶切的
真核質粒pVAXl°并膠回收的載體片段在16°C過夜連接，轉化DH5ci感受態(tài)細菌，37°C過夜培養(yǎng)16h。挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中37°C過夜振蕩培養(yǎng)，第二天提取質粒， 進行雙酶切鑒定，鑒定為陽性的質粒命名為pMVAXl°，交由TaKaRa公司測序，插入的基因片段序列與序列表中序列1相吻合。. pIFN-α成熟蛋白的基因克隆入pMVAXl° 2.1引物的設計及合成
根據GenBank公布的pIFN-α的基因序列(GenBank no. )(57191)，設計一對擴增 ρIFN- α成熟蛋白的基因序列的特異性引物，在上游引物ρIFN- α -Fwd的5 ’端引入限制性內切酶位點和Kozak序列，在下游引物pIFN-α -Rev的5’端引入損ol限制性內切酶位點，引物序列如下
ρIFN-α -Fwd 5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGCTGCGACCTGCCTCAGA-3 ’ ρIFN- α -Rev: 5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATCACTCCTTCTTCCTGAGT-3’。兩條引物pIFN- α -Fwd和pIFN- α -Rev橫跨pIFN- α成熟蛋白編碼區(qū)，預計擴增片段長度為540bp左右，引物由TaKaRa公司合成。2. 2豬脾淋巴細胞的分離培養(yǎng)、誘導及總RNA的提取
無菌采集約克豬的脾臟或者外周血，用淋巴細胞分離液分離脾淋巴細胞或外周血淋巴細胞，用10%胎牛血清的1640液在37°C、含(X)2 5v%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，然后加入500μβ/ mL的植物血凝素(PHA)刺激1 后，用TRIzol試劑提取總RNA，作為RT-PCR的模板。2. 3 RT-PCR 擴增
以RNA經反轉錄酶Oligo cKT)反轉錄得到的cDNA為模板，pIFN- α -Fwd和 pIFN-α -Rev 為引物進行 PCR 擴增，PCR 反應體系為 25μ ，含 cDNA Ιμ , Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, 10XLA PCR Buffer 2. 5μ ，pIFN α-Fwd 禾口 pIFN α-Rev 的濃度均為 400nmol/L，TaKaRa LA Taq 2U。反應條件為預變性95°C 5min ；然后進行35個循環(huán)，循環(huán)條件為95°C 45s, 62°C 45s, 72°C lmin ；然后72°C延伸lOmin，取出產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收獲得PIFN- α成熟蛋白基因的PCR產物。2. 4重組真核表達質粒的構建及鑒定
用feoRI/ZAoI雙酶切pMVAXl°，膠回收得到包含序列1的載體基因片段1，ρIFN-α的成熟蛋白基因的PCR產物經feoRI/ZAoI雙酶切并膠回收得到編碼pIFN-α成熟蛋白的基因片段2，將載體基因片段1和基因片段2連接，轉化DH5 α感受態(tài)細菌，37°C過夜培養(yǎng)16h。 挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中37°C過夜振蕩培養(yǎng)，第二天提取質粒，進行feoRI/ 煬ol雙酶切鑒定。鑒定為陽性的質粒pMVAXl°-pIFN-a交由TaKaRa公司測序。用Vector NTI和DNAMar軟件分析所插入的基因序列和推導氨基酸序列，真核質粒pVAXl°中插入的核苷酸序列如序列表中序列2所示，推導氨基酸序列如序列表中序列3所示。重組真核質粒表達的pIFN-α的抗病毒活性測定
3.1重組質粒pMVAXl°-pIFN-a轉染人胚腎上皮細胞HEK493A 實驗組具體操作按Lipofectamine 2000 (Invitrogen)說明書進行。轉染在6孔細胞板上進行，在轉染的前一天，消化ΗΕΚ493Α細胞，用10%的胎牛血清DMEM (不含抗生素) 稀釋細胞，使其密度達到2. 5 X IO5個細胞/mL，在6孔細胞板上每孔接種2. 5mL,于37°C、含 C025v%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在滅菌的1. 5mL的離心管中先加入500μ 37°C預熱的OPTI-MEM 無血清培養(yǎng)基，然后加入l.opg的重組質粒pMVAXl°-pIFN-a，輕輕混勻；在另一個滅菌的1. 5mL的離心管中先加入500μ 37°C預熱的OPTI-MEM無血清培養(yǎng)基，然后加入2. 5μ Lipofectamine 2000轉染試劑，輕輕混勻，在室溫放置5min ；然后將兩個1. 5mL的離心管中的液體混勻在一起，室溫放置20min ；從(X)2培養(yǎng)箱中取出細胞板，棄去上清，把液體混合物輕輕加入到細胞面上，然后立即把細胞板放入CO2培養(yǎng)箱中；溫育他后，吸掉上清，輕輕加入2. OmL 37°C預熱的10%的胎牛血清DMEM，放入(X)2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)Mh，然后反復凍融細胞轉染物2次，12000rpm離心5min，得凍融裂解上清，待檢。對照組1 將實驗組的pMVAXl°-pIFN- α替換為空載體質粒pMVAXl°，其余方法同實驗組一致，作為對照。對照組2 將實驗組的pMVAXl°-pIFN- α替換為pVAXl°-pIFN_ α，其余方法同實驗組一致，作為對照。所述pVAXl°-pIFN-a為真核質粒載體pVAXl°中只插入pIFN_a基因，而不插入 Rabbit β -Globin Intron II 基因。3. 2重組質粒pMVAXl°-pIFN- α表達的pIFN- α抗水泡性口炎病毒VSV活性檢測向生長于96孔板上的Marc-145細胞單層分別加入上述實驗組、對照組1和對照組2
得到的倍比維持液稀釋的凍融裂解上清，每個稀釋度4個孔，于37°C作用Mh，吸去上清，每孔接種IOOTCID5ci的VSV，于37°C、含0)25ν%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對_3他觀察各孔細胞病變， 以能抑制50%細胞病變的樣品的最高稀釋度定義為IFN的1個活性單位(1U)。經檢測，實驗組1. 0μδ的重組質粒pMVAXl°-pIFN- α轉染ΗΕΚ493Α細胞后的裂解上清中，IFN的活性單位高達2 X 107_ °U/0. ImL ；而對照組1空載體質粒pMVAX 1°轉染ΗΕΚ493Α細胞后的裂解上清無抗VSV活性；對照組2載體質粒pVAXl°-pIFN_ α轉染
6HEK493A細胞后的裂解上清中，IFN的活性單位只有l(wèi)X106_°U/0. lmL。因此，重組質粒
pMVAXl°-pIFN- α 表達的 pIFN-α 活性相比 pVAXl°-pIFN_ α 提高了 20 倍。 3. 3重組質粒pMVAXl°-pIFN- α表達的pIFN- α抗高致病性PRRSV活性檢測
向生長于96孔板上的Marc-145細胞單層分別分組加入上述實驗組、對照組1和對照組2得到的倍比維持液稀釋的凍融裂解上清，每個稀釋度4個孔，于37°C作用Mh，吸去上清，每孔接種IOOTCID5ci的高致病性PRRSV，于37°C含C025v%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后，觀察細胞病變情況，對照組1空載體PMVAXf細胞均產生明顯的細胞病變；對照組 2 pVAXl°-pIFN-a在稀釋度為1 104_°以下，而pMVAXl°-pIFN_ α實驗組在稀釋度為1: 2X105_°以下時(稀釋度1: 2X105_°即為100U)，均無細胞病變。說明本發(fā)明重組質粒 pMVAXl°-pIFN- α表達的pIFN_a具有很強的抗高致病性PRRSV的作用。pIFN_a的量為 100U (稀釋度1: 2X105_°即為100U)以上時，對IOOTCID5q的高致病性PRRSV具有明顯的抑制效果，可以應用于制備治療高致病性PRRSV的藥物中。
權利要求
1.一種高效表達和高抗病毒活性的豬α干擾素基因，其核苷酸序列如序列表中序列2 所示。
2.—種權利要求1所述序列2的基因通過分子生物學技術克隆至真核表達載體獲得的重組質粒。
3.—種權利要求1所述的豬α干擾素基因的合成方法，其特征是包括以下步驟 3. 1將真核質粒pVAXl°改造為pMVAXl° 由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882，在上游引入AiI酶切位點和pCMV即刻早期啟動子的一段序列，在下游引入T7啟動子序列和feoRI酶切位點，人工拼接后的核苷酸序列如序列表中序列1所示，將此段基因序列通過Ai酶切位點插入pVAXl°載體中，轉化感受態(tài)細菌，提取質粒經篩選得到SstV ^oRI雙酶切陽性克隆，命名為pMVAXl° ；所述 pCMV 即刻早期啟動子的一段序列為5，-GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCA TCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3’， 所述 T7 啟動子序列為5，-AATACGACTCACTATAGGG-3，； 3. 2構建表達pIFN-α的重組真核質粒pMVAXl°-pIFN_ a 3. 2. 1設計一對擴增pIFN-a成熟蛋白的基因序列的特異性引物，引物序列如下 pIFN-a -Fwd :5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGCTGCGACCTGCCTCAGA-3，， pIFN-a -Rev :5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATCACTCCTTCTTCCTGAGT-3’， 在上游引物pIFN-a -Fwd的5’端引入限制性內切酶位點和Kozak序列，在下游引物pIFN-a -Rev的5’端引入損ol限制性內切酶位點；3. 2. 2從豬的脾或血淋巴細胞提取RNA，經反轉錄后得到cDNA，采用RT-PCR技術擴增出 pIFN-a的成熟蛋白基因的PCR產物；3.2. 3用feoRI/IAoI雙酶切pMVAXl°，膠回收得包含序列1的載體基因片段1，pIFN-a 的成熟蛋白基因的PCR產物經feoRI/ZAoI雙酶切并膠回收得到編碼pIFN-a成熟蛋白的基因片段2，將載體基因片段1和基因片段2連接，轉化感受態(tài)細菌，培養(yǎng)，挑取菌落于卡那霉素抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質粒，進行^01 1/損01雙酶切鑒定，篩選出陽性克隆，得 pMVAXl°-pIFN- α，真核質粒pVAXl°中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。
4.根據權利要求3所述的合成方法，其特征在于步驟3.2. 2中PCR反應體系為25μ 中，含 cDNA lPL，Mg2+ 1. 5mmol/L,dNTP 200Mmol/L, IOXLA PCR Buffer 2. 5μ ,pIFNa -Fwd 和 pIFNa-Rev 濃度均為 400nmol/L，TaKaRa LA Taq 2U ；反應條件為預變性 95°C 5min, 然后進行；35個循環(huán)，循環(huán)條件為95°C 45s, 62°C 45s, 72°C lmin ；然后72°C延伸lOmin，取出產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。
5.根據權利要求3所述的合成方法，其特征在于步驟3.2. 2中RNA的提取步驟如下 無菌采集豬的脾臟或外周血，用淋巴細胞分離液分離脾或者血液淋巴細胞，用10%胎牛血清的1640液在37°C含(X)2 5v%的環(huán)境中培養(yǎng)lh，然后加入50(^g/mL的植物血凝素PHA刺激12h，用TRIzoI試劑提取總RNA。
6.一種權利要求1所述的豬α干擾素基因的表達蛋白在制備治療豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因表達領域。高效表達和高抗病毒活性的豬α干擾素基因核苷酸序列見序列2。序列2的基因克隆至真核表達載體獲得的重組質粒。豬α干擾素基因合成方法將Rabbitβ-GlobinIntronII、pCMV即刻早期啟動子和T7啟動子插入pVAX1 ，得到pMVAX1 ；將pIFN-α的成熟蛋白基因插入pMVAX1 ，得到pMVAX1 -pIFN-α。豬α干擾素基因表達蛋白應用在制備治療豬繁殖與呼吸綜合征藥物中。突破了通過pVAX1 載體表達pIFN-α時表達量低和活性差的局限性，活性單位達2×107.0U/0.1mL，能夠明顯抑制高致病性PRRSV增殖，減少豬場經濟損失。
文檔編號A61P31/14GK102212527SQ20111008751
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月8日 優(yōu)先權日2011年4月8日
發(fā)明者吳家強, 張秀美, 杜以軍, 王金寶, 齊靜 申請人:山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所