專利名稱：甘露醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘露醇的新用途，尤其是甘露醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，在抗腫瘤研究中，誘導癌細胞的凋亡是一個重要的途徑，促進腫瘤細胞凋亡可達到腫瘤縮小，癌癥消退的目的，如傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物順鉬、美法倫等均能刺激細胞線粒體凋亡途徑，引發(fā)凋亡。此種方式比采用殺傷腫瘤細胞的治療方式有明顯的優(yōu)越性，因為抗腫瘤藥物若能大量的誘發(fā)腫瘤細胞的凋亡，激活其自身的程序性死亡過程，將會避免因大量細胞壞死而釋放細胞內(nèi)物質(zhì)引起的各種副作用，減輕化療對正常細胞的損傷，延長患者的生存期。然而，至今尚未篩選出能誘發(fā)腫瘤細胞大量凋亡的抗腫瘤藥。中藥誘導腫瘤細胞凋亡多為體外實驗研究，體內(nèi)實驗較少，基本上處于初級研究階段。研究表明與細胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基因都參與對細胞凋亡的調(diào)控，其中研究較多的有Bcl-2家族、細胞色素C、抑癌基因p53、Ice蛋白酶以及hs/APO-1等。因此，以上述細胞凋亡的調(diào)控基因為靶基因，尋找在引發(fā)細胞凋亡作用中具有區(qū)別腫瘤細胞及正常細胞(即能引發(fā)腫瘤細胞凋亡而對正常細胞無反應(yīng))能力的藥物是近年來各國科學家努力的方向和抗腫瘤藥物研究的新亮點。在傳統(tǒng)的非抗癌藥物中，科學家發(fā)現(xiàn)其中有一些具有可引起細胞凋亡的作用，這可能成為研發(fā)新的抗腫瘤藥物的途徑。然而，已發(fā)現(xiàn)的具有引起細胞凋亡作用的非抗癌藥物，僅僅在實驗室中得到證實，且尚不能誘發(fā)大量腫瘤細胞的凋亡，在臨床上尚未真正用于治療腫瘤。甘露醇(Marmitol)是一種己六醇，傳統(tǒng)醫(yī)藥用作良好的利尿劑，也是降低顱內(nèi)壓、眼內(nèi)壓及治療腎病的藥物。常用制劑甘露醇注射液作為高滲透降壓藥，是臨床搶救特別是腦部疾患搶救常用的一種藥物，具有降低顱內(nèi)壓藥物所要求的降壓快、療效準確的特點。 國內(nèi)外未見甘露醇是否具有誘導癌細胞凋亡作用的報道，也沒有將甘露醇用于抗腫瘤治療的臨床應(yīng)用先例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種甘露醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，特別是使用特定濃度的甘露醇注射液治療肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、胃腺癌等。為解決上述技術(shù)問題本發(fā)明采用如下技術(shù)方案甘露醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。上述腫瘤是肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、胃腺癌。肺癌是肺鱗癌、肺腺癌。上述抗腫瘤藥物為甘露醇注射液。上述甘露醇注射液的質(zhì)量濃度為10% 19%。上述甘露醇注射液的質(zhì)量濃度為13% 17%。
發(fā)明人通過科學實驗發(fā)現(xiàn)甘露醇具有抗腫瘤活性，尤其是特定濃度的甘露醇注射液具有明顯引起細胞凋亡的作用。通過采用多項細胞凋亡檢測技術(shù)及檢測凋亡相關(guān)基因 bcl-2、kix，證實特定濃度甘露醇可誘導人多種癌細胞株明顯癌細胞凋亡，并掌握了其與濃度、時間的效應(yīng)關(guān)系，初步闡明其可能機理，而且，發(fā)明人已將研究結(jié)果用于腫瘤病人治療并取得明顯的療效，這些為甘露醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用及其臨床推廣提供了理論依據(jù)和實際病例。同時，本發(fā)明為科學廉價地尋找高效低毒的誘導腫瘤細胞凋亡的藥物開辟了新的思路，極具科研意義。


圖1是48小時MTT濃度-抑制率曲線圖。圖 2 是 7 天MTT 時間-抑制率曲線圖，圖中120ug/ul，240ug/ul，360ug/ul，480ug/ ul，5100ug/ul，6120ug/ul。圖3是7天MTT濃度-抑制率曲線圖，圖中1 一天，2 二天，3三天，4四天，5五天， 6六天，7七天。圖4是7天化學發(fā)光時間-抑制率曲線圖。圖5是對照組透射電鏡圖。圖6是對照組透射電鏡圖。圖7是M小時組透射電鏡圖。圖8是M小時組透射電鏡圖。圖9是48小時組透射電鏡圖。圖10是48小時組透射電鏡圖。圖11是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果對照1組圖。圖12是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果對照2組圖。圖13是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果對照3組圖。圖14是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果0%組圖。圖15是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果5%組圖。圖16是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果9%組圖。圖17是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果13%組圖。圖18是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果17%組圖。圖19是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果20%組圖。圖20是早期+晚期凋亡細胞與劑量關(guān)系圖。圖21是晚期凋亡和壞死細胞與劑量關(guān)系圖。
具體實施例方式實施例1甘露醇抗腫瘤的基礎(chǔ)實驗研究(肺癌)1實驗材料1. 1 材料1. 1. 1細胞株SPC-A-1人肺癌細胞系引自上海腫瘤研究所。1. 1. 2試劑=RPMI 1640、胰蛋白酶購自Gibcol BRL公司；新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；碳酸氫鈉(分析純)為河北磁州制藥廠生產(chǎn)；青霉素鈉和硫酸鏈霉素為哈藥集團制藥總廠生產(chǎn)；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品； ATP試劑盒(ATP提取液、熒光素-熒光酶、稀釋液等)為德國DCS公司產(chǎn)品；檸檬酸鈉為廣州化學試劑廠生產(chǎn)；碘化丙啶(PI)、RnaseA為Sigma公司產(chǎn)品；甘露醇注射液購自廣西南寧百會藥業(yè)集團有限公司。1. 1. 3器材=CO2培養(yǎng)箱(日本HERAEUS)；倒置顯微鏡(日本NIKON)；全自動酶標儀(芬蘭DENLEY DRAGON MK-2型)；自發(fā)光板式分析儀(德國BETH0LD)；流式細胞儀(美國BECKMAN)；透射電鏡。2實驗方法及觀察指標2. 1細胞培養(yǎng)5% CO2培養(yǎng)箱，用含10%新生牛血清，青霉素、鏈霉素各IX 105U/L 及NaHCO3調(diào)PH值至7. 2-7. 4的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細胞進行實驗。2. 2采用MTT法測定細胞抑制率將濃度為2 X 104/ml的細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔體積100 μ L。細胞貼壁后，分別加入1-150 μ g/μ 1濃度的甘露醇，對照組不加藥，只加相應(yīng)體積的培養(yǎng)基，同時設(shè)復(fù)孔，37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)48小時后，每孔加入20 μ 1 ΜΤΤ，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，加入100 μ 1 DMS0，振蕩混勻，用全自動酶標儀比色，492nm 波長處測定各孔的吸光度A值，計算平均值，并按下列公式計算細胞生長抑制率細胞生長抑制率(％)=(對照組A-實驗組A)/對照組AX100% ；同方法取20、40、60、80、100、 120 μ g/μ 1濃度的甘露醇，對照組不加藥，只加相應(yīng)體積的培養(yǎng)基，同時設(shè)復(fù)孔，分別培養(yǎng) 7天，計算出每天不同濃度的抑制率。2. 3采用化學發(fā)光法測定細胞抑制率將濃度為2Χ 104/ml的細胞懸液接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔體積100 μ 1。細胞貼壁后，加入48小時MTT結(jié)果中半數(shù)抑制濃度 (IC50)的甘露醇，對照組不加藥，只加相應(yīng)體積的培養(yǎng)基，同時設(shè)復(fù)孔，37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7天，每孔加入50μ IATP提取液，充分混勻，每孔吸出100 μ 1混合液加入另一個96孔板相應(yīng)的孔中，新板的每孔中加入20 μ 1熒光素-熒光酶，振蕩混勻，用自發(fā)光板式分析儀檢測每孔的值，然后計算平均值，并按下列公式計算細胞生長抑制率細胞生長抑制率(％)=(對照組-實驗組)/(對照組-空白組)Χ100%。2. 4流式細胞儀分析細胞周期2.4. IPI染液的配制高精度天平上精確稱取PI 5mg, RnaseA 10mg、拘櫞酸鈉 0. 1 g，溶解于1 OOml滅菌生理鹽水中。精確吸取NP-400. 3ml加入上液中，搖勻，4 °C下避光保存。2. 4. 2流式細胞儀分析細胞周期方法收集培養(yǎng)細胞，于PBS中洗兩次，然后按 (1-2) XlO6Ail加入70%冰乙醇并混勻，于4°C下固定過夜。檢測時標本以lOOOr/min離 5min，;3mlPBS重懸5min，以300目篩網(wǎng)過濾細胞懸液以除去粘連成團的細胞群，再于IOOOr/ min下離心5min，棄去上清液，加入PI染液Iml/管，4°C下避光30min。取48小時MTT結(jié)果中的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)，分為24、48小時兩組和對照組，共三組，用流式細胞儀進行細胞周期分析，收集數(shù)據(jù)，在MultiCycle分析軟件進行細胞周期的分析，分別計算&、S,G2/M期的相對比例。2. 5透射電鏡檢測收集培養(yǎng)細胞，少量PBS混懸后移入塑料錐形離心管中，在 1000-1500r/min離心5-lOmin，棄去上清液，加入新生牛血清1_2滴，然后用吸管吹散離心物使其混合，離心3-5min后，盡量吸棄上層多余的新生牛血清；沿管壁緩慢加入戊二醛固
5定液，4°C下預(yù)固定30min，用細針沿管壁在標本周圍輕輕劃一圈，使固定液充分滲入底部， 并繼續(xù)固定至少2小時，取48小時MTT結(jié)果中的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)，分為M、48小時兩組和對照組，共三組，按常規(guī)電鏡包埋步驟處理。2. 6統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS10. 0軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料的比較采用t檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。3實驗結(jié)果3. 1采用MTT法測定細胞抑制率結(jié)果顯示48小時內(nèi)，在1-150 μ g/μ 1濃度范圍時甘露醇可抑制肺癌細胞的增殖活性，其抑制作用隨濃度的增高而增強，7天內(nèi)，隨著濃度和時間的增長，抑制率也不斷增加。見圖1、2、3。3. 2采用化學發(fā)光法測定細胞抑制率結(jié)果顯示取48小時MTT結(jié)果中的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)時，作用7天，甘露醇可抑制肺癌細胞的增殖活性，并且抑制作用隨時間的延長而增強，見圖4。3. 3流式細胞儀分析細胞周期結(jié)果顯示取48小時MTT結(jié)果中的半數(shù)抑制濃度 (IC50)時，作用Μ、48、72小時組細胞周期停止在^+M期的較對照組明顯增多，見表1。表1甘露醇不同處理時間對細胞周期的影響
處理時間 G,(%) S(%)G2/M(%)
對照53. 337. 19. 6
2445. 740. 913. 44854. 527. 817. 67261. 126. 112. 83. 4透射電鏡檢測結(jié)果顯示取48小時MTT結(jié)果中的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)時，作用 M小時組電鏡下可見細胞膜、核膜完整，核仁較清楚，胞質(zhì)中較多脂滴，可見凋亡小體，作用 48小時組電鏡下可見細胞凋亡較明顯，大量凋亡小體，而對照組細胞電鏡下可見符合腫瘤細胞的特點，核大，見圖5至圖10。圖5、6為對照組可見細胞核大，核漿比例失調(diào)，核仁較清楚，胞質(zhì)中較多脂滴；圖7、8為M小時組可見細胞核膜完整，可見凋亡小體圖9、10為48 小時組可見大量凋亡小體。實施例2特定濃度甘露醇誘導肺腺癌細胞凋亡及機理的研究(肺腺癌)1材料和方法1. 1主要試劑及儀器DMEM(高糖)培養(yǎng)液(美國hyclone公司賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司分裝)，胰蛋白酶、新生小牛血清(FBS購自杭州四季青生物有限公司)，20%甘露醇(購自安雙鶴藥業(yè)有限公司)，Giemsa染色試劑盒(由廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗中心提供)，細胞凋亡hoechst 33342試劑盒(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)細胞凋亡Dapi染色試劑盒、流式細胞儀試劑盒(均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)、Bcl-2檢測試劑盒(購自福州邁新生物科技發(fā)展有限公司)，戊二醇、透射電子顯微鏡由廣西醫(yī)科大學電鏡室提供。CK41型倒置顯微鏡(日本Olympus)、照相系統(tǒng)(日本 Nikon 72000U倒置顯微鏡及DS-5MC高分辨率CXD數(shù)碼照相500萬像數(shù))，由廣西大學國家重點實驗室提供，流式細胞儀(美國BD公司FACSCalibur)由廣西壯族自治人民醫(yī)院實驗中心提供并協(xié)助檢測。1. 2細胞培養(yǎng)H1299細胞株為人肺腺癌細胞，由廣西腫瘤防治研究所潘弘博士惠贈。該細胞呈長梭形、葉形或多角形，貼壁生長，細胞質(zhì)飽滿，生長舒展，相鄰細胞生長融合成片。取稀釋成2X 104/ml處于對數(shù)生長期的細胞懸液，培養(yǎng)于37°C含5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)液為含10%新生小牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的DMEM (高糖)培養(yǎng)液，0. 25%胰蛋白酶消化傳代，CK41型倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)。1. 3 方法(I)Giemsa染色觀察細胞凋亡形態(tài)將生長良好狀態(tài)細胞放入預(yù)先放取處于生長良好的H1299細胞懸浮液，加入預(yù)先放置有蓋玻片的六孔板，放到37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，讓細胞爬片生長，待其長到85 % 90 %，分別加入不同濃度的甘露醇(O %，5 %，9 %，13 %，17 %， 20% )，培養(yǎng)48小時，取出蓋玻片，PBS洗2次，甲醇固定5min，Giemsa染色15min，晾干后中性樹脂封片，顯微鏡(日本Nikon 72000U倒置顯微鏡及DS-5MC高分辨率C⑶數(shù)碼照相 500萬像數(shù)400倍)下觀察拍照細胞凋亡的特性變化。(2)細胞凋亡Dapi染色觀察細胞核凋亡小體取處于生長良好的H1299細胞別加入含不同濃度0%、5%、9%、13%、17%、20%甘露醇-:01^11(高糖)培養(yǎng)液(含10% FBS) IOml0繼續(xù)培養(yǎng)48小時，PBS洗滌2次，0. 25%胰蛋白酶消化3min，立即加入DMEM(高糖)培養(yǎng)液(10% FBQlOml終止消化，離心，棄上清，PBS洗滌2次，再離心，棄上清，后用 PBS稀釋制成細胞懸液(10萬個細胞/lml)，將細胞懸液500ul放入打靶固定離心管離心 (8000r/min,5min,)到載玻片上，干燥，無水乙醇固定，再干燥。然后在避光條件下按細胞凋亡Dapi染色盒說明書染色，PBS在玻璃缸內(nèi)浸泡洗滌3次，每次15min，再干燥，晾干后中性數(shù)膠封片，熒光顯微鏡以340/380紫外光激發(fā)及DS-5MC高分辨率CCD數(shù)碼照相400倍) 下觀察、拍照細胞核凋亡小體情況。細胞凋亡Dapi染色玻片4°C避光保存。結(jié)果判斷細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變分為三期1期的細胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased)，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；IIa期細胞核的染色質(zhì)高度凝集、邊緣化；nb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。(3)細胞凋亡hoechst 33342試劑染色觀察細胞核凋亡小體步驟與( 相同，然后在避光條件下按細胞凋亡hoechst 33342試劑盒說明書染色，PBS在玻璃缸內(nèi)浸泡洗滌3 次，每次15min，再干燥，晾干后中性數(shù)膠封片，熒光顯微鏡以340/380紫外光激發(fā)及DS-5MC 高分辨率CCD數(shù)碼照相400倍)下觀察、拍照細胞核凋亡小體情況。細胞凋亡hoechst 33342試劑染色玻片4°C避光保存。(4)透射電子顯微鏡觀察步驟與(2)相同，離心，棄上清，PBS洗滌2次，移入 1. 5EP管再離心，棄上清，用戊二醇固定后透射電子顯微鏡下觀察凋亡細胞形態(tài)。結(jié)果判斷凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡I期(pro-apoptosis nuclei) 的細胞核的染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴(cavitations)的空泡結(jié)構(gòu)；IIa期細胞核的染色質(zhì)高度凝集、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。(5)流式細胞儀檢測細胞的凋亡步驟與( 相同，收集所有的懸浮細胞分別倒入標有0%，5%， 9%,13%,17%, 20%的離心管(IOml)，離心2000r/2min,棄去上清液，用PBS洗2次，再離心2000r/2min，棄清液，重懸，離心2000r/2min，再重懸，細胞計數(shù)(lX106)/ml，按表1加入相應(yīng)試劑，避光、放入冰浴在Ih內(nèi)上FACSCalibur進行流式細胞術(shù)定量檢測，結(jié)果見表2。
表2流式細胞儀檢測細胞的凋亡結(jié)果
權(quán)利要求
1.甘露醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤是肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、 胃癌、胃腺癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述肺癌是肺鱗癌、肺腺癌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤藥物為甘露醇注射液。
5 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述甘露醇注射液的質(zhì)量濃度為10% 19%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述甘露醇注射液的質(zhì)量濃度為13% 17%。
全文摘要
本發(fā)明公開了甘露醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，特別是使用特定濃度(10％～19％)的甘露醇注射液治療肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、胃腺癌等。傳統(tǒng)上甘露醇僅作為利尿劑、高滲透降壓藥等，發(fā)明人通過科學實驗發(fā)現(xiàn)甘露醇具有抗腫瘤活性，通過采用多項細胞凋亡檢測技術(shù)及檢測凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax，證實特定濃度甘露醇可誘導人多種癌細胞株明顯癌細胞凋亡，并掌握了與濃度、時間的效應(yīng)關(guān)系，初步闡明其可能機理，而且，發(fā)明人已將研究結(jié)果用于腫瘤病人治療并取得明顯的療效，這些為甘露醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用及其臨床推廣提供了理論依據(jù)和實際病例。
文檔編號A61P35/00GK102225059SQ20111009656
公開日2011年10月26日 申請日期2011年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月18日
發(fā)明者劉德森, 岳惠芬, 崔英, 左傳田, 李黃羿, 楊立, 梁新強, 歐超, 潘泓, 潘琪, 茅乃權(quán), 謝彤, 黃亞芬, 黃亞銘, 黃耀元, 黃鼎銘, 黎斌 申請人:廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所