專利名稱：一種重組的hsv擴(kuò)增子載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種重組的HSV擴(kuò)增子載體的構(gòu)建及其用途。
背景技術(shù)：
單純皰疫病毒(Herpes simplex virus，HSV)是一禾中屬于皰疫病毒科a病毒亞科的DNA病毒，分為HSV-I和HSV-2兩個(gè)血清型。單純皰疹病毒(HSV-1)的基因結(jié)構(gòu)為1521Λ 的雙鏈線性DNA，形成分別為長(zhǎng)片段UL和短片段US相連的2個(gè)片段。HSV基因組含有89 個(gè)分別為立早期(IE)，早期(E)和晚期(L)順序表達(dá)的編碼基因，3個(gè)與DNA復(fù)制有關(guān)的順式作用元件(1個(gè)oriL和2個(gè)oriS)，以及與病毒包裝有關(guān)的包裝信號(hào)(pac)序列。在皰疹病毒基因組的外面，依次包被有3層結(jié)構(gòu)，分別為呈20面體結(jié)構(gòu)的核衣殼(capsid)，由蛋白構(gòu)成的間層蛋白(tegument)以及含糖蛋白的外囊膜(李琦涵，姜莉.人類皰疹病毒的病原生物學(xué)，北京，化學(xué)工業(yè)出版社，2009.)。人類是單純皰疹病毒HSV-I和HSV-2傳播的唯一宿主，據(jù)報(bào)道正常人群的感染率高達(dá)60%-95%，其傳播途徑主要通過皮膚粘膜的直接接觸和體液接觸，包括皰疹液，眼淚，鼻涕，唾液，精液和生殖道分泌物等。單純皰疹病毒經(jīng)皮膚和粘膜感染后，可經(jīng)神經(jīng)，血液或直接擴(kuò)散的形式傳播至人體不同的組織細(xì)胞并在人體內(nèi)終生呈現(xiàn)顯性感染-潛伏感染-再激活感染的周期發(fā)作。單純皰疹病毒感染絕大多數(shù)為無癥狀的潛伏感染，但少數(shù)人呈現(xiàn)從皮膚粘膜皰疹，如面部口唇皰疹，到不同器官不同嚴(yán)重程度的皰疹性炎癥，如鼻炎， 鼻竇炎，角膜炎，視網(wǎng)膜炎，迷路炎，急性肝炎，盆腔炎，肺炎，前列腺炎，膀胱尿道炎和附睪精囊腺炎，以及致死率高達(dá)70%的皰疹性腦炎。生殖器皰疹是一種較常見的無徹底治愈方法的性傳播疾病，不僅造成泌尿生殖器系統(tǒng)反復(fù)發(fā)作的炎癥，而且可增加HIV的感染機(jī)率。除上述直接的感染性疾病外，皰疹病毒感染還可造成一些其它疾病或并發(fā)癥的發(fā)生， 例如，HSV-I和HSV-2均能感染血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞膽固醇代謝障礙和局部炎癥，從而導(dǎo)致高血壓，動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成等心腦血管疾病。此外，另有文獻(xiàn)報(bào)道，HSV感染還與老年癡呆的發(fā)生有關(guān)(Letermeur L, Peres K, Fleury H, et al. Seropositivity to herpes simplex virus antibodies and risk of Alzheimer's disease: a population-based cohort study. PLoS One. 2008, 3(11):e3637)?；谏鲜鯤SV病毒的廣泛的不同類型細(xì)胞的感染性，特別是很強(qiáng)的皮膚粘膜上皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的嗜性以及不整合的安全性，HSV病毒被認(rèn)為是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因和基因治療的最理想的載體之一。源于皰疹病毒HSV的載體有3種，分別為條件復(fù)制型載體，復(fù)制缺陷型載體和擴(kuò)增子載體。所謂條件復(fù)制型HSV載體，就是經(jīng)基因改造后，病毒選擇性的在特定的細(xì)胞類型中進(jìn)行復(fù)制，而很少在正常細(xì)胞中復(fù)制，該類載體主要用于溶腫瘤的治療；復(fù)制缺陷型載體，是一種敲除病毒一個(gè)或多個(gè)HSV復(fù)制關(guān)鍵基因(譬如ICP4和ICP27等)的轉(zhuǎn)基因載體，使其在轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞中失去再?gòu)?fù)制的能力以增加載體的安全性，而載體的制備只能
3在提供缺失基因的細(xì)胞系中進(jìn)行；擴(kuò)增子載體是復(fù)制缺陷的和輔助病毒依賴的載體，由于完全缺少病毒基因，不僅具有很大的攜帶外源基因的能力，而且對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性和遺傳安全性的擔(dān)憂，與野生的HSV-I病毒在結(jié)構(gòu)，免疫學(xué)，宿主范圍上相同，被認(rèn)為是最理想的病毒源的轉(zhuǎn)基因研究和基因治療載體之一。HSV-I擴(kuò)增子載體自從1982年Spaete和Frenkel首先報(bào)告HSV-1擴(kuò)增子載體以來至今，均是以細(xì)菌的質(zhì)粒為骨架，克隆入HSV-I病毒的復(fù)制起始序列ori，病毒的包裝信號(hào)Pac所構(gòu)建而成的，即包括細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制序列ColE origin，細(xì)菌生長(zhǎng)的抗性基因，HSV-I病毒的復(fù)制起始點(diǎn)ori，病毒的包裝信號(hào)pac，以及轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒5個(gè)部分 (Spaete RRj Frenkel N. The herpes simplex virus ampIicon: a new eucaryotic defective-virus cloningamplifying vector. Cell 1982; 30:295 - 304.)。由于 HSV-I 擴(kuò)增子載體完全不含HSV病毒的基因，因此當(dāng)轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞后，需要提供病毒復(fù)制包裝所必須的病毒基因才能進(jìn)行自我復(fù)制，HSV-I擴(kuò)增子質(zhì)粒像HSV病毒首尾相連的基因組一樣進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，然后利用病毒表達(dá)的包裝蛋白以病毒基因組DNA150k左右的長(zhǎng)度將復(fù)制的DNA切割并包裝成HSV假病毒顆粒?！皵U(kuò)增子(Amplicon)” 一詞表明質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增并相連形成多聯(lián)體的形式取代病毒基因組，并被包裝成HSV假病毒顆粒。HSV-I擴(kuò)增子載體的制備主要有輔助病毒感染法和HSV-I基因組轉(zhuǎn)染法兩種輔助病毒感染法是用擴(kuò)增子質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，然后再感染HSV-I輔助病毒，該方法可產(chǎn)生高滴度的擴(kuò)增子載體，但同時(shí)也有大量輔助病毒的污染，對(duì)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，因此需要對(duì)包裝系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，而此后的很多研究正是集中在這方面，譬如利用敲掉 ICP4和ICP27的復(fù)制缺陷型HSV病毒為輔助病毒，以及點(diǎn)特異重組敲除‘a(chǎn)’包裝序列的復(fù)制缺陷型HSV病毒為輔助病毒。到目前為止，最有效的改進(jìn)就是輔助病毒‘a(chǎn)’包裝序列的 Cre-LoxP重組敲除技術(shù)，即利用重組技術(shù)將輔助病毒的包裝信號(hào)Pac兩端加上特異的重組 IoxP序列，并將此病毒感染至表達(dá)Cre重組酶的細(xì)胞系，以此作為輔助病毒，可以制備出高滴度的HSV-I擴(kuò)增子假病毒，而且可使輔助病毒的污染降低到0. 05-0. 5%的低水平。盡管這項(xiàng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)HSV擴(kuò)增子載體，但由于HSV皰疹病毒正常人群的高感染率， 60-90%的人群可存在單純皰疹病毒HSV的潛伏感染，污染的輔助病毒會(huì)激活內(nèi)源的潛伏病毒或存在發(fā)生重組的風(fēng)險(xiǎn)，因此限制了 HSV擴(kuò)增子載體的臨床應(yīng)用。HSV-I基因組轉(zhuǎn)染法 基因組轉(zhuǎn)染法就是將不含pac信號(hào)的HSV-I基因組片段或重組超大的HSV基因組轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，作為提供的復(fù)制或包裝系統(tǒng)所產(chǎn)生HSV擴(kuò)增子的辦法，例如粘粒轉(zhuǎn)染法和超大的細(xì)菌人工染色體(BAC) HSV基因組轉(zhuǎn)染法。粘粒轉(zhuǎn)染法是將刪除pac信號(hào)的相互重疊的 HSV-I基因組片段分別克隆入多個(gè)(5個(gè))粘粒中，經(jīng)轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞后重組成不含pac信號(hào)的HSV-I基因組，作為提供HSV擴(kuò)增子載體的復(fù)制和包裝系統(tǒng)，從而生產(chǎn)出不含輔助病毒的HSV擴(kuò)增子載體。細(xì)菌人工染色體(BAC) -HSV基因組轉(zhuǎn)染法是利用細(xì)菌人工染色體 (BAC)攜帶敲除包裝信號(hào)和ICP27編碼序列的HSV-I基因組(重組充填至大于178k)的DNA 與擴(kuò)增子質(zhì)粒共感染宿主細(xì)胞，可產(chǎn)生無輔助病毒污染的HSV-I擴(kuò)增子。由于BAC增大至 178kb以上超過了 HSV病毒的包裝能力，可以完全排除BAC和擴(kuò)增子載體發(fā)生重組獲得包裝信號(hào)而包裝入病毒顆粒的可能性。另外，重組輔助病毒因?yàn)槠淙笔CP27基因是復(fù)制缺陷的，HSV擴(kuò)增子的制備基本上實(shí)現(xiàn)了無輔助病毒污染?；蚪M轉(zhuǎn)染法雖可產(chǎn)生出極少或無輔助病毒污染的HSV擴(kuò)增子，但由于其擴(kuò)增子的產(chǎn)量太低，不能夠進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，因此很難進(jìn)入臨床的實(shí)際應(yīng)用。HSV-I擴(kuò)增子作為基因治療載體已進(jìn)行了廣泛研究，包括利用 HSV-I擴(kuò)增子表達(dá)SiRNA用于不同疾病的轉(zhuǎn)基因研究已顯示出其廣闊的應(yīng)用前景，然而，到目前為止，尚無利用HSV-I擴(kuò)增子載體表達(dá)抑制分子用于抗HSV病毒自身的研究報(bào)道。HSV 擴(kuò)增子已被廣泛用作轉(zhuǎn)基因研究和基因治療研究，主要是用于抗腫瘤的基因治療(表達(dá)抑制血管生成的的可溶性VEGF受體、TK自殺基因、EGTK等)，神經(jīng)保護(hù)(例如表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子、抗凋亡蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)受體或者抗氧化酸)，神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療(如帕金森病、表達(dá)dopamine、⑶NF、BDNF、腦缺血、表達(dá)抗凋亡因子Bcl_2)，以及疫苗的研發(fā)(包括腫瘤疫苗、HIV疫苗和Alzheimer疫苗等)。傳統(tǒng)的質(zhì)粒型HSV擴(kuò)增子載體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)是短暫的，關(guān)鍵原因是擴(kuò)增子質(zhì)粒的細(xì)菌基因序列可造成轉(zhuǎn)基因的快速沉默以及宿主細(xì)胞誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的沉默。傳統(tǒng)擴(kuò)增子載體在感染宿主細(xì)胞后，其攜帶的細(xì)菌元件可形成一種不活躍的染色質(zhì)狀態(tài)，進(jìn)而影響目的基因的表達(dá)(Suzuki Μ, Kasai K, Saeki Y. , Plasmid DNA Sequences Present in Conventional Herpes SimplexVirus Amplicon Vectors Cause Rapid Transgene Silencing by Forming Inactive Chromatin,J Virol. 2006 Apr；80 (7):3293-300.)。為了去除細(xì)菌基因元件，Chen及其同事通過鏈霉菌噬菌體Φ031整合酶介導(dǎo)的定點(diǎn)重組系統(tǒng)在原核細(xì)胞內(nèi)經(jīng)重組產(chǎn)生一種不含細(xì)菌元件的小環(huán)狀擴(kuò)增子載體，其操作過程如下在氨芐抗性的PBR322質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，構(gòu)建攜帶HSV-I oriS、pac、GFP報(bào)告基因，attB, attP和 Φ〔31整合酶的擴(kuò)增子質(zhì)粒載體pBAD(tC31RHB。鏈霉菌噬菌體Φ C31整合酶為溫度敏感性整合酶，該MC擴(kuò)增子制備系統(tǒng)中Φ031整合酶由araBAD啟動(dòng)子啟動(dòng)，在32° C，L_阿拉伯糖的誘導(dǎo)下可以表達(dá)6C31整合酶，Φ031整合酶可以介導(dǎo)attB，attP位點(diǎn)的特異重組，經(jīng) (j5C31/attB-attP重組后大腸桿菌內(nèi)會(huì)有3種質(zhì)粒即沒有發(fā)生重組的pBAD(tC31RHB質(zhì)粒， 經(jīng)重組產(chǎn)生的MC擴(kuò)增子載體，和不含HSV-I oriS、pac和GFP報(bào)告基因元件的pBAD Φ C31 質(zhì)粒，通過進(jìn)一步的限制性酶切消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可以去除pBAD(^C31RHB和 PBAD Φ C31消化后的線性片段，膠回收純化出MC DNA,再轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞在HSV-I病毒的輔助下包裝出小環(huán) HSV 擴(kuò)增子載體(Chen ZY, He CY, Ehrhardt A, et al. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. [J], Mol Ther. 2003;8 (3) :495-500· )。Suzuki 等人 2006 年的研究證明，利用無細(xì)菌基因的小環(huán)擴(kuò)增子表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水平高于傳統(tǒng)的HSV擴(kuò)增子基因表達(dá)水平20倍。利用輔助病毒支持長(zhǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，可能由于HSV病毒ICPO基因的表達(dá)， 抑制了宿主細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)基因的沉默作用。此外，不同啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間也有影響，強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的抑制作用，因此可用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或者細(xì)胞特異的啟動(dòng)子。研究表明， IE4/5，CMV啟動(dòng)子對(duì)基因的啟動(dòng)效應(yīng)為1-2周，而神經(jīng)特異的啟動(dòng)子為2_14個(gè)月。HSV擴(kuò)增子載體在制備技術(shù)方面存在著如何大規(guī)模的制備高滴度又無輔助病毒污染的難題，即利用輔助病毒感染法可以規(guī)模的生產(chǎn)出高滴度HSV擴(kuò)增子載體但存在輔助病毒污染，而HSV病毒基因組轉(zhuǎn)染法可以制備出無輔助病毒污染的HSV擴(kuò)增子載體，但不能實(shí)現(xiàn)規(guī)模化和高滴度的生產(chǎn)。因此，這兩種制備技術(shù)均限制了 HSV擴(kuò)增子載體的臨床應(yīng)用。綜上所述，目前的HSV擴(kuò)增子載體主要存在如下缺陷和制備技術(shù)難題
1、傳統(tǒng)的質(zhì)粒型HSV擴(kuò)增子載體因含有細(xì)菌質(zhì)粒元件(包括復(fù)制序列COlE origin和抗性基因，如氨芐抗性基因等)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的效率和持續(xù)時(shí)間；2、MC小環(huán)擴(kuò)增子(minicircle ampIicon)載體的構(gòu)建需要利用鏈霉菌噬菌體Φ〇31 整合酶介導(dǎo)的定點(diǎn)重組系統(tǒng)和L-阿拉伯糖的誘導(dǎo)在原核細(xì)胞內(nèi)經(jīng)重組產(chǎn)生。制備過程中存在輔助質(zhì)粒的污染，制備的MC擴(kuò)增子尚需進(jìn)一步的純化去除混雜的pBAD c^C31RHB和 PBAD Φ C31質(zhì)粒，該制備過程操作繁瑣，經(jīng)該制備過程產(chǎn)生的小環(huán)擴(kuò)增子DNA濃度較低，代價(jià)昂貴，不能規(guī)?；纳a(chǎn)，同時(shí)，生產(chǎn)出來的小環(huán)擴(kuò)增子DNA還需借助非病毒類載體再轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞才可包裝成擴(kuò)增子病毒載體，因此不具實(shí)際應(yīng)用價(jià)值；
3、無論是傳統(tǒng)的質(zhì)粒型HSV擴(kuò)增子載體還是MC小環(huán)HSV擴(kuò)增子載體在制備技術(shù)方面均不能實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)無輔助病毒污染的用于體內(nèi)抗HSV病毒感染及相關(guān)疾病治療的HSV 擴(kuò)增子基因治療載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組的不含細(xì)菌復(fù)制序列(colE origin)和抗性基因的新型HSV擴(kuò)增子載體的構(gòu)建和制備方法，以及該重組的HSV擴(kuò)增子載體在轉(zhuǎn)基因研究、制備腫瘤基因治療和抗HSV感染及相關(guān)疾病制劑中的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供一種利用復(fù)制缺陷型腺病毒Cre-IoxP重組系統(tǒng)重組的HSV擴(kuò)增子載體的構(gòu)建和制備方法。在一個(gè)優(yōu)選例中，攜帶Cre重組酶表達(dá)盒的復(fù)制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建是將操作性相連的元件SV40啟動(dòng)子-Cre重組酶編碼序列-PolyA元件重組入AD5復(fù)制缺陷型腺病毒載體構(gòu)建而成。在另一個(gè)優(yōu)選例中，攜帶操作性相連元件“l(fā)oxP-HSV復(fù)制元件oriS-包裝信號(hào) pac-轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒-ΙοχΡ”的復(fù)制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建是將2個(gè)IoxP序列及其位于2 個(gè)IoxP序列之間的單純皰疹病毒HSV-I的復(fù)制元件oriS，單純皰疹病毒HSV-I包裝信號(hào) pac以及轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒重組入AD5復(fù)制缺陷型腺病毒載體構(gòu)建而成。在另一個(gè)優(yōu)選例中，操作性相連元件“ IoxP-HSV復(fù)制元件oriS-包裝信號(hào)pac-轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒-ΙοχΡ”中的2個(gè)IoxP序列是同向的。IoxP (locus of X-over Pl)序歹丨J :IoxP序列來源于Pl噬菌體，是由兩個(gè)13bp反向重復(fù)序列(Cre酶的結(jié)合域)和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列確定了 IoxP 的方向，見序列表SEQ ID NO: 1所示。在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)制元件oriS的序列如SEQ ID NO: 2所示；或所述的復(fù)制元件oriS序列通過如下方法獲得MluI酶切BAC-HSV-1HF獲得含末端重復(fù)區(qū)的BAC-TR， 然后NotI酶切BAC-TR獲得含oriS及其側(cè)翼序列的片段(約3. 5Kb)，再AgeI酶切前述片段后獲得含oriS核心區(qū)及其側(cè)翼序列的片段(約1. 7Kb)，最后經(jīng)NcoI酶切獲得1. 2Kb的含88bp oriS核心區(qū)及其側(cè)翼序列的片段作為復(fù)制元件oriS的序列；
所述的包裝信號(hào)pac的序列如SEQ ID NO: 3所示；或所述的包裝信號(hào)pac通過如下方法獲得=MluI酶酶切BAC-HSV-1HF，獲得含末端重復(fù)區(qū)的BAC-TR，SacI酶切BAC-TR獲得含 HSV-I末端重復(fù)區(qū)“pac”序列的片段(約4Kb) ；HphI酶切前一片段獲得含末端重復(fù)區(qū)“pac” 序列的片段(約1.3Kb) ；BsrBI酶切前一片段后獲得W3-DRl-Uc結(jié)構(gòu)，最后獲得188bp作為包裝信號(hào)pac的序列。在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒選自目的基因表達(dá)盒，報(bào)告基因表達(dá)盒，靶基因的microRNA表達(dá)盒和靶基因的shRNA表達(dá)盒。在另一優(yōu)選例中，所述的報(bào)告基因選自(但不限于)DsRed, LacZ, GFP, EGFP, beta-gal或熒光素酶的編碼基因。除了以上元件，所述的重組的HSV擴(kuò)增子載體中還可包括其它元件，例如選自啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、標(biāo)記基因或翻譯控制元件等。這些元件的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員所清楚的。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的重組的HSV擴(kuò)增子載體具有利用不同血清型單純皰疹病毒HSV-I和HSV-2以及不同基因型的單純皰疹病毒為輔助病毒進(jìn)行復(fù)制和包裝的相同特性，因此可作為抗各種單純皰疹病毒的通用載體。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的重組的HSV擴(kuò)增子載體的體外制備方法，首先利用兩種分別攜帶Cre和操作性相連的元件loxP-HSV oriS-pac-轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒-IoxP的復(fù)制缺陷型腺病毒，通過在共感染細(xì)胞內(nèi)的重組出不含細(xì)菌基因的HSV擴(kuò)增子DNA，而后重組出的HSV擴(kuò)增子DNA在復(fù)制缺陷型HSV輔助病毒的作用下進(jìn)行復(fù)制，包裝成HSV擴(kuò)增子假病毒載體，再經(jīng)過反復(fù)傳代擴(kuò)增，即可制備出大量HSV擴(kuò)增子假病毒載體，該假病毒載體可用于轉(zhuǎn)基因研究和基因治療。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的重組的HSV擴(kuò)增子載體的用途，通過表達(dá)報(bào)告基因直接用于觀察病毒的分布和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率，也可間接反映miRNA的表達(dá)水平或融合蛋白的表達(dá)水平。本發(fā)明的另一方面，提供所述的重組的HSV擴(kuò)增子載體的用途，通過表達(dá)外源的轉(zhuǎn)基因，用于制備不同的基因治療制劑。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的重組的HSV擴(kuò)增子載體的用途，通過腫瘤特異啟動(dòng)子特異表達(dá)復(fù)制缺陷型HSV病毒缺失的關(guān)鍵基因(UL54)編碼的蛋白ICP27，從而使復(fù)制缺陷性HSV-I病毒限定在腫瘤組織特異復(fù)制，以達(dá)到靶向溶腫瘤/抗腫瘤的目的。本發(fā)明的重組的HSV擴(kuò)增子載體的另一方面用途，在于所述的兩種分別攜帶Cre 和操作性相連的元件loxP-HSV oriS-pac-轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒-IoxP的復(fù)制缺陷型腺病毒可直接作為治療制劑用于抑制病毒復(fù)制的基因治療，該制劑的復(fù)制缺陷型腺病毒進(jìn)入細(xì)胞后重組出HSV擴(kuò)增子載體，所重組出HSV擴(kuò)增子載體利用所感染的HSV野生病毒的進(jìn)行再?gòu)?fù)制和包裝出HSV擴(kuò)增子假病毒，對(duì)感染的野生病毒產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制或通過持久地表達(dá)外源抗病毒基因而抑制野生病毒的復(fù)制，因此可用于體內(nèi)抗HSV感染和治療HSV感染相關(guān)疾病。本發(fā)明首次利用復(fù)制缺陷型腺病毒Cre-IoxP系統(tǒng)重組制備出HSV擴(kuò)增子載體，該擴(kuò)增子載體與傳統(tǒng)的以細(xì)菌質(zhì)粒為骨架的HSV擴(kuò)增子載體相比，不含細(xì)菌復(fù)制序列(colE origin)和抗性基因元件，僅含HSV的oriS，pac序列和轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，因此避免了細(xì)菌基因?qū)D(zhuǎn)基因的沉默作用。本發(fā)明在制備重組的HSV-I擴(kuò)增子載體的復(fù)制缺陷型腺病毒制劑時(shí)，既可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，又可完全避免輔助病毒的污染。本發(fā)明重組的HSV擴(kuò)增子載體在真核細(xì)胞內(nèi)利用腺病毒Cre-IoxP重組系統(tǒng)重組產(chǎn)生，避免了小環(huán)mini circle擴(kuò)增子DNA在細(xì)菌中重組，篩選，膠純化以及DNA真核轉(zhuǎn)染的的復(fù)雜程序，在構(gòu)建和制備方面簡(jiǎn)單，高效省時(shí)，節(jié)省成本以及規(guī)模化制備。更重要的是腺病毒已是臨床應(yīng)用的基因藥物載體，因此具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和前景。本發(fā)明首次從單純皰疹病毒HSV-I HF株的TRL區(qū)和TRS區(qū)克隆和鑒定出oriS和pac序列。本發(fā)明所用的病毒株為HSV-I HF,目前，國(guó)際上尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道該病毒株的oriS 和pac序列，我們首次測(cè)序出HSV-I HF的含有88bp oriS核心區(qū)boxI，boxII，boxIII的序列以及比文獻(xiàn)報(bào)道200bp更小188bp的pac序列，并經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)其有利用不同血清型單純皰疹病毒HSV-I和HSV-2以及不同基因型的單純皰疹病毒為輔助病毒進(jìn)行復(fù)制和包裝的通用特性，因此可作為利用體內(nèi)感染的任何單純皰疹病毒再?gòu)?fù)制的抗HSV病毒的通用載體。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、BAC-HSV-I (HF)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖； 圖2、BAC-HSV-I (HF)質(zhì)粒酶切鑒定圖； 圖3、HSV-I (HF)擴(kuò)增子質(zhì)粒構(gòu)建示意圖； 圖4、HSV-I包裝信號(hào)pac測(cè)序圖； 圖5、HSV-I復(fù)制起始點(diǎn)oriS測(cè)序圖； 圖6、HSV-I擴(kuò)增子質(zhì)粒載體酶切鑒定圖； 圖7、腺病毒Adv-IoxP-OPD-IoxP構(gòu)建示意圖； 圖8、HSV-I擴(kuò)增子載體OPD構(gòu)建過程中的酶切鑒定圖； 圖 9、腺病毒 Adv-LoxP-0PD-hTERT-ICP27-LoxP 構(gòu)建示意圖； 圖10、hTERT啟動(dòng)子測(cè)序圖； 圖11、ICP27基因開放性讀碼框測(cè)序圖； 圖12、腺病毒Adv-cre構(gòu)建示意圖； 圖 13、BAC-HSV-I (HF) ICP27-功能鑒定圖； 圖14、重組的HSV-I擴(kuò)增子示意圖； 圖15、重組的HSV-I擴(kuò)增子功能鑒定圖； 圖16、不同病毒株對(duì)重組的HSV-I擴(kuò)增子的包裝； 圖17、重組的HSV-I擴(kuò)增子競(jìng)爭(zhēng)性抑制病毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 圖18、重組的HSV-I擴(kuò)增子載體表達(dá)目的基因的功能鑒定圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。材料
BAC-C223質(zhì)粒、pGEM-T-Cre和pYD_C255質(zhì)粒獲自美國(guó)華盛頓大學(xué)，分子病毒系Dr. Yu實(shí)驗(yàn)室；HSV-I HF株，HSV-1K0S株病毒獲自鄭州大學(xué)一附院神經(jīng)三科實(shí)驗(yàn)室；HSV-I F 株，HSV-2 333株病毒獲自武漢病毒所；質(zhì)粒psilencer2. 0-U6-20購(gòu)自Addgene公司；質(zhì)粒 PDsRed2-Cl購(gòu)自Clontech公司；LR重組酶，復(fù)制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)Ad-Block-Dest，
8脂質(zhì)體2000，DHlOB大腸桿菌購(gòu)自hvitrogen公司；pGEMT購(gòu)自天根生科有限公司；克隆工具酶均購(gòu)自大連寶生物公司；DNA合成和DNA測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志公司完成；質(zhì)粒提取，膠回收，PCR清洗過柱試劑盒均購(gòu)于Axygen公司；無支原體胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培養(yǎng)基，谷氨酰胺，非必需氨基酸購(gòu)自GIBCO公司J93A細(xì)胞及Vero 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命研究院細(xì)胞庫(kù)；SW105重組工程菌由鄭州大學(xué)神經(jīng)內(nèi)三科保藏。材料備注
1、BAC-C223質(zhì)粒(獲贈(zèng)于美國(guó)華盛頓大學(xué)，分子病毒系Dr.撲實(shí)驗(yàn)室，其構(gòu)建方式如下所述)，BAC-C223質(zhì)粒是在pMB0131質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行改建的，pMB0131質(zhì)粒最早報(bào)道于1989年，由0’ Connor等首次用“染色體建造”的方法，是含有大腸桿菌(E coll. ) F因子復(fù)制所需元件的一個(gè)mini F復(fù)制子(0’ Connor Μ, Peifer Μ, Bender W. Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science. 1989 Jun 16; 244 0910) :1307-12.)。美國(guó)華盛頓大學(xué)，分子病毒系的Dr. Yu教授將 1oxP-us28-us29-SV40 Promoter-GFP-loxP-IRES-Puro-poly A 片段加入 pMB0131 質(zhì)粒中， 構(gòu)建成YD_(^9質(zhì)粒(具體的構(gòu)建過程見參考文獻(xiàn)Yu D, Smith GA, Enquist Lff, Shenk Τ. Construction of a self-excisable bacterial artificial chromosome containing the human cytomegalovirus genome and mutagenesis of the diploid TRL/IRL13 gene. J Virol. 2002 Mar; 76 (5) : 2316-28. )。BAC-C223 質(zhì)粒的構(gòu)建是在 YD_(^9 質(zhì)粒的基礎(chǔ)上， 通過酶切的方式去除掉US^-US^片段后構(gòu)建而成的。2、pGEM-T_Cre質(zhì)粒(獲贈(zèng)于美國(guó)華盛頓大學(xué)，分子病毒系Dr. Yu實(shí)驗(yàn)室，其構(gòu)建方式如下所述)，酶切的方式將p760-Cre質(zhì)粒(購(gòu)自GeneBrider)的Cre重組酶克隆至 pGEM-Τ載體(購(gòu)自Promega公司)構(gòu)建而成。3、pYD_C255質(zhì)粒(獲贈(zèng)于美國(guó)華盛頓大學(xué)，分子病毒系Dr. Yu實(shí)驗(yàn)室，其構(gòu)建方式如下所述)，以攜帶feilK表達(dá)盒的PGalK質(zhì)粒(其具體的構(gòu)建方式參考文獻(xiàn)Qian Z, Xuan B, Hong TT, Yu D. The full-length protein encoded by human cytomegalovirus gene ULl17 is required for the proper maturation of viral replication compartments. J Virol. 2008 Apr; 82 (7) :3452-65. Epub 2008 Jan 23.)為骨架載體， 在此基礎(chǔ)上，加以Kanamycin的抗性篩選基因而改造而來(其具體的構(gòu)建方式參考文獻(xiàn) Warming S, Costantino N, Court DL, Jenkins ΝΑ, Copeland NG. . Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 2005 Feb 24;33(4):e36.)。4、SW105菌株是基于DHlOB (Invitrogen)公司的含有缺陷型噬菌體的OT380菌株之基礎(chǔ)上通過同源重組加入由阿拉伯糖操縱元所控制Flpe重組酶后成為EL250菌株， EL250菌株修復(fù)基半乳糖操縱元后成為SW103菌株，SW103敲除feilK基因成為SW105菌株。 這樣，SW105菌株含有exojata，gam三種red重組所需的三種酶的工程菌，同時(shí)可由阿拉伯糖操縱元所控制的Flap重組酶表達(dá)盒(其具體的構(gòu)建方式參考文獻(xiàn)Qian Z, Xuan B, Hong TTj Yu D. The full-length protein encoded by human cytomegalovirus gene ULl17 is required for the proper maturation of viral replication compartments. J Virol. 2008 Apr; 82 (7) :3452-65. Epub 2008 Jan 23。 Warming S, Costantino N, Court DLjJenkins ΝΑ, Copeland NG. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 2005 Feb 24;33 (4):e36)。實(shí)施例1、BAC-HSV-I HF株的構(gòu)建如圖1所示BAC-HSV-I HF株的構(gòu)建模式。以HSV-I HF株的基因組為模板，以引物SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5 擴(kuò)增與 HSV-I的UL43基因同源的上游同源臂，引物兩端分別設(shè)計(jì)的有McI和MluI的酶切接頭；
以引物SEQ ID NO: 6和SEQ ID N0: 7擴(kuò)增與HSV-I的UL47基因序列同源的下游同源臂，引物兩端分別設(shè)計(jì)有NotI和MluI的酶切接頭，酶切連接法將同源臂克隆至BAC質(zhì)粒的SacI，NotI酶切位點(diǎn)中，構(gòu)建成了 BAC-LR arm,用MluI酶將含HSV-I同源臂的BAC 切成線性，將線性BAC-HSV-I同源臂與HSV-I基因組用脂質(zhì)體包埋法轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，經(jīng)真核細(xì)胞內(nèi)同源重組產(chǎn)生含GFP綠色熒光報(bào)告基因的BAC-HSV-I重組病毒，收集含重組型 BAC-HSV-I的Vero細(xì)胞上清液，噬斑純化挑取含GFP的陽性CPE，將收獲的含GFP的病毒再次感染Vero細(xì)胞，待病毒自身環(huán)化時(shí)用Hirt法提取病毒環(huán)形基因組，將所提取的環(huán)形基因組電轉(zhuǎn)化至DHlOB電轉(zhuǎn)感受態(tài)菌，待克隆長(zhǎng)出后提取BAC-HSV-I HF質(zhì)粒，同時(shí)提取HSV-I病毒基因組，MluI酶切鑒定BAC-HSV-I HF質(zhì)粒，同時(shí)MluI酶切HSV-I病毒基因組作為對(duì)照， 理論上將MluI酶切鑒定BAC-HSV-I HF質(zhì)粒應(yīng)較MluI酶切HSV-I病毒基因組多出來一條約IOKb的條帶(BAC-C223的大小約為10Kb)，酶切結(jié)果示MluI酶切鑒定BAC-HSV-I HF質(zhì)粒應(yīng)較MluI酶切HSV-I病毒基因組多出來一條約IOKb的條帶(如圖2)。結(jié)論，含HSV-I HF株基因組的細(xì)菌人工染色體BAC-HSV-I HF質(zhì)粒構(gòu)建成功。實(shí)施例2、HSV-I擴(kuò)增子質(zhì)粒載體的構(gòu)建如圖3所示HSV-I擴(kuò)增子質(zhì)粒載體構(gòu)建模式。l、“pac”序列的獲得
MluI酶酶切BAC-HSV-1HF，獲得含末端重復(fù)區(qū)的BAC-TR，SacI酶切BAC-TR獲得4Kb的含HSV-I末端重復(fù)區(qū)“pac”序列的片段；HphI酶切4Kb的片段后獲得1. 3Kb的含末端重復(fù)區(qū)“pac”序列的片段。另經(jīng)BsrBI酶切1. 3Kb的片段后可獲得188bp的W3-DRl-Uc結(jié)構(gòu)(為最小包裝單位的包裝信號(hào))。EcoRI酶切pGEMT線性T載體(購(gòu)自大連寶生物公司)，Klenow 酶(購(gòu)自大連寶生物公司)補(bǔ)平EcoRI酶切后的pGEMT線性T載體，將188bp的片段以平端化末端加入PGEMT，以T7通用引物進(jìn)行測(cè)序(測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志測(cè)序公司完成)，以T7為引物測(cè)出188bp長(zhǎng)度的片段，測(cè)序結(jié)果見圖4，序列見SEQ ID N0: 3，測(cè)序結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)成功獲得HSV-I的包裝信號(hào)pac。2、oriS序列的獲得
MluI酶切BAC-HSV-1HF獲得含末端重復(fù)區(qū)的BAC-TR，接著NotI酶切BAC-TR獲得3. 5Kb 的含oriS及其側(cè)翼序列的片段，AgeI酶切3. 5Kb的含oriS及其側(cè)翼序列的片段后獲得 1. 7Kb的含oriS核心區(qū)及其側(cè)翼序列的片段，另用NcoI酶切1. 7Kb的片段后獲得1. 2Kb的含oriS核心區(qū)域及其部分側(cè)翼序列的片段，HSV-I復(fù)制起點(diǎn)oriS獲得示意圖如圖6。EcoRI 酶切pGEMT線性T載體(購(gòu)自大連寶生物公司)，Klenow酶(購(gòu)自大連寶生物公司)補(bǔ)平1. 2Kb 的片段和EcoRI酶切后的pGEMT線性T載體，將1. 2Kb的片段以平端化末端加入pGEMT，以 T7通用引物進(jìn)行測(cè)序(測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志測(cè)序公司完成)，以T7為引物測(cè)出409長(zhǎng)度的片段，其序列為SEQ ID N0: 2，測(cè)序結(jié)果表明，該片段含有HSV-I的88bp的復(fù)制起始點(diǎn)oriS
10(圖5)，測(cè)序結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)成功獲得含HSV-I的復(fù)制起始點(diǎn)oriS的片段。3、psi2. 0-mcs 的構(gòu)建
人工合成兩端帶有HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)(MCS)DNA片段見SEQ ID NO: 8，HindIII和EcoRI分別雙酶切MCS和psilencer2. 0-U6-20，將MCS片段定向克隆入 psilencer2. 0-U6-20 的 HindIII, EcoRI 位點(diǎn)即構(gòu)建完成 psi2. 0-mcs 4、psi2. O-mcs-DsRed 的構(gòu)建
MluI，NsiI雙酶切pDsRed2-Cl質(zhì)粒，獲得約1. 5Kb的DsRed紅色熒光表達(dá)盒，XhoI酶切 psi2. 0-mcs作為載體，Klenow酶補(bǔ)平DsRed紅色熒光表達(dá)核和XhoI酶切后的psi2. 0-mcs, 將兩者以平端相連接，轉(zhuǎn)化，HindIII, StuI雙酶切鑒定質(zhì)粒psi2. O-mcs-DsRed的酶切體系，理論上應(yīng)該出現(xiàn)3. 2Kb和1Kb的兩條目的條帶，電泳結(jié)果見圖6-1，可見3. 2Kb和1Kb 的兩條目的條帶，結(jié)果示psi2. O-mcs-DsRed構(gòu)建成功。5、HSV-I擴(kuò)增子質(zhì)粒載體的構(gòu)建
將獲得的188bp片段I^c，克隆入psi2. O-mcs-DsRed (的BglII位點(diǎn)中，從而分別構(gòu)建成 psi2. 0-mcs-DsRed-pac，HindIII，SpeII 雙酶切鑒定質(zhì)粒 psi2. O-mcs-DsRed-pac 的酶切體系，理論上應(yīng)該出現(xiàn)4. 2Kb和200bp的兩條目的條帶，電泳結(jié)果見圖6-2，可見4. 2Kb和 200bp的兩條目的條帶，結(jié)果顯示psi2. O-mcs-DsRed-pac構(gòu)建成功。將含oriS核心區(qū)域的1.2Kb的oriS片段正方向(與野生型HSV-I相同)克隆入 psi2. O-mcs-DsRed-pac 構(gòu)建成擴(kuò)增子載體，命名為 HSV-l-Amplicon-DsRed (HAD), 含oriS、pac、DsRed序列的片段命名為OPD片段。HindIII，BglII雙酶切鑒定質(zhì)粒 HSV-I-Amplicon-DsRed的酶切體系，理論上應(yīng)該出現(xiàn)4. 2Kb和1. 4Kb的兩條目的條帶，電泳結(jié)果見圖6-3，可見4. 2Kb和1.4Kb的兩條目的條帶，結(jié)果示HSV-1-Amplicon-DsRed構(gòu)建成功。實(shí)施例3、重組腺病毒Adv-IoxP-OPD-IoxP及Adv-IoxP-D-IoxP的構(gòu)建以及病毒包裝
如圖7所示Adv-IoxP-OPD-IoxP的構(gòu)建模式。1、pENTR-loxP-LRarm-loxP 載體的構(gòu)建
pENTR-MCS用MlI和BamHI酶切，膠回收2. 6kb的載體pENTR-MCS，將載體補(bǔ)平，去磷； BAC-LRarm中含有同向的兩個(gè)IoxP位點(diǎn)，用PvuI和kal酶切，可以切出兩個(gè)同向的IoxP 以及中間的LR同源臂及GFP報(bào)告基因的片段，將片段補(bǔ)平。將載體和片段連接，轉(zhuǎn)化，鑒定pENTR-loxP-LRarm-loxP載體，用Avail酶切鑒定。理論上應(yīng)該可以得到大小為3. 1Kb， 1. 4Kb，1. 2Kb，440bp，282bp，及 153bp，電泳結(jié)果如圖 8-1A 中箭頭所示，可見 3. 1Kb，1. 4Kb， 1. 2Kb，440bpJ8^p，及 15!3bp 條帶。結(jié)果示 pENTR-loxP-LRarm-loxP 載體構(gòu)建成功。2、pENTR-loxP-OPD-loxP 和 pENTR-loxP-D-loxP 載體構(gòu)建 pENTR-loxP-LRarm-loxP 載體用 Avail 酶切，膠回收 3. Ikb 的載體 pENTR-loxP-loxP，
補(bǔ)平，去磷；HAD質(zhì)粒用BglII和PciI酶切得到3. 4kb片段0PD，含有HSV-I (HF)的 oriS, pac以及DsRed報(bào)告基因元件；PciI, HindIII雙酶切psi2. 0-mcs-DsRed獲得單個(gè)DsRed報(bào)告基因元件，命名為D片段；將OPD片段和D片段補(bǔ)平，連接，轉(zhuǎn)化，分別構(gòu)建成 pENTR-loxP-OPD-loxP 載體和 pENTR-loxP-D-loxP 載體；用 HincII 酶切鑒定 pENTR-loxP-OPD-loxP兩種情況為正確的結(jié)果，一個(gè)方向酶切結(jié)果為得到910bp和5. 61Λ的兩個(gè)條帶，另一個(gè)方向酶切結(jié)果為得到3. 27kb和3. 2kb電泳結(jié)果如圖8-1B中箭頭所示，可見兩個(gè)方向均有正確的克隆，今用酶切結(jié)果為得到910bp和5. 6kb的兩個(gè)條帶的克隆進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果示pENTR-loxP-OPD-loxP載體構(gòu)建成功。EagI酶切pENTR-loxP-D-loxP載體，理論上可見一個(gè)方向約1. 5Kb和4Kb的兩條目的條帶，另一個(gè)方向約為2. 1Kb和3. 4Kb的目的條帶，電泳結(jié)果如圖8-1C中箭頭所示，可見兩個(gè)方向均有正確的克隆，今用酶切結(jié)果為得到1.5Kb和4Kb的兩個(gè)條帶的克隆進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果示pENTR-loxP-D-loxP載體構(gòu)建成功。3、Adv-IoxP-OPD-IoxP 和 Adv-loxP-D-loxP 質(zhì)粒構(gòu)建
按照 hvitrogen 試劑盒說明，將 pENTR-loxP-OPD-loxP 和 pENTR-loxP-D-loxP 分別與 Ade-Block-Dest 進(jìn)行 LR 重組，獲得 Adv-IoxP-OPD-IoxP 和 Adv-IoxP-D-IoxP 克隆質(zhì)粒。EcoRI 酶切鑒定 Adv-loxP-OPD-loxP，理論上應(yīng)該切出 25kb,6. 7kb,2. Okb, 1. 9kb, 1. 5kb和526bp的條帶，電泳結(jié)果見圖8-2中左側(cè)箭頭所示，結(jié)果可見25kb,6. 7kb, 2. Okb, 1. 9kb，1. 5kb和526bp的條帶，結(jié)果示Adv-loxP-OPD-loxP質(zhì)粒構(gòu)建成功。EcoRI酶切鑒定 Adv-loxP-D-loxP，理論上應(yīng)該切出 25kb，6. 7kb，2. Okb, 1. 9kb, 1. 5kb 和 526bp 的條帶，電泳結(jié)果見圖8-2中右側(cè)箭頭所示，可見25 kb, 5. 7kb, 2. Okb, 1. 5kb, 725bp和526bp的目的條帶，結(jié)果示Adv-loxP-D-loxP質(zhì)粒構(gòu)建成功。4、Adv-loxP-OPD-loxP 和 Adv-loxP-D-loxP 腺病毒的包裝
用SwaI分別酶切Adv-loxP-OPD-loxP和Adv-loxP-D-loxP，并進(jìn)行片段純化，用于重組腺病毒包裝。傳四3々細(xì)胞，用irwitrogen公司轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染上述酶切純化后的 Adv-loxP-OPD-loxP 和 Adv-loxP-D-loxP 線性 DNA，包裝重組腺病毒 Adv-loxP-OPD-loxP 禾口 Adv-loxP-D-loxP。在六孔板中傳細(xì)胞3父105個(gè)/孔，371，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；第二天當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞培養(yǎng)液換成10%胎牛血清無雙抗(青霉素和鏈霉素)DMEM完全培養(yǎng)基，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30min，各2μ g的酶切純化后的線性 Adv-loxP-OPD-loxP、Adv-loxP-D-loxP 和 6 μ 1 脂質(zhì)體 2000 各用 250 μ 1 無胎牛血清無雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻后靜置，5min后，將DNA和脂質(zhì)體2000稀釋液輕輕混合均勻后靜置，20min后將DNA-脂質(zhì)體混合液均勻加入上述孵育30min的細(xì)胞中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，他后更換10%胎牛血清含雙抗(青霉素和鏈霉素) DMEM完全培養(yǎng)基，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間定期觀察細(xì)胞形態(tài)，直到出現(xiàn)完全CPE (細(xì)胞病變效應(yīng))，可收獲病毒，放入-80°C保存。重組腺病毒Adv-loxP-OPD-loxP和 Adv-loxP-D-loxP包裝過程中，在第7天出現(xiàn)CPE，在第10天出現(xiàn)了完全CPE，結(jié)果表明重組腺病毒 Adv-loxP-OPD-loxP 和 Adv-loxP-D-loxP 包裝成功。實(shí)施例4、腺病毒 Adv-loxP-0PD-hTERT-ICP27_loxP 的克隆方案如圖9所示Adv-IoxP-OPD- hTERT_ICP27_loxP載體的構(gòu)建模式。1、pGEMT-hTERT 的構(gòu)建
hTERT啟動(dòng)子是以細(xì)胞基因組DNA為模板，以SEQ ID N0: 9和SEQ ID NO: 10為上下游引物擴(kuò)增獲得，PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)30個(gè)循環(huán)94°C 變性30s，55°C退火45s，72°C延伸30s，通過TA克隆獲得pGEMT-hTERT克隆，測(cè)序結(jié)果見圖 10，測(cè)序結(jié)果證實(shí)hTERT啟動(dòng)子序列正確，克隆成功。
12
2、pGMT-hTERT_ICP27 的構(gòu)建
以HSV-IHF株為模板，以ULM基因(編碼ICP27蛋白)的上下游序列SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12為引物擴(kuò)增ULM基因的開放性讀碼框架，1%瓊脂糖凝膠電泳上述PCR產(chǎn)物， 理論上應(yīng)該擴(kuò)增出約1. 5Kb的條帶，將PCR擴(kuò)增的ULM基因開放性讀碼框架連接質(zhì)粒載體 pGMT-hTERT,即構(gòu)建完pGMT-hTERT-ICP27，測(cè)序結(jié)果見圖11，測(cè)序結(jié)果證實(shí)ICP27基因克隆成功。3、pENTR-loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP 的構(gòu)建
EcoRI， HindIII 雙酶切 pGMT_hTERT_ICP27 獲得 hTERT_ICP27 片段，XmnI， HindIII雙酶切pENTR -loxP-OPD-loxP作為載體，獲得的片段以平滑末端克隆入pENTR -loxP-OPD-loxP，從而構(gòu)建完成 pENTR -loxP-0PD-hTERT-ICP27_loxP。4、Adv- loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP質(zhì)粒的克隆與重組病毒的包裝
pENTR- loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP 與 Ade-Block-Dest 進(jìn)行 LR 重組，獲得 Adv- loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP 質(zhì)粒克隆質(zhì)粒，用 SwaI 酶切 Adv-IoxP- OPD -hTERT-ICP27-loxP,并進(jìn)行片段純化，在四3細(xì)胞中進(jìn)行重組腺病毒Adv-loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP的包裝(具體步驟參考實(shí)施例3中腺病毒Adv-IoxP-OPD-IoxP和腺病毒Adv-loxP-D-loxP的包裝實(shí)施方法)，在第7天出現(xiàn)CPE，在第10天出現(xiàn)了完全CPE，結(jié)果表明腺病毒Adv-loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP包裝成功。實(shí)施例5、重組腺病毒Adv-Cre的構(gòu)建以及病毒包裝如圖12所示Adv-Cre的構(gòu)建模式。 1、pENTR-Cre 的構(gòu)建
pENTR-MCS 和 pGEM-T-Cre 質(zhì)粒用 EcoRI 和 SacII 酶切，膠回收 2. 6kb 的載體 pENTR-MCS (如圖8-3A1所示)和2. 2kb的SV40-Cre片斷，連接，轉(zhuǎn)化，鑒定構(gòu)建成pENTR-Cre載體。用 EcoRI和SacII酶切酶切鑒定，陽性克隆可以得到2. 2kb和2. 6kb的條帶，如圖8-3B2所示。 結(jié)果顯示，pENTR-Cre構(gòu)建成功。2、Adv-Cre載體的構(gòu)建
按照hvitrogen試劑盒說明，將pENTR-Cre與Ade-Block-Dest進(jìn)行LR重組，獲得 Adv-Cre克隆質(zhì)粒。pENTR-Cre與Ade-Block-Dest在LR重組酶的作用下產(chǎn)生Adv-Cre克隆。用BamHI酶切鑒定Adv-Cre，陽性克隆酶切條帶為18. Ikb, 14. 5kb，1. 51kb，840bp和 510bp，如圖8-3C1所示，結(jié)果顯示，Adv-Cre構(gòu)建成功。用SwaI酶切Adv-Cre并進(jìn)行片段純化，在細(xì)胞中進(jìn)行重組腺病毒的包裝(具體包裝步驟參考實(shí)施例3中腺病毒Adv-loxP-OPD-loxP和腺病毒Adv-loxP-D-loxP的包裝實(shí)施方法)，結(jié)果表明腺病毒Adv-Cre包裝成功。實(shí)施例6、BAC-HSV-1-ICP27"
以SEQ ID N0: 13和SEQ ID N0: 14為引物，以pYD_C255質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增含UL54同源序列和半乳糖激酶(GalK基因)的片段ULM-GalK，PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)30個(gè)循環(huán)94°C變性30s，59°C退火45s，72°C延伸30s，將ULM-GalK片段電轉(zhuǎn)化至含BAC-HSV-I質(zhì)粒的大腸桿菌SW105 (含有Red重組酶的工程菌)，經(jīng)同源重組獲得 BAC-HSV-l-ICP27-Galk質(zhì)粒，序列SEQ ID N0: 15和SEQ ID N0: 16由博尚生物技術(shù)有限公司合成，SEQ ID N0: 15的3’端的20個(gè)堿基和SEQ ID N0: 16的5’端的20個(gè)堿基可以互補(bǔ)配對(duì)，將SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16互為引物和模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)30個(gè)循環(huán)94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸 30s，可以獲得不含galk片段的含ULM基因開發(fā)性讀碼框上下游同源序列的片段ULMarm， 將片段ULMarm電轉(zhuǎn)化至含BAC-HSV-l_ICP27-galk質(zhì)粒的大腸桿菌SW105(含有Red重組酶的工程菌)，經(jīng)同源重組獲得BAC-HSV-1-ICP27_質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染BAC-HSV-1質(zhì)粒的Vero細(xì)胞可見細(xì)胞病變效應(yīng)產(chǎn)生，轉(zhuǎn)染BAC-HSV-1-ICP27一質(zhì)粒的Vero細(xì)胞無病變效應(yīng)(圖13A)，將 BAC-HSV-1-ICP27-質(zhì)粒和BAC-HSV-1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染2ug質(zhì)粒DNA至Vero細(xì)胞，5天后觀察可見(圖13B)。結(jié)果顯示，BAC-HSV-1-ICP27_為復(fù)制缺陷型HSV-I載體，在無ICP27蛋白表達(dá)的情況下不能復(fù)制。實(shí)施例7、重組的HSV-I擴(kuò)增子載體的制備及其鑒定
如圖14所示重組腺病毒Cre-IoxP系統(tǒng)生產(chǎn)HSV-I擴(kuò)增子的流程圖。按2. 5X IO5/孔傳vero細(xì)胞六孔板，37 °C，5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；待細(xì)胞長(zhǎng)至融合率達(dá)90 A組給予MOI=I的Adv-Cre和Adv-IoxP-OPD-IoxP腺病毒，B組給予 MOI=I 的 Adv-Cre，Adv-loxP-OPD-loxP 腺病毒和 MOI=I 的的 HSV-1 病毒，C 組給予 MOI=I 的 Adv-loxP-OPD-loxP 腺病毒和 MOI=I 的的 HSV-1 病毒，D 組給予 MOI=I 的 Adv-Cre， Adv-IoxP-D-IoxP腺病毒和MOI=I的的HSV-I病毒，4小時(shí)后換液繼續(xù)培養(yǎng)，12小時(shí)后熒光倒置顯微鏡下觀察A，B, C，D各組都有紅色熒光出現(xiàn)如圖15-1A，圖15-1B，圖15-1C，圖 15-1D。24-48h期間熒光顯微鏡下觀察，至完全CPE收獲病毒。按2. 5 X IO5/孔傳vero細(xì)胞六孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至融合率約9096，換液后加入上述收獲的各組病毒液，6h后換液，48h后熒光顯微鏡下觀察所示，只有B組vero細(xì)胞在再次感染的時(shí)候有紅色熒光出現(xiàn)，A，C，和D組vero細(xì)胞在再次感染時(shí)無紅色熒光出現(xiàn)，如圖15-2A， 圖15-2B，圖15-2C，圖15-2D所示。結(jié)果表明，含有oriS-pac元件的腺病毒可以經(jīng)重組產(chǎn)生新型的HSV-I擴(kuò)增子載體，不含oriS-pac元件的腺病毒不能重組產(chǎn)生新型的HSV-I擴(kuò)增子載體。實(shí)施例8、不同株病毒對(duì)重組的HSV-I擴(kuò)增子的包裝
按2. 5X IO5/孔傳vero細(xì)胞六孔板，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；待細(xì)胞長(zhǎng)至融合率達(dá)9096，換液后加入MOI=I的重組腺病毒Adv-Cre和Adv-loxP-OPD-loxP感染Vero 細(xì)胞；1 !后換液，分別加入MOI=I的不同株HSV-I病毒液(HSV-1 F株，HSV-1 KOS株)， HSV-2 (333株)，他后換液；2 后熒光顯微鏡下觀察vero細(xì)胞紅色熒光情況。感染有 Adv-loxP-OPD-loxP病毒的各組都有紅色熒光出現(xiàn)，圖16A為感染重組腺病毒Adv-Cre和 Adv-loxP-OPD-loxP感染vero細(xì)胞加入HSV-I F株做輔助病毒，圖16B為感染重組腺病毒 Adv-Cre和Adv-loxP-OPD-loxP感染Vero細(xì)胞加入HSV-1K0S株做輔助病毒，圖16C感染重組腺病毒Adv-Cre和Adv-loxP-OPD-loxP感染vero細(xì)胞加入HSV-2 333株做輔助病毒。 25-48h期間熒光顯微鏡下觀察，至完全CPE收獲病毒。按2. 5 X IO5/孔傳vero細(xì)胞六孔板；待細(xì)胞長(zhǎng)至融合率約90%，換液后加入上述收獲的各組病毒液，6h后換液，48h后熒光顯微鏡下觀察，只有用Adv-loxP-OPD-loxP病毒， Adv-Cre病毒以及HSV-I感染過的Vero細(xì)胞在再次感染的時(shí)候有紅色熒光出現(xiàn)如圖16所示。圖16D為感染重組腺病毒Adv-Cre和Adv-loxP-OPD-loxP以及HSV-I F株做輔助病毒收獲后的病毒再次感染的結(jié)果，Vero細(xì)胞后可見紅色熒光；圖16E為感染重組腺病毒Adv-Cre和Adv-loxP-OPD-loxP以及HSV-I KOS株做輔助病毒收獲后的病毒再次感染的結(jié)果Vero 細(xì)胞后可見紅色熒光；圖16F感染重組腺病毒Adv-Cre和Adv-loxP-OPD-loxP以及HSV-2 333株做輔助病毒收獲后的病毒再次感染Vero細(xì)胞后可見紅色熒光。結(jié)果表明，本發(fā)明證實(shí)了復(fù)制缺陷型腺病毒Cre-IoxP系統(tǒng)重組制備出HSV-I擴(kuò)增子載體對(duì)HSV-I和HSV-2不同血清型和不同基因型復(fù)制和包裝的通用性，說明HSV-I擴(kuò)增子載體可以利用體內(nèi)感染的任何野生的單純皰疹病毒進(jìn)行再?gòu)?fù)制能力，為發(fā)展臨床抗單純皰疹病毒感染及相關(guān)疾病提供了有效的基因治療載體。實(shí)施例9、重組的HSV-I擴(kuò)增子載體競(jìng)爭(zhēng)性抑制病毒實(shí)驗(yàn)
按3X105/孔Vero細(xì)胞接種2個(gè)孔于六孔板中，以MOI=I的復(fù)制缺陷型腺病毒 Adv-IoxP-OPD - IoxP和Adv-Cre感染實(shí)驗(yàn)組A組Vero細(xì)胞，以MOI=I的復(fù)制缺陷型腺病毒 Adv-IoxP-D - IoxP和Adv-Cre感染對(duì)照組B組Vero細(xì)胞，12h后，各加入MOI=I的HSV-I (HF株)野生病毒感染A、B兩組Vero細(xì)胞，感染24h后于倒置熒光顯微鏡下觀察A組和B 組，感染4 后收獲病毒。用MOI=I的已收獲的病毒再感染Vero細(xì)胞，24h后于倒置熒光顯微鏡下觀察，48h后收獲病毒。同樣，將第二次收獲的病毒仍用MOI=I來感染Vero細(xì)胞，感染24h后于倒置熒光顯微鏡下觀察，4 后收獲病毒經(jīng)TCID50法測(cè)定病毒滴度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖17所示為測(cè)定滴度結(jié)果，A組病毒滴度明顯低于B組。結(jié)論本發(fā)明的重組HSV-I擴(kuò)增子載體可競(jìng)爭(zhēng)性抑制病毒復(fù)制，不含HSV-I oriS 和pac元件的對(duì)照組不能競(jìng)爭(zhēng)性抑制病毒復(fù)制。實(shí)施例10、重組的HSV-I擴(kuò)增子-hTERT_ICP27載體可特異表達(dá)功能性蛋白 ICP27是HSV-I復(fù)制的關(guān)鍵基因，敲除該基因后的HSV-I基因組不能復(fù)制，為復(fù)制缺陷
性病毒，需要提供ICP27蛋白，才能激活復(fù)制缺陷性病毒，本實(shí)施例將hTERT啟動(dòng)子啟動(dòng)的 ICP27置于本發(fā)明的重組HSV-I擴(kuò)增子載體，并輔以復(fù)制缺陷性的BAC-HSV-1-ICP27_對(duì)該擴(kuò)增子進(jìn)行輔助包裝，使得該輔助包裝系統(tǒng)只能在hTERT陽性的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制(因hTERT 陽性的細(xì)胞內(nèi)含有可以激活hTERT啟動(dòng)子的分子系統(tǒng))。人成纖維細(xì)胞為hTERT陰性，在該細(xì)胞內(nèi)ICP27不能表達(dá)，不能給BAC-HSV-1-ICP27_提供ICP27蛋白，從而使其在該細(xì)胞內(nèi)不能進(jìn)行復(fù)制；人鼻咽癌CNE細(xì)胞為hTERT陽性，在該細(xì)胞內(nèi)可以表達(dá)ICP27，可以為 BAC-HSV-1-ICP27_提供ICP27蛋白，從而使復(fù)制缺陷型的BAC-HSV-1_ICP27_在此細(xì)胞內(nèi)可以進(jìn)行復(fù)制，實(shí)現(xiàn)特異溶腫瘤的目的。按3X IO5/孔分別接種A組人成纖維細(xì)胞(hTERT陰性)，B組人鼻咽癌CNE細(xì)胞 (hTERT陽性)，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染2ug BAC-HSV-ICP27—，Mi后，以MOI=I的復(fù)制缺陷型腺病毒 Adv-loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP 和 Adv-Cre 感染細(xì)胞，6h 后換液，72h 觀察細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果示A組人成纖維細(xì)胞未見細(xì)胞病變效應(yīng)(圖18A，18B)，B組人鼻咽癌CNE細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(18C，18D)。即在hTERT表達(dá)陽性的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制缺陷性的BAC-HSV-ICP27-可以進(jìn)行復(fù)制。結(jié)論本發(fā)明重組的HSV-I擴(kuò)增子載體可成功表達(dá)功能性蛋白。利用腫瘤特異啟動(dòng)子表達(dá)ICP27蛋白，為復(fù)制缺陷型(ICP27編碼基因ULM敲除)的HSV載體反式提供缺失的ICP27蛋白，使復(fù)制缺陷性HSV-I病毒限定在腫瘤組織特異復(fù)制，從而達(dá)到特異溶腫瘤的目的。
權(quán)利要求
1.一種重組的HSV擴(kuò)增子載體，其特征在于，該載體是由分別攜帶Cre重組酶表達(dá)盒和操作性相連元件“ IoxP-HSV復(fù)制元件oriS-包裝信號(hào)pac-轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒-LoxP”的兩種復(fù)制缺陷型腺病毒在共感染細(xì)胞內(nèi)重組而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組的HSV擴(kuò)增子載體，其特征在于，所述的攜帶Cre重組酶表達(dá)盒的復(fù)制缺陷型腺病毒是將操作性相連元件SV40啟動(dòng)子-Cre重組酶編碼序列-PolyA 元件重組入AD5復(fù)制缺陷型腺病毒載體構(gòu)建而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組的HSV擴(kuò)增子載體，其特征在于，所述的復(fù)制缺陷型腺病毒攜帶的操作性相連元件的“HSV復(fù)制元件oriS-包裝信號(hào)pac-轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒”位于2個(gè) IoxP序列之間，且2個(gè)IoxP的序列是同向的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的重組的HSV擴(kuò)增子載體，其特征在于，所述的復(fù)制元件 oriS的序列如SEQ ID NO: 2所示；或所述的復(fù)制元件oriS序列通過如下方法獲得MluI 酶切BAC-HSV-I-HF獲得含末端重復(fù)區(qū)的BAC-TR，然后NotI酶切BAC-TR獲得含oriS及其側(cè)翼序列的片段，再用AgeI酶切前述片段后獲得含oriS核心區(qū)及其側(cè)翼序列的片段，最后經(jīng)NcoI酶切獲得1. 2Kb的含88bp oriS核心區(qū)及其側(cè)翼序列的片段作為復(fù)制元件oriS的序列；所述的包裝信號(hào)pac的序列如SEQ ID NO: 3所示；或所述的包裝信號(hào)pac通過如下方法獲得=MluI酶酶切BAC-HSV-1HF，獲得含末端重復(fù)區(qū)的BAC-TR，然后McI酶切BAC-TR 獲得含HSV-I末端重復(fù)區(qū)“pac”序列的片段；再用HphI酶切前述片段獲得含末端重復(fù)區(qū) “pac”序列的片段；最后BsrBI酶切前一片段后獲得含188bp Ub-DRl-Uc結(jié)構(gòu)的片段，作為包裝信號(hào)pac的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的重組的HSV擴(kuò)增子載體，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒選自目的基因表達(dá)盒，報(bào)告基因表達(dá)盒，靶基因microRNA表達(dá)盒，和靶基因shRNA表達(dá)盒。
6.一種如權(quán)利要求1所述的重組的HSV擴(kuò)增子載體的用途，其特征在于，所述的重組的 HSV擴(kuò)增子載體在制備靶向溶腫瘤/抗腫瘤的基因制劑中的應(yīng)用。
7.一種如權(quán)利要求1所述的重組的HSV擴(kuò)增子載體的用途，其特征在于，所述的重組的 HSV擴(kuò)增子載體用于制備抗HSV感染及HSV感染相關(guān)疾病的制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組的HSV擴(kuò)增子載體及其用途。本發(fā)明利用兩種分別攜帶Cre和操作性相連的元件loxP-HSVoriS-pac-轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒-loxP的復(fù)制缺陷型腺病毒，通過在共感染細(xì)胞內(nèi)的重組出新型HSV擴(kuò)增子載體。該擴(kuò)增子載體與傳統(tǒng)的以細(xì)菌質(zhì)粒為骨架的HSV擴(kuò)增子載體不同，它不含細(xì)菌復(fù)制序列(colEorigin)和抗性基因元件，僅含HSV的oriS，pac序列和轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。本發(fā)明用于制備不含細(xì)菌基因元件的用于各種轉(zhuǎn)基因研究和腫瘤基因治療的新型HSV擴(kuò)增子載體和制備用于特異抗HSV病毒及相關(guān)疾病的腺病毒治療制劑，該制劑的復(fù)制缺陷型腺病毒在細(xì)胞內(nèi)重組出的HSV擴(kuò)增子載體利用所感染的野生HSV病毒再?gòu)?fù)制自身并競(jìng)爭(zhēng)性抑制或持久地表達(dá)抗病毒基因而抑制野生HSV病毒的復(fù)制，因此可用于抗單純皰疹病毒感染及其相關(guān)疾病的治療。
文檔編號(hào)A61P31/22GK102212559SQ20111009367
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者孫項(xiàng)東, 韓志強(qiáng) 申請(qǐng)人:鄭州威瑞生物技術(shù)有限公司