專利名稱：靶向于組織因子基因的小核酸及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靶向于組織因子基因的小核酸的新用途，具體涉及在治療眼底新生血管相關(guān)性疾病中的 應(yīng)用，尤其是治療年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變等由新生血管異常增生引起的眼病。所述小核酸是治療眼底新生血管相關(guān)性疾病的藥物中的活性成分。
背景技術(shù)：
小干擾核酸(small interfering RNA, siRNA)是帶有特定基因密碼的短小核酸堿基片斷，一般功能長度為21 23bp。其作用原理是與特定靶基因mRNA結(jié)合，使之降解而失去功能。這種雙鏈RNA分子介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)錄的基因沉默現(xiàn)象稱之為核酸干擾(RNAinterference, RNAi),雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)先與細(xì)胞內(nèi)的其他成分結(jié)合成一個核酸復(fù)合體，從而形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex, RISC);激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA上并切割而導(dǎo)致mRNA降解，從而清除細(xì)胞內(nèi)特定的基因表達(dá)。siRNA不僅廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究，而且可利用其對致病基因的高效特異性抑制的特性設(shè)計藥物。微小RNA (microRNA，miRNA)是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的21 23個核苷酸長度的單鏈RNA分子。miRNA是由DNA轉(zhuǎn)錄的基因編碼，但不翻譯成蛋白質(zhì)的非編碼RNA ；miRNA形成過程是由稱做pri-miRNA原始轉(zhuǎn)錄本加工成pre-miRNA的短莖環(huán)結(jié)構(gòu),其作用途徑與siRNA相同，pre-miRNA經(jīng)Dicer酶切割后形成miRNA,進(jìn)入RISC,通過堿基互補配對的方式識別革巴mRNA,并根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。成熟的miRNA分子部分互補到一個或多個mRNA分子，它們的主要功能是下調(diào)基因的表達(dá)。年齡相關(guān)性黃斑變性(age-relatedmacular degeneration, AMD)是 50 歲以上的人視力損害的主要原因之一。發(fā)達(dá)國家的60歲以上人群發(fā)病率在10%以上。隨著中國人口老年化，該病的發(fā)病率有上升趨勢。AMD病變發(fā)生在視網(wǎng)膜的黃斑區(qū)。在臨床上分為干性和濕性兩型，干性主要由視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡引起，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜地圖樣萎縮。病程發(fā)展慢但不可逆。濕性的病理特征為脈絡(luò)膜新生血管(choroid neovascularization, CNV)伴有大量滲出，病程發(fā)展快，但有效抑制脈絡(luò)膜新生血管可在一定程度上改善視力。該病早期的病理變化為視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial cells,RPE)功能受損，細(xì)胞外基質(zhì)積聚導(dǎo)致Bruch膜增厚和玻璃膜疣形成。目前認(rèn)為AMD的發(fā)病機制為氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。在特定的致病因子方面，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)在促進(jìn)濕性AMD的CNV形成上起關(guān)鍵作用。干性AMD目前基本無特異治療方法。濕性AMD治療主要針對脈絡(luò)膜新生血管。傳統(tǒng)的療法有激光光凝，光動力療法，手術(shù)和放射。但療效不佳?；蛱┛斯?005年成功開發(fā)出二種抗VEGF抗體,Avastin和Lucentis后,濕性AMD治療發(fā)生了很大的改觀。Lucentis以AMD為適應(yīng)癥。Avastin是美國FDA批準(zhǔn)用于直腸癌的藥物，適應(yīng)癥并不包括AMD。但由于其結(jié)構(gòu)與Lucentis相似并且價格便宜也在臨床上廣泛使用。這兩種抗VEGF抗體球內(nèi)注射可減緩相當(dāng)部分患者的疾病進(jìn)展及部分改善視力?？筕EGF —直是AMD眼藥的開發(fā)的主要思路。在siRNA方面，可表達(dá)VEGF短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)腺病毒載體可有效抑制VEGF誘導(dǎo)小鼠CNV。小鼠玻璃體腔注射后可有效地沉默高水平的VEGF，從而阻止CNV的形成(Cashman SM等人.I0VS，2006;47:3496-3504)。然而近年來發(fā)現(xiàn)VEGF除了病理性地促進(jìn)CNV的形成外，還有很強的針對非血管細(xì)胞的生理性功能。VEGF通過激活VEGF受體2對視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞有直接保護(hù)作用(Nishijima K等人Am J Pathol.2007;171:53-67)。離體試驗也發(fā)現(xiàn)VEGF可減少視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞在氧化應(yīng)激時的損傷。如加入Avastin, VEGF的這種保護(hù)作用消失(Brar等人Mol Vis. 2010; 16:1848-53)。這些研究結(jié)果提示在臨床上過度直接抑制VEGF可能造成的風(fēng)險。組織因子(Tissue factor, TF，又稱促凝血酶原激酶、凝血因子III和CD142)屬于二型細(xì)胞因子受體超家族，是凝結(jié)因子7 (clotting factor VII，F(xiàn)VII)和其活化成分 (FVIIa)的受體。組織因子是一種跨膜單鏈糖蛋白，其由263個氨基酸殘基的位于胞內(nèi)的羧基端和23個氨基酸殘基的跨膜區(qū)，以及胞內(nèi)219個氨基酸殘基的氨基端組成，其中胞內(nèi)氨基端含有與 FVII/FVIIa 結(jié)合的區(qū)域(Chu AJ. Front. Biosci. 11，256-271 (2006))。組織因子在多個器官組織上表達(dá)，其中包括眼組織。炎癥和氧化應(yīng)激可刺激組織因子高表達(dá)(Cho等人Lab Invest. 2010 Nov I)。已知組織因子與多個AMD的病變的發(fā)生機制有關(guān)。其中包括細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、新生血管和補體激活。Bora等用組織因子抗體有效地抑制7 小鼠模型 CNV 的形成(Bora PS 等人:PNAS. 2003; 100:2679-84)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療眼底新生血管相關(guān)性疾病的新途徑，利用靶向TF基因的小核酸分子來抑制病理狀態(tài)下TF基因的異常高表達(dá)，以達(dá)到抑制新生血管的形成，從而達(dá)到治療眼底新生血管相關(guān)性疾病的目的。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了靶向于組織因子基因的小核酸在制備治療眼底新生血管相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。所述的小核酸用作藥物的活性成分，小核酸可以是調(diào)節(jié)TF基因表達(dá)的siRNA或微小RNA (microRNA, miRNA)。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述的siRNA分子，其具有如下序列結(jié)構(gòu)
正義鏈5’ -GAGCCUCUGUAUGAGAACUNN-3’ (SEQ ID NO: I)
反義鏈5’ -AGUUCUCAUACAGAGGCUCNN-3’ (SEQ ID NO: 2)
其中，N為胞嘧啶核苷C、鳥嘌呤核苷G、腺嘌呤核苷A、尿嘧啶核苷U ;脫氧胞嘧啶核苷dC、脫氧鳥嘌呤核苷dG、脫氧腺嘌呤核苷dA或脫氧胸腺嘧啶核苷dT。換句話說，該雙鏈siRNA分子的主干序列為
正義鏈5’ -GAGCCUCUGUAUGAGAACU-3’ (SEQ ID NO: 3)
反義鏈5’ -AGUUCUCAUACAGAGGCUC-3’ (SEQ ID NO: 4)。在一個優(yōu)選的實施方式中，上述序列中3’端的“NN”是兩個脫氧胸腺嘧啶核苷dT。所述的眼底新生血管相關(guān)疾病為新生血管異常增生相關(guān)疾病。所述的新生血管異常增生相關(guān)疾病為年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變中的至少一種。本發(fā)明經(jīng)篩選的靶向TF基因的小核酸分子可抑制病理狀態(tài)下TF基因異常高表達(dá)，玻璃體腔注射后不僅可減少TF基因引起的細(xì)胞凋亡，從而防止AMD向干性方面發(fā)展；還可以阻斷TF基因引起的CNV形成，從而防止?jié)裥訟MD的形成。靶向TF基因的小核酸的使用可避免對VEGF的過度直接抑制可能引起的副作用。因此靶向TF基因的小核酸可望治療眼底新生血管相關(guān)性疾病。


圖I是提純的不同實驗組的細(xì)胞總RNA電泳檢測圖，實驗組分別為TF_sl轉(zhuǎn)染組、TF_s2轉(zhuǎn)染組、TF_s3轉(zhuǎn)染組和正常組。圖2為實施例I中不同實驗組TF基因的mRNA相對表達(dá)量柱形圖，橫坐標(biāo)表示各處理實驗組，縱坐標(biāo)表示TF基因相對看家基因GAPDH的mRNA相對表達(dá)量。 圖3為實施例2中不同實驗組TF基因的mRNA相對表達(dá)量柱形圖，橫坐標(biāo)表示各處理實驗組，縱坐標(biāo)表示TF基因相對看家基因GAPDH的mRNA相對表達(dá)量。
具體實施例方式為方便起見，本發(fā)明中提及的術(shù)語“小核酸”或“小核酸分子”，應(yīng)當(dāng)理解，它們表示的意思和范圍相同。本文中術(shù)語“組織因子”、“組織因子基因”或“TF基因”，應(yīng)當(dāng)理解，它們表示的意思和范圍相同。本發(fā)明中，術(shù)語“小核酸”是指具有基因調(diào)節(jié)功能的siRNA或miRNA。本發(fā)明所述的眼底新生血管相關(guān)性疾病包括年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變等。因此，包含上述小核酸分子的制備治療眼底新生血管相關(guān)性疾病的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合于相應(yīng)疾病的給藥、并且恰當(dāng)?shù)乇３中『怂岱肿拥幕钚?。比如，對于注射用給藥系統(tǒng)，劑型可以是凍干粉。任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學(xué)可接受的輔助劑，只要其適合于相應(yīng)的給藥體系、并且恰當(dāng)?shù)乇３中『怂岱肿拥幕钚?。比如，在臨床使用中，對于眼科用藥，可以將本發(fā)明的小核酸溶于不含有RNA酶的無菌水中，輕輕混勻后眼內(nèi)玻璃體腔注射。以下在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)中，用靶向TF基因的siRNA分子，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。應(yīng)理解，下述實施例僅用于闡明本發(fā)明，并非是對本發(fā)明進(jìn)行限制。實施例I
IARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)
ARPE-19 細(xì)胞在含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基(美國 Invitrogen 公司)，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)中培養(yǎng)。2 siRNA設(shè)計與合成
設(shè)計靶向TF基因的siRNA序列。根據(jù)美國NCBI數(shù)據(jù)庫中的TF基因序列(NCBI庫號NM_001993)，用siRNA設(shè)計軟件設(shè)計3對siRNA，并由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成，將正義鏈和對應(yīng)的反義鏈退火成siRNA雙鏈，轉(zhuǎn)染前配置成濃度為20 u M0序列如下
權(quán)利要求
1.靶向于組織因子基因的小核酸在制備治療眼底新生血管相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的小核酸為siRNA。
3.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的小核酸為miRNA。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的siRNA，其具有如下序列結(jié)構(gòu) 正義鏈5’ -GAGCCUCUGUAUGAGAACUNN-3’ 反義鏈5’ -AGUUCUCAUACAGAGGCUCNN-3’ 其中，N為胞嘧啶核苷C、鳥嘌呤核苷G、腺嘌呤核苷A、尿嘧啶核苷U、脫氧胞嘧啶核苷dC、脫氧鳥嘌呤核苷dG、脫氧腺嘌呤核苷dA或脫氧胸腺嘧啶核苷dT。
5.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的眼底新生血管相關(guān)疾病為新生血管異常增生相關(guān)疾病。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的新生血管異常增生相關(guān)疾病為年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變中的至少一種。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是眼科用藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及靶向于組織因子(TissueFactor,TF)基因的小核酸及其用途，具體涉及其在制備治療眼底新生血管相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。所述的眼底新生血管相關(guān)疾病尤其是指治療年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變等由新生血管異常增生引起的眼病。本發(fā)明經(jīng)篩選的靶向TF基因的小核酸分子可抑制病理狀態(tài)下TF基因異常高表達(dá)，玻璃體腔注射后不僅可減少TF基因引起的細(xì)胞凋亡，從而防止AMD向干性方面發(fā)展；還可以阻斷TF基因引起的CNV形成，從而防止?jié)裥訟MD的形成。靶向TF基因的小核酸的使用可避免對VEGF的過度直接抑制可能引起的副作用。因此靶向TF基因的小核酸可望治療眼底新生血管相關(guān)性疾病。
文檔編號A61P27/02GK102727513SQ20111009473
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者唐小軍, 庹旌生, 朱遠(yuǎn)源, 李鐵軍 申請人:百奧邁科生物技術(shù)有限公司