專利名稱：一種活菌疫苗的高效非注射型傳遞方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗學領(lǐng)域，具體的說是一種活菌疫苗的高效非注射型傳遞方法。
背景技術(shù)：
病害是制約我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要瓶頸之一。水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治可以從多方面著手，其中疫苗免疫是當今國際上普遍認可的最為有效的魚類病害防治手段之一。疫苗的傳遞(即疫苗導入動物體)方法可簡單分為幾類，即注射型、浸泡型和口服型。注射方法傳遞疫苗的優(yōu)點是免疫效果好，但其缺點是價格昂貴，難以大規(guī)模應用。浸泡和口服方法傳遞疫苗的優(yōu)點是價格低廉，應用簡單，可以廣泛應用，但其缺點是疫苗在口服和浸泡過程中易于遭到破壞，從而造成疫苗的免疫效應較差。因此，新型高效的非注射型疫苗傳遞方法亟待研發(fā)。一些學者嘗試將口服疫苗包埋于保護性材料，制備成微球膠囊，以此延緩疫苗在胃腸道的降解。然而，目前已報道的微球膠囊傳遞的口服疫苗的免疫效應仍遠低于常規(guī)注射法傳遞的疫苗。因此，如何改善和提高疫苗的口服/浸泡傳遞效率仍是尚待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種活菌疫苗的高效非注射型傳遞方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種活菌疫苗的高效非注射型傳遞方法傳遞方法是將疫苗作為口服型和浸泡型，而后將口服與浸泡疊加法傳遞。所述口服與浸泡疊加法傳遞為首先采用海藻酸鈉作為包衣制得海藻酸鈉微球口服型疫苗，其次采用海水稀釋制得浸泡型疫苗，最后將兩種類型的疫苗依次作用繼而實現(xiàn)傳遞。所述口服與浸泡疊加法傳遞為1)制備海藻酸鈉微球口服型疫苗將疫苗菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl為 0. 8-1，在將其懸浮于普通海水中至終濃度為IxlO9-L 5X109cfu/ml的懸浮液，而后用海藻酸鈉、懸浮液、石蠟、乳化劑和氯化鈣按5 3 200 1 5比例混合，即海藻酸鈉微球口服型疫苗；2)浸泡型疫苗將疫苗菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_為0. 8_1，并用普通海水中懸浮至終濃度為IxlO8-L 5xl08cfu/ml,即浸泡型疫苗；3)疫苗的免疫傳遞將步驟1)所得海藻酸鈉微球口服型疫苗與步驟2)的浸泡型疫苗依次作用繼而實現(xiàn)傳遞。所述步驟3)中海藻酸鈉微球口服型疫苗可與飼料混合。所述疫苗菌株為遲緩愛德華氏菌疫苗菌株15947。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.應用簡單。本發(fā)明的疫苗傳遞方法簡單易行，只需口服和浸泡。2.價格低廉。本發(fā)明的疫苗傳遞不需要注射，因而大大地降低了疫苗的應用成本。
3.高保護率。本發(fā)明的疫苗傳遞方法具有與注射法幾乎相同的高效性。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。實施例1 疫苗的常規(guī)單一注射法傳遞步驟1)疫苗的免疫注射。在LB培養(yǎng)基中于28°C培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌疫苗菌株 15947 (購于美國ATCC公司)至OD6tltl為0. 8-1，然后離心(5000g, 4°C ) IOmin0收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為lxl08cfu/ml，即為15947懸浮液。將50條牙鲆隨機分為2 (每組25條)，分別命名為A和B。將A和B組魚分別腹腔注射15947懸浮液或PBS (對照組)， 每條魚的注射量為IOOul。所述LB組成成分按重量百分比計1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 %氯化鈉， 97. 5%蒸餾水；所述PBS組成成分按重量百分比計0. 8% NaCl,0. 02% KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO4,98. 798%蒸溜水。步驟2)疫苗的免疫保護效應檢測。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌TXl (保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 2330) 至0D_為0.7，然后離心(5000g，4°C，10min)。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為 lxl06cfU/ml，即為遲緩愛德華氏菌懸液。在上述步驟1)免疫注射后的第30天，用遲緩愛德華氏菌懸液腹腔注射A和B組魚，每條魚的注射量為lOOul。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目A組，1條；B組，16條。禾Ij 用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS)RPS = 100x(l-免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)由此得出疫苗的免疫保護效率為93. 8%。實施例2疫苗的口服傳遞步驟1)疫苗海藻酸鈉微球飼料和對照海藻酸鈉微球飼料的制備。在LB培養(yǎng)基中于28°C培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌疫苗菌株15947至0D_為0. 8-1,然后離心(5000g， 4°C ) IOmin0收集菌體，將其懸浮于普通海水中至終濃度為lxl09cfu/ml，即為15947懸浮液。將50ml海藻酸鈉(3% )與30ml 15947懸浮液或PBS(對照)混合，隨后加入2000ml 石蠟、IOml S-80乳化劑(皆購于美國Sigma公司)以及50ml氯化鈣(0. 15M)(購于上海Sangon公司)；將含有15947和PBS對照的混合液分別離心(1000g，IOmin)，收集沉淀；將含有15947和PBS的沉淀分別與IOOOg魚飼料(購于山東升索漁用飼料研究中心)混合，用F(II)-26.雙螺桿擠條制粒機(華南理工大學，廣州).加工制成顆粒飼料 (1. 5mmX2. 0mm)，即為疫苗海藻酸鈉微球飼料和對照海藻酸鈉微球飼料。步驟2)疫苗的免疫傳遞。將50條牙鲆隨機分為2 (每組25條)，分別命名為C (樣品組)和D (對照組)。將C和D組魚分別喂食上述步驟1)的疫苗海藻酸鈉微球飼料和對照海藻酸鈉微球飼料，持續(xù)3天。步驟3)疫苗的免疫保護效應檢測。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌TXl至0D_為0.7，然后離心(5000g，4°C，10min)。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為 5xl08cfU/ml，即為遲緩愛德華氏菌懸液。在上述步驟2)免疫后的第30天，將C和D組魚在遲緩愛德華氏菌懸液中浸泡6h，隨后將兩組魚置入正常海水中養(yǎng)殖。在以后的20天中， 每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目C組，9條；D組，23 條，故疫苗的相對免疫保護效率為60. 9% (按照實施例1步驟2)RPS公式計算)。實施例3 疫苗的浸泡傳遞步驟1)疫苗浸泡液的制備。在LB培養(yǎng)基中于28°C培養(yǎng)疫苗菌株15947至0D_ 為0.8-1，然后離心(5000g，4°C )10min。收集菌體，將其懸浮于普通海水中至終濃度為 lxl08cfu/ml,即為疫苗浸泡液。 步驟2)疫苗的免疫傳遞。將50條牙鲆隨機分為2 (每組25條)，分別命名為E (樣品組)和F(對照組)。將E組魚在上述步驟1)的疫苗浸泡液中浸泡1小時，將F組魚在普通海水中浸泡1小時。步驟3)疫苗的免疫保護效應檢測。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌TXl 至0D_為0.7，然后離心(5000g，4°C，10min)。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為 5xl08cfU/ml，即為遲緩愛德華氏菌懸液。在上述步驟2)浸泡免疫后的第30天，將E和F組魚在遲緩愛德華氏菌懸液中浸泡6h，隨后將兩組魚置入正常海水中養(yǎng)殖。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目E組，13條；F 組，22條，故疫苗的相對免疫保護效率為40. 9% (按照實施例1步驟2) RPS公式計算)。實施例4疫苗的口服與浸泡疊加法傳遞步驟1)疫苗海藻酸鈉微球飼料和對照海藻酸鈉微球飼料的制備。同上述實施例 2步驟1)。步驟2)疫苗浸泡液的制備。同上述實施例3步驟1)。步驟3)疫苗的免疫傳遞。將50條牙鲆隨機分為2 (每組25條)，分別命名為G (樣品組)和H(對照組)。將G和H組魚分別喂食上述步驟1)的疫苗海藻酸鈉微球飼料和對照海藻酸鈉微球飼料，3天后將G組魚在上述實施例2步驟2)的疫苗浸泡液中浸泡1小時， 將H組魚在普通海水中浸泡1小時。步驟4)疫苗的免疫保護效應檢測。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌TXl 至0D_為0.7，然后離心(5000g，4°C，10min)。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為 5xl08cfU/ml，即為遲緩愛德華氏菌懸液。在上述步驟3)浸泡免疫后的第30天，將C和D組魚在遲緩愛德華氏菌懸液中浸泡6h，隨后將兩組魚置入正常海水中養(yǎng)殖。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目G組，2條；H 組，23條，故疫苗的相對免疫保護效率為91. 3% (按照實施例1步驟2) RPS公式計算)。因此，疫苗通過口服與浸泡疊加法傳遞時具有明顯高于單獨口服或浸泡傳遞的保護效應，可以達到與常規(guī)注射法傳遞相近的免疫保護效應。上述實施例說明本發(fā)明的口服與浸泡疊加法傳遞活菌疫苗方法是一種較佳的疫苗的實施方式，本發(fā)明的疫苗傳遞方法簡單易行，只需口服和浸泡，大大地降低了疫苗的應用成本。同時疫苗傳遞方法具有與注射法幾乎相同的高效性。
本發(fā)明的實施方 式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種活菌疫苗的高效非注射型傳遞方法，其特征在于傳遞方法是將疫苗作為口服型和浸泡型，而后將口服與浸泡疊加法傳遞。
2.按權(quán)利要求1所述的活菌疫苗的高效非注射型傳遞方法，其特征在于所述口服與浸泡疊加法傳遞為首先采用海藻酸鈉作為包衣制得海藻酸鈉微球口服型疫苗，其次采用海水稀釋制得浸泡型疫苗，最后將兩種類型的疫苗依次作用繼而實現(xiàn)傳遞。
3.按權(quán)利要求2所述的活菌疫苗的高效非注射型傳遞方法，其特征在于所述口服與浸泡疊加法傳遞為1)制備海藻酸鈉微球口服型疫苗將疫苗菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_為0.8-1，在將其懸浮于普通海水中至終濃度為IxlO9-L 5X109cfu/ml的懸浮液，而后用海藻酸鈉、懸浮液、石蠟、乳化劑和氯化鈣按5 3 200 1 5比例混合，即海藻酸鈉微球口服型疫苗；2)浸泡型疫苗將疫苗菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD_為0.8-1，并用普通海水中懸浮至終濃度為IxlO8-L 5xl08cfu/ml,即浸泡型疫苗；3)疫苗的免疫傳遞將步驟1)所得海藻酸鈉微球口服型疫苗與步驟2)的浸泡型疫苗依次作用繼而實現(xiàn)傳遞。
4.按權(quán)利要求3所述的活菌疫苗的高效非注射型傳遞方法，其特征在于所述步驟3) 中海藻酸鈉微球口服型疫苗可與飼料混合。
5.按權(quán)利要求3所述的活菌疫苗的高效非注射型傳遞方法，其特征在于所述疫苗菌株為遲緩愛德華氏菌疫苗菌株15947。
全文摘要
本發(fā)明涉及疫苗學領(lǐng)域，具體的說是一種活菌疫苗的高效非注射型傳遞方法。傳遞方法是將疫苗作為口服型和浸泡型，而后將口服與浸泡疊加法傳遞。本發(fā)明所得疫苗傳遞方法避免了常規(guī)注射法的局限，簡單易行，造價相對低廉，應用范圍不受限制，并且具有與注射法幾乎相同的高效免疫效應。
文檔編號A61K47/36GK102178942SQ20111009319
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者孫黎, 程爽, 胡永華 申請人:中國科學院海洋研究所