專利名稱：旋覆花黃酮在制備預(yù)防和治療阿爾茨海默氏病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物研究領(lǐng)域，具體涉及旋覆花黃酮在制備防治阿爾茨海默氏病的藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏病(Alzheimer、disease, AD)又稱為老年癡呆癥，是由A β 42的沉積和由此形成的聚集體導(dǎo)致的。過量產(chǎn)生的A β 42易發(fā)生沉積，形成的A β 42聚集體對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有毒性，最終導(dǎo)致老年癡呆癥。因此，減輕腦內(nèi)Aβ 42的負(fù)荷、抑制Aβ 42的細(xì)胞毒性已成為防治阿爾茨海默氏病的根本方法。長期以來，阿爾茨海默氏病的治療主要是依靠西藥，如膽堿酯酶抑制劑、美金剛和尼莫地平等。這些藥物只能在短期內(nèi)改善癥狀，并不能延緩患者的病情發(fā)展。目前尚無有效抑制Αβ42的生成和Αβ 42細(xì)胞毒性的藥物，因而不能從根本上遏制阿爾茨海默氏病的發(fā)生和發(fā)展。Αβ42是由膜蛋白淀粉樣前體蛋白(縮寫為APP)經(jīng)膜蛋白β -分泌酶和Y -分泌酶順次水解產(chǎn)生的。在細(xì)胞膜上，APP首先經(jīng)膜蛋白β-分泌酶催化水解產(chǎn)生初級(jí)降解產(chǎn)物(縮寫為C99)、C99再經(jīng)膜蛋白Y-分泌酶催化水解產(chǎn)生了 A β 42。分泌酶的催化組分是膜蛋白早老素(縮寫為PS)，全長的PS(縮寫為PS-F)在生物體內(nèi)細(xì)胞膜上被自動(dòng)裂解為N端片段和C端片段(縮寫為PS-N、PS-C)，PS-N、PS-C再共同組成了 γ-分泌酶的催化部位。在細(xì)胞膜上PS與C99結(jié)合并催化C99水解產(chǎn)生了 A β 42。因此，凡是能夠抑制PS 與C99相互作用的藥物組分都有可能成為防治阿爾茨海默氏病的藥物。歷史上傳統(tǒng)的中藥在治療癡呆癥方面表現(xiàn)出一定的療效，同時(shí)中藥具有毒性低，安全的特點(diǎn)。因此從天然植物藥物組分中篩選出具有抑制A β 42細(xì)胞毒性或抑制PS與C99相互作用的組分是從根本上遏制阿爾茨海默病的一個(gè)重要思路。目前尚無有效抑制A β 42細(xì)胞毒性的天然植物藥物， 更沒有同時(shí)抑制A β 42的細(xì)胞毒性和PS與C99相互作用的天然植物藥物。

發(fā)明內(nèi)容
旋覆花黃酮(Inula flavonoid)是存在于天然植物旋覆花(Inula Flower)中的一種水溶性物質(zhì)，屬于2 —苯基色原酮類化合物，在抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等方面有較明顯的療效。有關(guān)旋覆花黃酮的生物活性的研究較少，從前對(duì)旋覆花黃酮的認(rèn)識(shí)主要集中在它清除自由基和抗氧化活性方面，本發(fā)明利用A β 42毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)了旋覆花黃酮(縮寫為XH)具有顯著抑制或中和Αβ 42細(xì)胞毒性的作用，同時(shí)對(duì)PS與C99 的相互作用也具有明顯的抑制效應(yīng)，進(jìn)一步本發(fā)明確定了旋覆花黃酮在制備預(yù)防和治療阿爾茨海默氏病藥物中的新用途。


圖1.旋覆花黃酮對(duì)Αβ 42細(xì)胞毒性的抑制作用，其中1 旋覆花黃酮抑制組，2 A β 42損傷組，3 空白對(duì)照組；圖2.旋覆花黃酮對(duì)Αβ 42細(xì)胞毒性的中和作用，其中1 旋覆花黃酮中和組，2 A β 42損傷組，3 空白對(duì)照組；圖3. pEGFP-C3-PSl表達(dá)載體的測(cè)序譜圖(一)；圖4. pEGFP-C3-PSl表達(dá)載體的測(cè)序譜圖(二)；圖5. pET28a-C99表達(dá)載體的測(cè)序譜圖；圖6.純化得到的C99的SDS-PAGE圖譜，其中1為蛋白質(zhì)Marker ；2為C99 ；圖7.旋覆花黃酮對(duì)靶細(xì)胞C0S7在C99基質(zhì)上粘附的影響，其中空載體只轉(zhuǎn)染了空載體的靶細(xì)胞C0S7在C99基質(zhì)上的粘附，PSl-F 轉(zhuǎn)染了 pEGFP_C3_PSl的靶細(xì)胞C0S7在 C99基質(zhì)上的粘附，XH 旋復(fù)花黃銅，無藥不加旋復(fù)花黃銅；圖8. pcDNA3. 1⑴-C99表達(dá)載體的測(cè)序譜圖；圖9.旋覆花黃酮對(duì)PSl與C99相互作用的影響，其中；1 加入旋覆花黃酮；2:陰性對(duì)照；3 陽性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 旋覆花黃酮抑制A β 42細(xì)胞毒性的作用分析(1)Αβ 42毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞模型的建立以大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(縮寫為PC12，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)為靶細(xì)胞，將PC12細(xì)胞用含有5% (體積比)胎牛血清和5% (體積比)熱滅活馬血清的DMEM[達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基](Dulbecco' s Modified Eagle Medium)(培養(yǎng)基購自寶泰克公司，按說明書每13. 5g DMEM粉末加入3. 7g NaHCO3UOOmg青霉素和IOOmg鏈霉素，最后用滅菌三蒸水定容至1L， PH7. 2 7. 4)配成細(xì)胞懸液，以1 X IOVml的密度接種于平底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種 100 μ 1的細(xì)胞懸液，共設(shè)2組，分別為空白對(duì)照組和A β 42損傷組，每組設(shè)置三個(gè)平行樣。 PC12細(xì)胞于37°C培養(yǎng)1天，使其貼壁；然后吸去培養(yǎng)液，按照不同的組別再加入DMEM培養(yǎng)基如下空白對(duì)照組加入IOOul的DMEM培養(yǎng)基；A β 42損傷組加入含有0. 03mg/ml A β 42 的lOOulDMEM培養(yǎng)基。兩組培養(yǎng)6天后分別用四甲基偶氮唑鹽比色法(縮寫為MTT法)測(cè)定靶細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示與空白對(duì)照組的細(xì)胞相比，Αβ 42損傷組中靶細(xì)胞的存活率下降了 30%，由此建立了 Αβ 42毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞模型。(2)旋覆花黃酮抑制Αβ 42細(xì)胞毒性的作用分析以PC12細(xì)胞為靶細(xì)胞[來源同上述(1)]。將靶細(xì)胞PC12分為3組空白對(duì)照組， A β 42損傷組，旋覆花黃酮抑制組。將PC12細(xì)胞以IXioVml細(xì)胞懸液[配制方法同上述 (1)]的密度接種于平底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種ΙΟΟμΙ，每組設(shè)置三個(gè)平行樣。37°C 培養(yǎng)ld，使其貼壁；吸去培養(yǎng)液，然后按照不同的組別分別加入新鮮培養(yǎng)基?？瞻讓?duì)照組 加入100 μ 1 DMEM培養(yǎng)基[配制方法同上述(1) ] ；A β 42損傷組加入100 μ 1含0. 03mg/ ml A β 42的DMEM培養(yǎng)基；旋覆花黃酮抑制組加入100 μ 1含0. 03mg/ml A β 42及0. 15mg/ ml旋覆花黃酮(上海同田生物技術(shù)有限公司有售)的DMEM培養(yǎng)基。各組培養(yǎng)6天后用MTT 法測(cè)定各組的活細(xì)胞數(shù)，其結(jié)果如圖1顯示，表明旋覆花黃酮具有抑制A β 42細(xì)胞毒性的作用。
以上結(jié)果表明，應(yīng)用本發(fā)明構(gòu)建的Αβ 42毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞模型體外檢測(cè)證明旋覆花黃酮具有明顯的抑制A β 42細(xì)胞毒性的功效。實(shí)施例2 旋覆花黃酮中和A β 42細(xì)胞毒性的作用分析(1)Αβ 42毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞模型的建立方法同實(shí)施例1中(1)。(2)旋覆花黃酮中和Aβ 42細(xì)胞毒性的作用分析以PC12細(xì)胞為靶細(xì)胞[來源同實(shí)施例1中(1)]。將靶細(xì)胞PC12分為3組空白對(duì)照組，Αβ 42損傷組，旋覆花黃酮中和組。將PC12細(xì)胞以IXioVml細(xì)胞懸液[配制方法同實(shí)施例1中(1)]的密度接種于平底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μ 1，每組設(shè)置三個(gè)平行樣。37°C培養(yǎng)ld，使其貼壁；吸去培養(yǎng)液，然后按照不同的組別加入分別新鮮培養(yǎng)基。 空白對(duì)照組加入100 μ 1 DMEM培養(yǎng)基[配制方法同實(shí)施例1中(1)]，培養(yǎng)6天；A β 42損傷組加入100 μ 1含0. 03mg/ml A β 42的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)6天；旋覆花黃酮中和組加入100 μ 1含0. 03mg/ml A β 42的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天后加入終濃度為0. 15mg/ml的旋覆花黃酮，再繼續(xù)培養(yǎng)3天。分別用MTT法測(cè)定各組的活細(xì)胞數(shù)，其結(jié)果如圖2顯示旋覆花黃酮具有中和A β 42細(xì)胞毒性的作用。以上結(jié)果表明，應(yīng)用本發(fā)明構(gòu)建的Αβ 42毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞模型體外檢測(cè)證明旋覆花黃酮具有明顯的中和A β 42細(xì)胞毒性的功效。實(shí)施例3 旋覆花黃酮對(duì)靶細(xì)胞C0S7在C99基質(zhì)上粘附的影響(1)早老素1 (PSl)的基因合成與表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)編碼人PSl的基因序列[記載于國際基因庫(GenBank)中，登錄號(hào)為 ΝΜ_000021.2)，設(shè)計(jì)并合成了編碼PSl的基因片段，其序列如下
ccctcgag|atg......t^ctgcaggaattccg其中5’端有下劃線的ctcgag序列是內(nèi)切酶)(h01識(shí)別位點(diǎn)，3’端有下劃線的序列是內(nèi)切酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，所設(shè)計(jì)的此二酶切位點(diǎn)與本發(fā)明所用的真核表達(dá)載
體pEGFP-C3(通用的真核表達(dá)載體，含有綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)簽及硫酸卡那霉素抗性基因等，Clontech等公司有售)的B10I和EcoRI相匹配，適合于在真核細(xì)胞中高效表達(dá)，中間方框中自atg至tag代表的序列為GenBank中登錄號(hào)NM_000021. 2的全序列(即自1號(hào)至1404號(hào)序列)。利用)(hoI和EcoRI切割位點(diǎn)將此合成的編碼PSl的基因片段克隆進(jìn)表達(dá)載體PEGFP-C3中BioI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建成PSl真核表達(dá)載體pEGFP_C3_PSl。上述表達(dá)載體的構(gòu)建步驟具體如下雙酶切反應(yīng)將1. O μ gpEGFP-C3載體和3. O μ g上述合成的編碼PSl的基因片段分別與適量去離子水混勻，使其總體積分別為18μ 1，再各加入2單位限制性內(nèi)切酶B10I和 EcoRI及2 μ 1相應(yīng)的IOXH緩沖液，混勻，置37°C水浴保溫2小時(shí)后，分別采用常規(guī)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收法參照“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”(第二版，科學(xué)出版社)322頁回收目的 DNA。然后取0. 5μ g上述步驟回收的pEGFP-C3載體DNA，向其中加入是其3倍摩爾量的編碼PSl的基因片段DNA、2yl 10XT4DNA連接酶緩沖液，加去離子水定容至20ul，最后加入1單位的的T4DNA連接酶，混勻并瞬間離心以使液滴聚集管底，置16°C水浴過夜或25°C水浴4小時(shí)后，得到連接好的重組表達(dá)載體PEGFP-C3-PS1。重組表達(dá)載體pEGFP-C3-PSl轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α 取10 μ 1重組表達(dá)載體 PEGFP-C3-PS1加入100μ 1 Ε. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(Ε. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制備方法參照“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”第二版，科學(xué)出版社，49頁)中，冰浴30分鐘后置于42°C水浴中保溫1分鐘，立即取出并置于冰浴中冷卻2分鐘。加入200μ 137°C預(yù)熱的SOC液體培養(yǎng)基，370C 150rpm振搖培養(yǎng)60分鐘后，取出100 μ 1培養(yǎng)液涂布于含硫酸卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)平板上，37 °C培養(yǎng)16小時(shí)后，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落。重組表達(dá)載體pEGFP-C3-PSl的克隆與基因序列分析挑取轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行核酸序列分析，結(jié)果如圖3、圖4(重組表達(dá)載體pEGFP-C3-PSl測(cè)序譜圖，其中編碼PSl的基因號(hào)為圖3中的55-697號(hào)連接著圖4中167-915號(hào))所示，起始密碼子為ATG，終止密碼子為 TAG,由此表明獲得重組表達(dá)載體pEGFP-C3-PSl。(2) PSl膜性表達(dá)靶細(xì)胞模型的建立將上述真核表達(dá)載體PEGFP-C3-PS1轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞(縮寫為C0S7，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)，24小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察PSl表達(dá)量達(dá)到最大，并且分布在靶細(xì)胞C0S7的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，由此建立了膜性表達(dá)PSl的靶細(xì)胞模型。(3) C99原核表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)編碼人APP中C99片段的基因序列[記載于國際基因庫(GenBank)中，登錄號(hào)為NM _01414]，設(shè)計(jì)并合成了編碼C99的基因片段，其序列如下
權(quán)利要求
1.旋覆花黃酮(Inulaflavonoid)在抑制或中和A β 42細(xì)胞毒性方面的應(yīng)用。
2.旋覆花黃酮(Inulaflavonoid)在抑制PSl與C99相互作用方面的應(yīng)用。
3.旋覆花黃酮(Inulaflavonoid)在制備預(yù)防和治療阿爾茨海默氏病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物研究領(lǐng)域，具體涉及旋覆花黃酮在制備防治阿爾茨海默氏病的藥物中的新用途。經(jīng)長期研究發(fā)現(xiàn)旋覆花黃酮(Inula flavonoid)具有顯著抑制或中和Aβ42細(xì)胞毒性的作用，同時(shí)對(duì)PS與C99的相互作用也具有明顯的抑制效應(yīng)，進(jìn)一步確定了旋覆花黃酮在制備預(yù)防和治療阿爾茨海默氏病藥物中的新用途，為臨床治療阿爾茨海默氏病提供了一種新的用藥選擇。
文檔編號(hào)A61P25/28GK102210671SQ20111009426
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者張應(yīng)玖, 陳天睿, 黃雪媚 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)