專利名稱：一種抗凝溶栓雙功能融合蛋白的脂質(zhì)體制劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體地說是涉及新型抗凝溶栓雙功能融合蛋白——7jC 蛭素12肽和瑞替普酶抗凝溶栓雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)的脂質(zhì)體制劑及制備方法。
背景技術(shù)：
瑞替普酶(Ret印lase，r-PA)是人組織纖溶酶原激活劑(t_PA)的異構(gòu)體，是已 被用于臨床的第三代溶栓藥物。水蛭素(Hirudin) C末端的12肽(53飛4 aa)是水蛭素 具有最大抗凝活性所必需的最小肽段，其較小的分子量相對(duì)于水蛭素全長(zhǎng)蛋白來說更有利 于降低出血副作用。本研究室在前期工作中構(gòu)建表達(dá)了重組HV12p-rPA融合基因(專利 號(hào)ZL 2006 1 0022457. 8 CN1970574 B)。經(jīng)基因測(cè)序、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析、層析復(fù)性及純化、 體外生物學(xué)活性檢測(cè)以及動(dòng)物體內(nèi)藥效學(xué)研究，證實(shí)HV12p-rPA結(jié)構(gòu)正確且具有抗凝血 和溶栓雙重功能，表明該融合蛋白質(zhì)可作為一種潛在的兼具抗凝和溶栓效果的新藥。本研 究將HV12p-rPA制備成脂質(zhì)體劑型，以求進(jìn)一步提高靶向性和降低出血副作用為融合蛋白 HV12p-rPA應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)，開發(fā)成為新一代溶栓藥物更近一步。脂質(zhì)體的制備方法常用的有薄膜法、逆相蒸發(fā)法、溶劑注入法和復(fù)乳法等。評(píng)價(jià) 脂質(zhì)體質(zhì)量的指標(biāo)有外觀、粒徑分布和包封率等，其中包封率是衡量脂質(zhì)體內(nèi)在質(zhì)量的一 個(gè)重要指標(biāo)。在脂質(zhì)體制備過程中，溫度、脂質(zhì)的組成及濃度、緩沖液PH、均質(zhì)化過程、蛋白 類藥物性質(zhì)等因素都會(huì)影響包封率和藥物的穩(wěn)定性。溫度越高使氯仿?lián)]發(fā)的時(shí)間加快，成 膜越快，但溫度過高會(huì)使成膜不均一而是包封率下降。用于制備脂質(zhì)體的磷脂有天然磷脂， 如豆磷脂、卵磷脂等；合成磷脂，如二棕櫚酰磷脂酰膽堿，二硬脂酰磷脂酰膽堿等。常用的 附加劑為膽固醇。本研究使用天然的大豆卵磷脂，價(jià)格較合成磷脂便宜，適于應(yīng)用于生產(chǎn)。 膽固醇也是兩親性物質(zhì)，與磷脂混合使用，可制得穩(wěn)定的脂質(zhì)體，其作用是調(diào)節(jié)雙分子層的 流動(dòng)性，減低脂質(zhì)體膜的通透性。為保證包封率，磷脂與膽固醇物質(zhì)量之比在7:廣1:1之 間，具體比例為多少需要根據(jù)優(yōu)化設(shè)計(jì)來確定；緩沖液PH常選擇pH7. 4，既保證了藥物的穩(wěn) 定性又保證了 HV12p-rPA的蛋白活性；薄膜分散法是一種經(jīng)典的制備方法，它可形成多室 脂質(zhì)體，經(jīng)超聲處理后得到小單室脂質(zhì)體，超聲處理的過程會(huì)使包封率降低和蛋白藥物活 性的受損，本研究發(fā)現(xiàn)在超聲功率為50w，時(shí)間分別在5min、10min、15min時(shí)，活性分別為 23810士 1. 69、23810士 1. 01、10291 士0. 67。HV12p_rPA 是分子量為 39. 6KB 的大分子蛋白藥 物，在制備脂質(zhì)體的過程中如何確保其生物活性的保留和較高的包封率是研究的重點(diǎn)。王向濤等在“血栓靶向尿激酶脂質(zhì)體的制備及其體內(nèi)溶栓效果”([J].藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2003，38 (3) :231-235)中通過逆向蒸發(fā)法制得的尿激酶脂質(zhì)體包封率僅為65%;張霞等在 “納豆激酶脂質(zhì)體的制備及其體外釋放”([J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2007年2月第42卷第2期) 中用薄膜分散法，將大豆卵磷脂與膽固醇溶于乙醚適量，25°C減壓旋蒸制得的納豆激酶脂 質(zhì)體包封率為M%，粒徑為235. 7nm。薄膜分散法是將磷脂和膽固醇溶于有機(jī)溶劑后，通過 揮干有機(jī)溶劑，使磷脂和膽固醇均一分散成膜，然后再加入水相混合成乳。此法可以避免有 機(jī)相與蛋白質(zhì)接觸，保證蛋白的結(jié)構(gòu)與生物活性不被破壞。
將已制備成乳的脂質(zhì)體通過超聲波、高壓乳勻器、擠壓器等方法，可以將粗制的 脂質(zhì)體均一且達(dá)到需要的粒徑。Jacques-Philippe等在“Protein en-capsulation in liposomes: efficiency depends on interactions between protein and phospholipids bilayer" ([J]· BMC Biotech-nology, 2002,2(9) : 1-8)利用擠出器均質(zhì)儀，隨著擠出次 數(shù)的增多，包封率發(fā)生了由高到低再由低到更高的變化過程。高壓均質(zhì)儀對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行 均質(zhì)的次數(shù)也會(huì)影響蛋白質(zhì)類藥物的活性Barnadas-Rodriguez R在“!^actors involved in the pro-duction of liposomes with a high-pressure homogenizer，，([J].Int J Pharm, 2001，213(1/2):175-186)。上述文獻(xiàn)所報(bào)道的脂質(zhì)體的制備方法，對(duì)于制備大分子蛋白質(zhì)藥物來說，除了包 封率不高以外，也會(huì)大大破壞蛋白質(zhì)的生物活性。這大大損耗了藥物量，降低了藥物利用 率，提高了成本，且得到的脂質(zhì)體保留活性不高，粒徑較大不利于靜脈注射。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，本發(fā)明提供了一種改良的薄膜分散-超聲法來制備HV12p_rPA的脂質(zhì)體， 以優(yōu)化的探頭超聲條件，探頭超聲用于減小均一脂質(zhì)體的粒徑是一種常用的方法，它操作 簡(jiǎn)單，且均一效果明顯，但超聲功率和時(shí)間過大、過長(zhǎng)都會(huì)破壞蛋白類藥物的活性，但是時(shí) 間過短又不能達(dá)到減小脂質(zhì)體粒徑的目的。本發(fā)明在探頭超聲50W，間隔2s，考察了 5min、 10min、15min三個(gè)水平，最后確立了 IOmin為最佳條件，既減小了脂質(zhì)體的粒徑又保證了 HV12p-rPA活性。均一減小粒徑，可以滿意地解決上述問題。本發(fā)明以改良的薄膜分散-超聲法制備HV12p_rPA脂質(zhì)體，先將大豆卵磷脂 與膽固醇，用于制備脂質(zhì)體的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂、卵磷脂等；合成磷脂，如二棕櫚酰 磷脂酰膽堿，二硬脂酰磷脂酰膽堿等。常用的附加劑為膽固醇。本研究使用天然的大豆卵 磷脂，價(jià)格較合成磷脂便宜，適于應(yīng)用于生產(chǎn)。膽固醇也是兩親性物質(zhì)，與磷脂混合使用，可 制得穩(wěn)定的脂質(zhì)體，其作用是調(diào)節(jié)雙分子層的流動(dòng)性，減低脂質(zhì)體膜的通透性。本實(shí)驗(yàn)所訴 的磷脂為大豆卵磷脂。以一定的量溶解于氯仿實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)氯仿的用量過少(<8mL)不能 溶解磷脂，導(dǎo)致無法均勻成膜；過多又使磷脂濃度降低，導(dǎo)致包封率不高。氯仿是薄膜分散 法常用的有機(jī)溶劑，除了氯仿以外，還可以選擇丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)所允許的有 機(jī)溶劑包括氯仿、丙酮、乙醚等所有有機(jī)溶劑。在35°C下減壓旋干成膜溫度越高使氯仿?lián)] 發(fā)的時(shí)間加快，成膜越快，但溫度過高會(huì)使成膜不均一而是包封率下降。薄膜分散法即是要 通過減壓來成膜。本專利所訴的溫度范圍為15、5°C，其中35°C為優(yōu)選的最佳溫度。加入 一定量緩沖液的體積一般要求在5mL到20mL之間的HV12p_rPA的磷酸鹽緩沖液緩沖液pH 常選擇pH7. 4，既保證了藥物的穩(wěn)定性又保證了 HV12p-rPA的蛋白活性。本專利所述的緩沖 液為一切無機(jī)鹽緩沖液，PH范圍為5.0~8. 0。水浴超聲成乳后，再通過篩選的探頭超聲條件 發(fā)明在探頭超聲50W，間隔k，考察了 5min、10min、15min三個(gè)水平，最后確立了 IOmin為最 佳條件，既減小了脂質(zhì)體的粒徑又保證了 HV12p-rPA活性。本專利所述的探頭超聲條件為 25W 100W，時(shí)間為5 15min均一減小粒徑。優(yōu)化方案如下
采用正交試驗(yàn)均一設(shè)計(jì)，對(duì)影響脂質(zhì)體包封率的因素進(jìn)行篩選，選出4個(gè)影響較大的 因素磷脂與膽固醇的比(A)、藥物濃度(B)、PBS體積(C)、水浴超聲時(shí)間(D)。把這四種因素作為主要考察因素，每個(gè)因素又取了三個(gè)水平，采用正交設(shè)計(jì)法L 9 (34)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以 包封率作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化脂質(zhì)體制備的處方和工藝。通過極差分析顯示最佳組合為大豆 卵磷脂與膽固醇的比為3 :1，藥物濃度為％ig/ml，HV12p-rPA磷酸緩沖液10ml，水浴超聲 IOmin0采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化探頭超聲時(shí)間，在50W，間隔2s下選出3個(gè)時(shí)間段5min、 1 Omiη、15miη，以HV12p_rPA脂質(zhì)體的包封率、粒徑、體外溶栓活性為考察目標(biāo)，篩選出 IOmin為最佳探頭超聲時(shí)間。以下通過實(shí)施例的具體實(shí)施方式
再對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但 不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想 情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段做出的各種替換或變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明 的范圍內(nèi)。


圖1為在透射電鏡下(X60 000)觀測(cè)到的HV12p_rPA脂質(zhì)體(實(shí)施例四)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一
對(duì)影響脂質(zhì)體包封率的因素進(jìn)行篩選，選出4個(gè)影響較大的因素大豆卵磷脂與膽固 醇的比(A)、藥物濃度(B)、PBS體積(C)、水浴超聲時(shí)間(D)。以這四種因素作為考察因素， 每個(gè)因素取三個(gè)水平，采用正交設(shè)計(jì)法L 9 (34)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。表1四因素三水平正交設(shè)計(jì)表
權(quán)利要求
1.一種抗凝溶栓雙功能融合蛋白的脂質(zhì)體制劑及制備方法，將由本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的水蛭 素12肽-瑞替普酶抗凝溶栓雙功能融合蛋白HV12p-rPA，通過改良的薄膜分散-超聲法將 其制備成脂質(zhì)體劑型，其特征在于將質(zhì)量比為7:廣1:1的磷脂和膽固醇完全溶解于醫(yī)藥中 可以接受的有機(jī)溶劑后，揮干溶劑，使磷脂和膽固醇均勻分散成膜，然后加入含有抗凝溶栓 雙功效融合蛋白(HV12p-rPA)的緩沖液(pH值為5. (Γ8. 0)，經(jīng)水浴超聲混合成乳狀液，經(jīng)探 頭超聲減小粒徑，最后得到HV12p-rPA脂質(zhì)體。
2.如權(quán)利要求1所述的HV12p-rPA的脂質(zhì)體，其特征在于以HV12p_rPA融合蛋白為原 料藥物制備脂質(zhì)體。
3.如權(quán)利要求1所述的HV12p-rPA脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于以磷脂或磷脂、膽固 醇為脂質(zhì)原料，有機(jī)溶劑可以是氯仿、丙酮、乙醇等醫(yī)藥中可以接受的有機(jī)溶劑。
4.如權(quán)利要求1所述的HV12p-rPA脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于先將磷脂、膽固醇 溶于有機(jī)溶劑旋干，加入含有HV12p-rPA的緩沖液水浴超聲成乳，經(jīng)探頭超聲減小均一粒徑。
5.如權(quán)利要求1至3所述的HV12p-rPA脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于磷脂與膽固 醇的質(zhì)量比為7:廣1:1，有機(jī)溶劑量為每60mg磷脂加10mL，在15 45°C下減壓IMI^a旋干成 膜，加入含有HV12p-rPA質(zhì)量濃度2、mg/mL的pH值為5. (Γ8. 0的緩沖液，緩沖液體積為 5m廣20mL，經(jīng)水浴超聲混合成乳狀液，水浴超聲時(shí)間為lOmin。
6.如權(quán)利要求1所述的HV12p-rPA脂質(zhì)體的備方法，其特征在于均一減小粒徑的方法 是探頭超聲法。
7.如權(quán)利要求6所述的均一減小粒徑的方法是探頭超聲法，其特征在于探頭超聲功 率為25W 50W，間隔2s，累計(jì)超聲5mirTl5min。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體地說是涉及一種抗凝溶栓雙功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞替普酶抗凝溶栓雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)的脂質(zhì)體制劑及制備方法。由本研究室構(gòu)建的抗凝溶栓雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定、表達(dá)、層析復(fù)性及純化和體外體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，已證明具有抗凝和溶栓的雙功效。本研究以其為原料藥，制備其脂質(zhì)體制劑，采用優(yōu)化的薄膜分散-探頭超聲法制備脂質(zhì)體，其特征是以磷脂與膽固醇比、蛋白藥濃度、緩沖液體積、水浴超聲時(shí)間為影響因素篩選最適合提高HV12p-rPA脂質(zhì)體包封率的處方，并且以探頭超聲進(jìn)一步減小均一其粒徑，制得粒徑在140~145nm可以用于靜脈注射的HV12p-rPA脂質(zhì)體。該方法制得的HV12p-rPA脂質(zhì)體包封率達(dá)90%以上，且體外溶栓活性和體外抗凝活性分別為23810IU·mg-1、414ATU·mg-1。
文檔編號(hào)A61K38/49GK102144974SQ20111009804
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者余蓉, 梁蘭, 鄧璇 申請(qǐng)人:四川大學(xué)