專利名稱：重組質(zhì)粒pET32a-hIL-23R-CHR及其構(gòu)建表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及人IL-23R細(xì)胞因子受體區(qū)(hIL-23R-CHR)，構(gòu)建了 hIL-23R-CHR區(qū)和8個(gè)hIL_23R_CHR突變體，以及pET3h-hIL_23R-CHR的構(gòu)建表達(dá)及其產(chǎn)物的純化方法。
背景技術(shù)：
1. IL-23R 與 IL-23 的關(guān)系IL-23是一個(gè)擁有異二聚體結(jié)構(gòu)的造血細(xì)胞因子，由p40和pl9兩個(gè)亞基組成，結(jié)構(gòu)上與IL-12共享p40亞基，功能類似于IL-12，可導(dǎo)致人類T細(xì)胞的增殖和IFN- γ的產(chǎn)生。與IL-12不同的是，IL-23對(duì)人類和鼠類只優(yōu)先刺激記憶性T細(xì)胞而不是初始T細(xì)胞群。IL-23可作用于活化T細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，產(chǎn)生IFN-γ和IL-12等細(xì)胞因子，在炎癥性疾病、自身免疫性疾病的發(fā)病以及抗腫瘤和抗感染等方面發(fā)揮重要作用，有望成為新的免疫治療因子。IL-23R和IL-Ia^ 1共同組成IL-23的受體復(fù)合物，其中，IL-Ia^ 1是IL-UR的兩個(gè)亞基之一，另一亞基是IL-12R β 2。IL-23R是造血因子受體超家族的一個(gè)新的成員，位于人1號(hào)染色體上。IL-23R蛋白包含一個(gè)細(xì)胞外區(qū)域、一個(gè)單跨膜區(qū)域和一個(gè)有252個(gè)氨基酸的胞質(zhì)區(qū)域。其胞外區(qū)不同于其他造血因子受體超家族成員的三個(gè)膜纖維蛋白連接， 而是由一個(gè)信號(hào)序列、一個(gè)N端免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和2個(gè)細(xì)胞因子受體區(qū)域組成。IL-23 與 IL-12 使用相同的 Jak-stat 信號(hào)分子，如 Jak2、Tyk2、statl、stat3、stat4 和 stat5，而 IL-23R主要是運(yùn)用Jak2和stat3信號(hào)分子。細(xì)胞對(duì)IL-12或IL-23的反應(yīng)能力通過(guò)分別檢測(cè)IL-Ia^ 2和IL-23R的表達(dá)而測(cè)定。2. IL-23R 與 TH17 的關(guān)系Thl7是最近研究發(fā)現(xiàn)的一類不同于Thl和Th2細(xì)胞的⑶4+T細(xì)胞亞群，此亞群細(xì)胞高表達(dá)IL-17，同時(shí)也產(chǎn)生IL-6和TNF- α。Thl7細(xì)胞亞群的分化和功能均受Thl和Th2細(xì)胞因子的調(diào)控。目前Thl7的確切調(diào)控機(jī)制仍不十分清楚，受多種細(xì)胞因子(IL-23、IL-12、 IL-6、TGF-β、INF-γ等)、轉(zhuǎn)錄因子(RORgammat)的共同作用影響，具有自己獨(dú)特的分化、 發(fā)育途徑。TGF-β 1、IL-6是Thl7細(xì)胞分化的啟動(dòng)者，IL-23是Thl7細(xì)胞分化的促進(jìn)者， IL-23在Thl7細(xì)胞分化過(guò)程中具體的作用機(jī)制被認(rèn)為與STAT-3有關(guān)，因?yàn)镮L-23可以介導(dǎo)STAT-3的磷酸化過(guò)程，使STAT-3激活從而促進(jìn)IL-17的分泌。IFN- y、IL_4是Thl7細(xì)胞分化的抑制因子。Socs3是一種重要的Thl7細(xì)胞分化的負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白，其機(jī)制可能是限制了 STAT-3的磷酸化過(guò)程。Thl7可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，其中最主要的是IL-17。IL-17 屬于促炎因子，與許多炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，如器官移植排斥反應(yīng)、腫瘤及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、哮喘等炎癥免疫性疾病，這些患者的血清和病變組織中都能檢測(cè)到IL-17。研究證實(shí)IL-23刺激TH17的擴(kuò)增和維持，故 IL-23R對(duì)TH17細(xì)胞亞群來(lái)說(shuō)是一個(gè)關(guān)鍵的作用因子。IL23-IL23R-TH17-IL17軸在自身免疫性疾病中的致病性也已被證實(shí)。減少被IL-23刺激的IL-17的產(chǎn)生就可以減少EAE在小鼠模型中的發(fā)生，同時(shí)運(yùn)用IL-17的抗體可以提供部分的保護(hù)作用。更進(jìn)一步的研究表明， 重組基因IL-23pl9能夠加劇小鼠的結(jié)腸炎，相反抗IL-23pl9抗體的治療就能夠改善EAE。 因此TH17細(xì)胞在炎癥免疫性疾病中具有重要作用，可以作為一個(gè)新的藥物作用靶分子。3. IL-23R與炎癥免疫性疾病的關(guān)系研究表明，IL-23R與由TH17通路引起的炎癥免疫性疾病密切相關(guān)。銀屑病是一個(gè)常見的、慢性的T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性皮膚疾病。好發(fā)于15 30歲的人群，男女概率均等。 從病理學(xué)來(lái)說(shuō)，銀屑病主要特點(diǎn)是血管變化、表皮的過(guò)度分化和炎癥。銀屑病有高度的遺傳性，且具有多種因素的遺傳特色。目前的生物學(xué)數(shù)據(jù)顯示，IL-23/IL-23R通路可能是銀屑病一個(gè)重要的干預(yù)治療靶向。研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者在皮膚損害處IL-23pl9和p40mRNA的水平顯著增高。另外在高表達(dá)IL-23的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中觀察到由基底的角質(zhì)化細(xì)胞構(gòu)成的表達(dá)，它被認(rèn)為在銀屑病的病理學(xué)中發(fā)揮著重要的中軸作用。Arm Begovich等人為了能夠更好的鑒定IL-23R遺傳變異體與銀屑病緊密相關(guān)，他們?cè)u(píng)估了 SNPs與特定的臨床表現(xiàn)包括好發(fā)年齡、家族史、銀屑病關(guān)節(jié)炎和銀屑病發(fā)病嚴(yán)重性的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)對(duì)感染進(jìn)行分級(jí)測(cè)定的時(shí)候，SNPrs6887695的效應(yīng)顯著不同。這些關(guān)于IL-23R與銀屑病危險(xiǎn)性相關(guān)的變異體的發(fā)現(xiàn)為IL-23通路可能是干預(yù)治療銀屑病的合適的通路提供了遺傳學(xué)的證據(jù)。炎癥性腸病例如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，都屬于慢性復(fù)發(fā)性胃腸道感染性疾病，可以導(dǎo)致腹痛、腹瀉以及消化道出血，以腸道的慢性透壁性、節(jié)段性以及典型的肉芽腫性炎癥為特征，好發(fā)于20 40歲，遺傳因素在其發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。牛津大學(xué)的 Fraser Cummings JR等在604名克隆病、47名潰瘍性結(jié)腸炎患者以及993名健康對(duì)照中進(jìn)行了 IL-23R基因型檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在IL-23R著絲點(diǎn)部分具有多發(fā)的變異危險(xiǎn)性，結(jié)果證實(shí)8個(gè) SWs基因型檢測(cè)都與克羅恩病顯著相關(guān)，對(duì)于炎癥性腸病而言IL-23R是一個(gè)易感基因。而 BUNING等人則進(jìn)一步驗(yàn)證了位于IL-23R上的SNP rsl 1209026 (Arg381Gln)對(duì)于炎癥性腸病來(lái)說(shuō)是一個(gè)保護(hù)性的標(biāo)志，起到了保護(hù)效應(yīng)，但并不決定疾病的表型。IL-23R的研究仍在繼續(xù)，在對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病相關(guān)性的研究中，Sanchez E等人在2M名系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者以及342名健康對(duì)照者中進(jìn)行了 IL-23R變異體的基因分型，結(jié)果顯示在西班牙人種中IL-23R的多態(tài)性并未在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的易感性或嚴(yán)重性方面發(fā)揮重要作用。另外，IL-23R SWs在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化疾病易感性中的作用還有待進(jìn)一步探索。IL-23R基因的交替拼接的調(diào)節(jié)系統(tǒng)是復(fù)雜的，而優(yōu)先表達(dá)某種IL-23R 的拼接變體也有可能在某種癌癥中發(fā)揮重要的作用。由此可見，對(duì)IL-23R特性的研究有可能進(jìn)一步明確疾病的發(fā)病機(jī)制，并為疾病的臨床治療開拓新的方向。本發(fā)明構(gòu)建的pET3h-hIL-23R-CHR重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶驗(yàn)證以及DNA測(cè)序，證明質(zhì)粒構(gòu)建完全正確。本發(fā)明之所以構(gòu)建hIL-23R-CHR重組質(zhì)粒，因?yàn)樵撈螌儆?hIL-23R胞外區(qū)，是與IL-23結(jié)合的有效功能區(qū)，可以封閉IL-23的功能，進(jìn)而可以防治由 IL23-IL23R-TH17-IL17軸引起的自身免疫性疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明選擇IL-23復(fù)合物中的一個(gè)亞單位-P19，利用與其結(jié)合的IL-23R受體蛋白為靶分子，構(gòu)建表達(dá)了人IL-23R胞外區(qū)2個(gè)細(xì)胞因子受體區(qū)域(CHR)，以期其發(fā)揮類似于抗體效應(yīng)，為自身免疫疾病的治療提供新的可能。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供表達(dá)hIL-23R_CHR的重組質(zhì)粒，采用pET3h表達(dá)載體，hIL-23R-CHR基因序列見序列表1，氨基酸序列見序列表2。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供hIL-23R_CHR區(qū)第176位蘇氨酸(T)突變?yōu)楸彼?(A)的突變體，命名為hIL-23R-CHR-A，其基因序列見序列表3，氨基酸序列見序列表4。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供hIL-23R-CHR區(qū)第45位谷氨酸(E)突變成甘氨酸(G) 的突變體，命名為hIL-23R-CHR-G，其基因序列見序列表5，氨基酸序列見序列表6。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供hIL-23R_CHR區(qū)第49位谷氨酰胺(Q)突變?yōu)榫彼?(R)，第68位賴氨酸(K)突變?yōu)楣劝彼?E)，第72位色氨酸(W)突變?yōu)榫彼?R)的突變體，命名為hIL-23R-CHR-R，其基因序列見序列表7，氨基酸序列見序列表8。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供hIL-23R_CHR區(qū)第181位色氨酸(W)突變?yōu)楸彼帷?纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的突變體，命名為hIL-23R-CHR-Wl，其氨基酸序列見序列表9。本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供hIL-23R_CHR區(qū)第182位谷氨酰胺(Q)突變?yōu)楸彼?、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的突變體，命名為hIL-23R-CHR-Q，其氨基酸序列見序列表 10。本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供hIL-23R_CHR區(qū)第183位脯氨酸⑵突變?yōu)楸彼帷?纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的突變體，命名為hIL-23R-CHR-P，其氨基酸序列見序列表11。本發(fā)明的第八個(gè)目的是提供hIL-23R_CHR區(qū)第184位色氨酸(W)突變?yōu)楸彼帷?纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的突變體，命名為hIL-23R-CHR-W2，其氨基酸序列見序列表12。本發(fā)明的第九個(gè)目的是提供hIL-23R_CHR區(qū)第185位絲氨酸( 突變?yōu)楸彼帷?纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的突變體，命名為hIL-23R-CHR-S，其氨基酸序列見序列表 13。親和力實(shí)驗(yàn)證明8種hIL-23R-CHR突變體更易于與hIL_23結(jié)合，比hIL_23R_CHR 具有更強(qiáng)的親和力。本發(fā)明的第十個(gè)目的是提供hIL-23R_CHR重組質(zhì)粒的構(gòu)建，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(I)PCR反應(yīng)及其產(chǎn)物的鑒定、回收、純化以人白細(xì)胞cDNA文庫(kù)為模板，以上下游引物進(jìn)行PCR，選擇LA Taq，擴(kuò)增條件為 起始變性95°C 5min，然后執(zhí)行如下反應(yīng)條件95°C lmin,55°C 30s, 72°C Imin ；30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收并純化570bp片段。(2)TA 克隆純化后的PCR產(chǎn)物與pMD 18_T simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素(lOOyg/ml)的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，并進(jìn)行NcoI和B10I雙酶切鑒定。將 pMD18-T-hIL-23R-CHR重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。(3)pET32a-hIL-23R-CHR 的構(gòu)建、酶切、測(cè)序鑒定將構(gòu)建成功的pMD18-T-hIL-23R_CHR和pET3h分別用NcoI和XhoI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，并分別回收570bp的hIL-23R-CHR片段和線性化pET3h片段，兩者在 T4連接酶的作用下發(fā)生連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素(100 μ g/ ml)的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，并進(jìn)行NcoI和BioI雙酶切鑒定。將pET3h-hIL-23R-CHR重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。本發(fā)明的第十一個(gè)目的是提供hIL-23R_CHR重組質(zhì)粒的表達(dá)以及表達(dá)的融合蛋白的純化方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(l)pET32a-hIL-23R-CHR 融合蛋白表達(dá)將pET3^i-hIL-23R-CHR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，涂布于含氨芐青霉素(100yg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37°C烘箱中培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落至IOOml含氨芐青霉素(100yg/ml)的LB培養(yǎng)液中37°C放大培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至0D_為0. 8-1. O時(shí)加入 0. 2-1. OmM IPTG，16°C誘導(dǎo)培養(yǎng) 12h。4°C 8000rpm 離心 5min，收集菌體，然后用 0. 02M PB 洗滌1-3次。(2) pET32a-hIL-23R-CHR 融合蛋白純化將收集的菌體溶于平衡緩沖液中(PH7. 4-8. 0,0. 02M PB, 0. 5M NaCl，IOmM咪唑)， 500w,3s,間隔3s，4°C超聲lOmin。破菌完全的菌液較澄清，置超速冷凍離心機(jī)中12000rpm、 4°C離心20min。融合蛋白以天然的、可溶的結(jié)構(gòu)形式存在于上清中，超聲上清過(guò)0. 45μπι濾器后，緩慢加入Ni2+親和柱，以便使融合蛋白上的6個(gè)組氨酸標(biāo)簽與層析柱內(nèi)的Ni2+結(jié)合。 用10個(gè)柱體積的平衡液平衡后，用5個(gè)柱體積的洗滌緩沖液(ΡΗ7. 4-8. 0,0. 02Μ PB,0. 5Μ NaCl，30mM咪唑；PH7. 4-8. 0，0. 02M PB，0. 5MNaCl，IOOmM咪唑)分別過(guò)柱，洗去未結(jié)合的蛋白，然后用洗脫緩沖液(PH7. 4-8.0,0. 02M PB, 0. 5M NaCl，300mM咪唑)洗脫目的蛋白。


圖1是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。M :250bp DNA Ladder Marker ；1 :PCR 產(chǎn)物(570bp)圖 2 是 pMD18-T-hIL-23R_CHR 的 NcoI 和 XhoI 雙酶切鑒定圖。M :250bp DNA Ladder Marker ；l、2、3、4:pMD 18-T-hIL-23R-CHR/NcoI+XhoI (2600bp,570bp)圖 3 是 pET32a-hIL-23R_CHR 的 NcoI 和 XhoI 雙酶切鑒定圖。M :250bp DNA Ladder Marker ；1、2、3、4 :pET32a-hIL-23R-CHR/NcoI+XhoI(5400bp，570bp)圖4是表達(dá)、純化的融合蛋白經(jīng)15% SDS-PAGE分析圖。M 標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker ；1 :hIL-23R-CHR 誘導(dǎo)前全菌；2、3、4 :hIL_23R-CHR 誘導(dǎo)后全菌；5 純化后的 hIL-23R_CHR
圖 5 是 hIL-23R_CHR 蛋白的 Western blotting 分析圖。M 預(yù)染蛋白 Marker ；1 純化后的 hIL-23R_CHR ；2. pET32a 空質(zhì)粒
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解的是，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對(duì)本發(fā)明重組表達(dá)質(zhì)粒 hIL-23R-CHR及其制備方法的簡(jiǎn)單改造，都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1 :pET3h-hIL-23R-CHR重組質(zhì)粒的構(gòu)建(I)PCR反應(yīng)及其產(chǎn)物的鑒定、回收、純化以人白細(xì)胞cDNA文庫(kù)為模板，以上下游引物進(jìn)行PCR，上游5' -GCCCATGGCTCCGC CAGATATTCCTGATG-3 ‘ (NcoI)，下游5' -CAGCTCGAGATGAAAAAACGGTGAGCTCCA-3 ‘ (XhoI)， 其中CCATGG為NcoI酶切位點(diǎn)，CTCGAG為BioI酶切位點(diǎn)，選擇LA Taq,擴(kuò)增條件為起始變性95°C 5min，然后執(zhí)行如下反應(yīng)條件95°C lmin,55°C 30s, 72°C Imin ；30個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸lOmin，PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。如圖1所示，可見擴(kuò)增出570bp特異性的hIL-23R-CHR片段，回收并純化570bp片段。(2) TA 克隆純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素(lOOyg/ml)的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有氨芐青霉素(lOOyg/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，并進(jìn)行NcoI和BioI雙酶切鑒定。如圖2所示，陽(yáng)性克隆含有長(zhǎng)度約^OObp和570bp的兩條帶，陽(yáng)性克隆命名為 pMD18-T-hIL-23R-CHR,將 pMD18-T-hIL_23R-CHR 重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。(3)pET32a-hIL-23R-CHR 的構(gòu)建、酶切、測(cè)序鑒定將構(gòu)建成功的pMD18-T-hIL-23R-CHR和pET3h分別用NcoI和XhoI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，并分別回收570bp的hIL-23R-CHR片段和線性化pET3h片段，兩者在 T4連接酶的作用下發(fā)生連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素(100 μ g/ ml)的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有氨芐青霉素(100yg/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，并進(jìn)行NcoI和B10I雙酶切鑒定。如圖3所示，陽(yáng)性克隆含有長(zhǎng)度約為MOObp和570bp的兩條帶，說(shuō)明hIL-23R-CHR成功插入到pET3h中，陽(yáng)性克隆命名為 pET3h-hIL-23R-CHR，將pET3h-hIL_23R-CHR重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，證實(shí)所構(gòu)建的片段即為pET3h-hIL-23R-CHR的編碼基因。實(shí)施例2 :hIL-23R-CHR-A突變體的構(gòu)建以pMD18-T-hIL-23R_CHR質(zhì)粒為模板，以上下游引物進(jìn)行PCR，上游 5' -GTGAGATGTCAAGAAGCAGG-3‘，下游5' -AAGGCTGCCAGTACCTTTTG-3‘，擴(kuò)增條件為起始變性95°C 5min，然后執(zhí)行如下反應(yīng)條件95°C lmin,55°C 30s, 72°C 5min ；30個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸10min，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收后，對(duì)其5'端進(jìn)行磷酸化處理使自連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素(lOOyg/ml)的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。
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實(shí)施例3 :hIL-23R-CHR-G突變體的構(gòu)建以pMD18-T-hIL-23R_CHR質(zhì)粒為模板，以上下游引物進(jìn)行PCR，上游 5' -GAGTTTAGAGACAGGAGAAG-3‘，下游5' -TGAGGTGAGATACTGTTGCT-3‘，擴(kuò)增條件為起始變性95°C 5min，然后執(zhí)行如下反應(yīng)條件95°C lmin,55°C 30s, 72°C 5min ；30個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸10min，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收后，對(duì)其5'端進(jìn)行磷酸化處理使自連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素(lOOyg/ml)的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。實(shí)施例4 :hIL-23R-CHR-R突變體的構(gòu)建以pMD 18-T-hIL-23R-CHR質(zhì)粒為模板，以上下游引物進(jìn)行PCR，上游 5 ‘ -AGAAGAAGAGCAACGGTATC-3 ‘，下游5 ‘ -AATATAGCTTGAGGTGA-3 ‘，擴(kuò)增條件為起始變性95°C 5min，然后執(zhí)行如下反應(yīng)條件95°C lmin，55°C 30s, 72 °C 5min ；30個(gè)循環(huán)， 最后72°C延伸lOmin，PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收后，對(duì)其5 ‘端進(jìn)行磷酸化處理使自連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行二次PCR，上游5 ‘ -CAAGGAGTACTTGGTTCGGG-3 ‘，下游 5' -TAGTGCGTTTGCTGCTTGGA-3‘，擴(kuò)增條件為起始變性95°C 5min，然后執(zhí)行如下反應(yīng)條件95°C lmin，55°C 30s,72°C 5min ；30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收后，對(duì)其5'端進(jìn)行磷酸化處理使自連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素(100 P g/ml)的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。實(shí)施例5 :hIL-23R-CHR-ffl突變體的構(gòu)建以pMD18-T-hIL-23R-CHR質(zhì)粒為模板，以上下游引物進(jìn)行PCR，上游5' -AAAGGTA C-X-CAGCCTTGGAGTTCACTG-3 ‘，下游5' -TCAGGTGTTTTATGAAAAAA-3 ‘，其中 X 為 GCC、GTG、 CTA、ATC、ATG、GAC、GAG、AAG, CGA, GGA, AGC, ACC, TGC, AAC 或 CAG,擴(kuò)增條件為起始變性 950C 5min，然后執(zhí)行如下反應(yīng)條件95°C lmin，55°C 30s, 72°C 5min ；30個(gè)循環(huán)，最后72°C 延伸lOmin，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收后，對(duì)其5'端進(jìn)行磷酸化處理使自連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素(lOOyg/ml)的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。實(shí)施例6 :hIL-23R-CHR-Q突變體的構(gòu)建以pMD18-T-hIL-23R-CHR質(zhì)粒為模板，以上下游引物進(jìn)行PCR，上游5 ‘ -AAAGG TACTGG-X-CCTTGGAGTTCACTG-3 ‘，下游5 ‘ -TCAGGTGTTTTATGAAAAAA-3 ‘，其中 X 為 GCC、 GTG、CTA、ATC、ATG、GAC、GAG、AAG、CGA、GGA、AGC、ACC、TGC 或 AAC,擴(kuò)增條件為起始變性 950C 5min，然后執(zhí)行如下反應(yīng)條件95°C lmin，55°C 30s, 72°C 5min ；30個(gè)循環(huán)，最后72°C 延伸lOmin，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收后，對(duì)其5'端進(jìn)行磷酸化處理使自連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素(lOOyg/ml)的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。
實(shí)施例7 :hIL-23R-CHR-P突變體的構(gòu)建以pMD18-T-hIL-23R-CHR質(zhì)粒為模板，以上下游引物進(jìn)行PCR，上游5' -AAAGGTA CTGGCAG-X-TGGAGTTCACTG-3 ‘，下游5' -TCAGGTGTTTTATGAAAAAA-3 ‘，其中 X 為 GCC、GTG、 CTA、ATC、ATG、GAC、GAG、AAG, CGA, GGA, AGC, ACC, TGC, AAC 或 CAG,擴(kuò)增條件為起始變性 950C 5min，然后執(zhí)行如下反應(yīng)條件95°C lmin，55°C 30s, 72°C 5min ；30個(gè)循環(huán)，最后72°C 延伸lOmin，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收后，對(duì)其5'端進(jìn)行磷酸化處理使自連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素(lOOyg/ml)的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。實(shí)施例8 :hIL-23R-CHR-W2突變體的構(gòu)建以pMD18-T-hIL-23R-CHR質(zhì)粒為模板，以上下游引物進(jìn)行PCR，上游5' -AAAGGTA CTGGCAGCCT-X-AGTTCACTG-3 ‘，下游5' -TCAGGTGTTTTATGAAAAAA-3 ‘，其中 X 為 GCC、GTG、 CTA、ATC、ATG、GAC、GAG、AAG, CGA, GGA, AGC, ACC, TGC, AAC 或 CAG,擴(kuò)增條件為起始變性 95°C 5min，然后執(zhí)行如下反應(yīng)條件95°C lmin，55°C 30s, 72°C 5min ；30個(gè)循環(huán)，最后72°C 延伸lOmin，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收后，對(duì)其5'端進(jìn)行磷酸化處理使自連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素(lOOyg/ml)的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。實(shí)施例9 :hIL-23R-CHR-S突變體的構(gòu)建以pMD18-T-hIL-23R-CHR質(zhì)粒為模板，以上下游引物進(jìn)行PCR，上游5 ‘ -AAAGG TACTGGCAGCCTTGG-X-TCACTG-3 ‘，下游5 ‘ -TCAGGTGTTTTATGAAAAAA-3 ‘，其中 X 為 GCC、 GTG、CTA、ATC、ATG、GAC、GAG、AAG、CGA、GGA、ACC、TGC、AAC 或 CAG,擴(kuò)增條件為起始變性 950C 5min，然后執(zhí)行如下反應(yīng)條件95°C lmin，55°C 30s, 72°C 5min ；30個(gè)循環(huán)，最后72°C 延伸lOmin，PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收后，對(duì)其5 ‘端進(jìn)行磷酸化處理使自連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素(lOOyg/ml)的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。實(shí)施例10 :pET32a-hIL-23R-CHR融合蛋白的表達(dá)純化方法(l)pET32a-hIL-23R-CHR 融合蛋白表達(dá)將pET3^i-hIL-23R-CHR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，涂布于含氨芐青霉素(100yg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37°C烘箱中培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落至IOOml含氨芐青霉素(100yg/ml)的LB培養(yǎng)液中37°C放大培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至0D_為0. 8-1. O時(shí)加入 0. 2-1. OmM IPTG，16°C誘導(dǎo)培養(yǎng) 12h。4°C 8000rpm 離心 5min，收集菌體，然后用 0. 02M PB 洗滌1-3次。(2) pET32a-hIL-23R-CHR 融合蛋白純化將收集的菌體溶于平衡緩沖液中(PH7. 4-8. 0,0. 02M PB, 0. 5M NaCl，IOmM咪唑)， 500w,3s,間隔3s，4°C超聲lOmin。破菌完全的菌液較澄清，置超速冷凍離心機(jī)中12000rpm、 4°C離心20min。融合蛋白以天然的、可溶的結(jié)構(gòu)形式存在于上清中，超聲上清過(guò)0. 45μπι濾器后，緩慢加入Ni2+親和柱，以便使融合蛋白上的6個(gè)組氨酸標(biāo)簽與層析柱內(nèi)的Ni2+結(jié)合。用10個(gè)柱體積的平衡液平衡后，用5個(gè)柱體積的洗滌緩沖液(PH7. 4-8. 0,0. 02M PB,0. 5M NaCl，30mM咪唑；PH7. 4-8. 0，0. 02M PB，0. 5MNaCl，IOOmM咪唑)分別過(guò)柱，洗去未結(jié)合的蛋白，然后用洗脫緩沖液(PH7. 4-8.0,0. 02M PB, 0. 5M NaCl，300mM咪唑)洗脫目的蛋白。(3)融合蛋白經(jīng) 15% SDS-PAGE 分析和 Western blotting 分析收集洗脫峰值的洗脫液進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳，雙份點(diǎn)樣，將左側(cè)凝膠考馬斯亮藍(lán)R250液中染色，右側(cè)凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜池，取出膜，用5%的脫脂奶粉封閉過(guò)夜，加入鼠抗多聚組氨酸抗體(1 1000-1 5000)室溫孵育池，加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG(l 1000-1 5000)室溫孵育池，然后用DAB顯色。將純化后的融合蛋白透析除鹽， 凍干后，置于-20°C保存以備用。pET3h-hIL-23R-CHR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，在 IPTG誘導(dǎo)下，能穩(wěn)定而高效地表達(dá)hIL-23R-CHR融合蛋白，經(jīng)15% SDS-PAGE分析和^festern blotting分析表明， 在40KDa出現(xiàn)hIL-23R-CHR目標(biāo)表達(dá)條帶，見圖4和圖5所示。實(shí)施例11 :pET32a-hIL-23R-CHR融合蛋白親和力測(cè)定將純化的hIL-23R-CHR、hIL_23R-CHR-A、hIL-23R-CHR_G、hIL-23R_CHR-R、 hIL-23R-CHR-Wl、hIL-23R-CHR-Q、hIL-23R-CHR-P、hIL-23R-CHR-W2 或 hIL_23R-CHR-S 與商業(yè)化的hIL-23按照不同摩爾比于37°C烘箱孵育2h，將hIL_23R_CHR或者8種hIL_23R_CHR 突變體、hIL-23以及兩者混合物分別上樣，進(jìn)行非變性凝膠電泳，然后銀染檢測(cè)，結(jié)果顯示， 當(dāng)hIL-23R-CHR與hIL-23摩爾比為10 1時(shí)，在高于兩者條帶之上，新生成一條明顯的條帶，分析該條帶即為兩者結(jié)合而形成的新的復(fù)合物，當(dāng)hIL-23R-CHR-A與hIL_23摩爾比為 8 l，hIL-23R-CHR-G 與 hIL-23 摩爾比為 8 l，hIL_23R-CHR-R 與 hIL-23 摩爾比為 6 1， hIL-23R-CHR-ffl 與 hIL-23 摩爾比為 6 1，hIL_23R-CHR-Q 與 hIL-23 摩爾比為 5 1， hIL-23R-CHR-P 與 hIL-23 摩爾比為 2 1，hIL_23R-CHR-W2 與 hIL-23 摩爾比為 4 1， hIL-23R-CHR-S與hIL-23摩爾比為4 1時(shí)，可見復(fù)合物的形成，說(shuō)明8種hIL_23R_CHR突變體更易于與hIL-23結(jié)合，比hIL-23R-CHR具有更強(qiáng)的親和力。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白pET3h-hIL-23R-CHR，其特征在于包含有基因片段hIL-23R-CHR，其基因序列見序列表SEQ ID NO :1，氨基酸序列見序列表SEQ ID NO :2。
2.一種hIL-23R-CHR突變體，命名為hIL_23R-CHR_A，其特征為天然hIL_23R_CHR區(qū)第 176位蘇氨酸(T)突變?yōu)楸彼?A)，其基因序列見序列表SEQ ID NO :3，氨基酸序列見序列表 SEQ IDNO :4ο
3.一種hIL-23R-CHR突變體，命名為hIL_23R-CHR_G，其特征為天然hIL_23R_CHR區(qū)第 45位谷氨酸(E)突變成甘氨酸(G)，其基因序列見序列表SEQ ID NO :5，氨基酸序列見序列表 SEQ ID NO :6。
4.一種hIL-23R-CHR突變體，命名為hIL-23R-CHR-R，其特征為天然hIL_23R_CHR區(qū)第 49位谷氨酰胺(Q)突變?yōu)榫彼?R)，第68位賴氨酸(K)突變?yōu)楣劝彼?E)，第72位色氨酸(W)突變?yōu)榫彼?R)，其基因序列見序列表SEQ ID NO :7，氨基酸序列見序列表SEQ ID NO :8。
5.一種hIL-23R-CHR突變體，命名為hIL_23R-CHR-Wl，其特征為天然hIL_23R_CHR區(qū)第181位色氨酸(W)突變?yōu)楸彼?、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、 賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，其氨基酸序列見序列表 SEQ ID NO :9ο
6.一種hIL-23R-CHR突變體，命名為hIL_23R_CHR-Q，其特征為天然hIL_23R_CHR區(qū)第 182位谷氨酰胺(Q)突變?yōu)楸彼?、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、 賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺，其氨基酸序列見序列表SEQ ID NO :10。
7.一種hIL-23R-CHR突變體，命名為hIL-23R-CHR-P，其特征為天然hIL_23R_CHR區(qū)第 183位脯氨酸(P)突變?yōu)楸彼?、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，其氨基酸序列見序列表 SEQ ID NO =Ilo
8.一種hIL-23R-CHR突變體，命名為hIL_23R-CHR-W2，其特征為天然hIL_23R_CHR區(qū)第184位色氨酸(W)突變?yōu)楸彼?、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、 賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，其氨基酸序列見序列表 SEQ ID NO :12ο
9.一種hIL-23R-CHR突變體，命名為hIL_23R-CHR_S，其特征為天然hIL_23R_CHR區(qū)第 185位絲氨酸( 突變?yōu)楸彼?、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，其氨基酸序列見序列表SEQ ID NO :13。
10.權(quán)利要求書1、2、3、4、5、6、7、8和9中所述9種蛋白用于制備治療自身免疫性疾病的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET32a-hIL-23R-CHR，并通過(guò)PCR法獲得了8種hIL-23R-CHR突變體，突變體比天然形式具有更高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和活性，可用于自身免疫性疾病的治療。本發(fā)明還提供了該重組質(zhì)粒的構(gòu)建以及產(chǎn)物的純化方法。
文檔編號(hào)A61K38/17GK102206667SQ20111009627
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月18日
發(fā)明者姚文兵, 朱玥, 王辰, 羅成, 郭薇, 高向東 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)