專利名稱：紫花牡荊素在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是紫花牡荊素用于制備鎮(zhèn)痛藥物的新用途。
背景技術(shù)：
疼痛是多種疾病的一個癥狀，它使患者感受痛苦，尤其是劇痛，還可能引起生理功能紊亂，甚至休克。因此，適當(dāng)?shù)貞?yīng)用藥物緩解疼痛，防止可能產(chǎn)生的生理功能紊亂是很必要的。緩解疼痛的藥物，按其藥理作用機(jī)制，可以分為兩大類一種是主要作用于中樞神經(jīng) 系統(tǒng)、能選擇性地消除或緩解疼痛的藥物。在鎮(zhèn)痛過程中，患者意識清醒，其他感覺不受影響，這類藥物稱為鎮(zhèn)痛藥(analgesics)。另一種是具有鎮(zhèn)痛、解熱和抗炎作用的藥物，對各種鈍痛(如頭痛、牙痛等)有效。典型的鎮(zhèn)痛藥為阿片生物堿類及其合成代用品，其特點是鎮(zhèn)痛作用強大，但反復(fù)應(yīng)用易于成癮，故又稱為成癮性鎮(zhèn)痛藥或麻醉性鎮(zhèn)痛藥。紫花牡荊素(Casticin-5,3' -dihydroxy-3,6,7,4 1 -tetramethoxyf lavon,PAME)是牡荊屬中多中藥材中的黃酮類成分，是中藥材蔓荊子中的黃酮成分。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
OH
^k/OCH3
H3CO^f^Y^OCH3 OH〇《中華人民共和國藥典》將紫花牡荊素作為蔓荊子生藥的鑒別成分，因此可以將其作為藥材和原料藥品質(zhì)評價的重要指標(biāo)性成分。紫花牡荊素主要存在于馬鞭草科牡荊屬多種植物中如蔓荊(Vitex trifolia L)、單葉蔓荊(Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham)、黃荊(Vitex negundo L)、牡荊(Vitex negundo var. cannabifolia(Sieb. et Zucc. )Hand.-Mazz.)等。而藥典收載的蔓荊子為馬鞭草科植物單葉蔓荊(Vitex trifolia var simplicifolia Cham.)或蔓荊(V. trifolia L.)的干燥果實，具有疏風(fēng)散熱、清利頭目的功效，歷代本草典籍均有記載。研究表明蔓荊植物主要含有揮發(fā)油、黃酮類(苷元及苷)、環(huán)烯醚萜(苷元及苷)、二萜(苷元及苷)、生物堿、留體等成分。其中紫花牡荊素作為其主要成分，能夠阻斷由組胺誘導(dǎo)的雄性豚鼠氣管的自發(fā)性收縮，通過穩(wěn)定細(xì)胞膜，從而抑制組胺從肥大細(xì)胞中的釋放，體外實驗中發(fā)現(xiàn)紫花牡荊素能夠選擇性地抑制小鼠T淋巴細(xì)胞的增生，能抑制腫瘤細(xì)胞系的生長，還具有抑制淋巴細(xì)胞增殖的活性，對淋巴細(xì)胞瘤有治療潛力(Gemini，A. ,Subagus,ff. , Ibnu, G. G. , Lukman, H. , Timmerman, H. , Rob Verpoorte. ,2002. Tracheospasmolyticactivity of Viteosin-A and Vitexcarpin isolated from Vitex trifolia. PlantaMed. 68，1047-1049)。紫花牡荊素能通過促使癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，并最終誘導(dǎo)其凋亡來發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增殖的抗癌活性(Kobayakawa, J. , Sato-Nishimori, F. , Moriyasu, M.,Matsukawa, Y.,2004.G2-M arrest and antimitotic activity mediated by Casticin，aflavonoid isolated from Viticis fructus(Vitex rotundifolia linne fil.). CancerLett. 208,59-64.)。對人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖活性有較強的抑制作用，呈劑量和時間依賴性；這種抑制作用與降低CyclinBl蛋白表達(dá)、活化P21蛋白有關(guān)(謝晶，白軍，盛習(xí)鋒，曹建國，謝宛玉.紫花牡荊素體外抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的研究.中國癌癥雜志，2010,20(6) =406-410)。紫花牡荊素還有較強的抗炎作用，對二甲苯所致小鼠耳廊腫脹、雞蛋清所致大鼠足腫脹以及醋酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性增加均有明顯的抑制作用(Lin S，Zhang H,Han T,ffu JZ,Rahman K, Qin LP. In vivo effect of casticin on acute inflammation. Journal of Chinese Integrative Medicine, 2007, 5 (5) I :573-576)。但至今未見紫花牡荊素具有鎮(zhèn)痛活性的的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為紫花牡荊素(PAME)提供一種治療疼痛癥狀的新用途。
本發(fā)明的紫花牡荊素制備方法如下I、制備紫花牡荊素提取液將PAME原藥材按常規(guī)用75%乙醇回流提取，得紫花牡荊素提取液；2、制備浸膏將上述提取液減壓濃縮，得浸膏；2、萃取2. I提取物浸膏混懸液的制備將浸膏去離子水分散，得提取物浸膏混懸液；2. 2石油醚萃取將上述混懸液中石油醚萃取，得石油醚萃取液；2. 3 二氯甲烷萃取在石油醚萃取液中加入二氯甲烷萃取得二氯甲烷萃取液；2. 4 濃縮將上述二氯甲烷萃取液減壓濃縮至呈浸膏狀，得到蔓荊子二氯甲烷提取部位；3、純化將上述二氯甲烷部位用95%醫(yī)用酒精加熱溶解后，放冷至室溫，0.45 iim濾膜過濾；濾液緩慢加入到已處理好的葡聚糖凝膠色譜柱中(Sephadex LH-20, O40X600mm),95 %醫(yī)用酒精洗脫，流速lBV/h，收集3-8BV洗脫液，分別用TLC及HPLC檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫花牡荊素集中于5-6BV洗脫液，并與一種綠色色素一起被洗脫下來。合并5-6BV洗脫液，減壓濃縮，得到黃綠色粉末，以少量95%醫(yī)用酒精淋洗，抽干，60°C減壓干燥24h至恒重，得紫花牡荊素黃色粉末。經(jīng)動物試驗，發(fā)現(xiàn)紫花牡荊素具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，因而可用于制備治療疼痛癥狀的藥物。本發(fā)明為制備新的鎮(zhèn)痛藥物提供了一種藥物來源。
具體實施方式
實施例I.紫花牡荊素的制備I、PAME藥材75 %乙醇提取液的濃縮取PAME原藥材(批號20081003) 100. 5克，置2000ml圓底燒瓶中，按照提取工藝要求，加75%乙醇1200ml，回流提取2h，放冷，過濾；濾渣繼續(xù)加75%乙醇1000ml，回流提取2h，放冷，過濾；兩次濾液合并，作為藥材提取液，共2100ml。上述提取液置IOOOml圓底燒瓶中，分次減壓濃縮，總體積濃縮至IOOml時，濃縮液呈浸膏狀，放冷至室溫待用。2、萃取2. I提取物的分散向上述浸膏中加入200ml去離子水，攪拌，稍加熱，靜置，放冷至室溫，傾去水層；繼以200ml X2次洗滌，傾去水層；最后，加入200ml去離子水分散提取物浸膏； 2. 2石油醚萃取上述浸膏混懸液中，含有部分色素，我們采取石油醚萃取的方法，去除部分色素及部分親脂性成分。向上述混懸液中加入200ml石油醚，振搖，靜置分層，分取石油醚層，TLC跟蹤，水層繼續(xù)以200ml石油醚萃?。唤?jīng)!1(跟蹤驗證，當(dāng)石油醚萃取四次后，石油醚萃取層已無明顯成分，故確定提取物石油醚萃取四次，每次200ml，即石油醚水層=I I萃取四次。2. 3 二氯甲烷萃取向上述石油醚萃取液中加入200ml 二氯甲烷，振搖，靜置分層，分取二氯甲烷層，TLC跟蹤，水層繼續(xù)以200ml 二氯甲烷萃??；經(jīng)TLC跟蹤驗證，當(dāng)二氯甲烷萃取四次后，水層已無明顯的黃酮類成分，故確定提取物二氯甲烷萃取四次，每次200ml，即二氯甲烷水層=I I萃取四次。棄去水層，合并二氯甲烷萃取液，共690ml。二氯甲烷萃取液的濃縮上述二氯甲烷萃取液置IOOOml圓底燒瓶中，分次減壓濃縮，總體積濃縮至IOOml時，濃縮液呈浸膏狀，得到蔓荊子二氯甲烷提取部位3. 5g，放冷至室溫待用。3、純化上述二氯甲烷部位3. 5g，緩緩加入95%醫(yī)用酒精，邊加熱邊溶解，至剛好全部溶解，共用溶劑18ml。放冷至室溫，0. 45um濾膜過濾；濾液緩慢加入到已處理好的葡聚糖凝膠色譜柱中(S^hadex LH-20, 040X600mm)，95%醫(yī)用酒精洗脫，流速lBV/h，收集3-8BV洗脫液，分別用TLC及HPLC檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫花牡荊素集中于5-6BV洗脫液，并與一種綠色色素一起被洗脫下來。合并5-6BV洗脫液，減壓濃縮，得到黃綠色粉末，以少量95%醫(yī)用酒精淋洗，抽干，60°C減壓干燥24h至恒重，得到黃色粉末。用上述方法制備3批樣品，以紫花牡荊素為指標(biāo)考察純度與轉(zhuǎn)移率。結(jié)果顯示，紫花牡荊素平均純度為91. 22%，紫花牡荊素在純化過程中的平均轉(zhuǎn)移率為80. 57%。根據(jù)《藥品注冊管理辦法》(試行)，中藥有效單體成分作為新藥注冊，其有效成分總含量必須超過90%，故本發(fā)明制備方法所制得的干物質(zhì)即為紫花牡荊素，符合新藥申報要求。實施例2.紫花牡荊素鎮(zhèn)痛試驗(一 )化學(xué)物質(zhì)刺激試驗I、實驗材料(I)藥物
PAME :由實施例I制備，實驗時用含0. 5% CMC的蒸餾水分別配制成0. 2%,0.4%,
0.8%的藥液備用。藥品及試劑甲醛(分析純)、醋酸(分析純)[上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑責(zé)任有限公司];嗎啡、納絡(luò)酮、亞甲基藍(lán)(由第二軍醫(yī)大學(xué)教保處代購)；乙酰水楊酸鈉、曲馬多、戊巴比妥鈉(北京四環(huán)制藥有限公司)。實驗時配置值相應(yīng)濃度備用。(2)動物ICR小鼠，體重20 22g，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2007003。由中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物研究中心提供。檢疫后備用。2、實驗方法(I)扭體試驗 取昆明種小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為模型對照組(N= 10)、陽性對照組(N =10) ,PAME高劑量組(N = 10)、中劑量組(N = 10)、低劑量組(N = 10)。按組分別灌胃蒸餾水、2%乙酰水楊酸藥液、0. 8%,0. 4%,0. 2% PAME丸藥液10ml/kg，給藥I小時后腹腔注射0. 6%醋酸10ml/kg，記錄15分鐘內(nèi)扭體次數(shù)。注射醋酸溶液后2 3min，小鼠出現(xiàn)腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張、臀部高踐等行為反應(yīng)，稱為扭體反應(yīng)(writhing response),該反應(yīng)在腹腔注射后15min內(nèi)出現(xiàn)頻率最高。實驗數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理。各組間比較采用單因素方差分析，其中方差齊者用LSD法，方差不齊者用Dunnett’ st3法檢驗。(2)福爾馬林試驗在給小鼠足底皮下注射福爾馬林溶液前40min，將化合物PAME的低、中、高劑量-20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg以灌胃的方式給已禁食15h的小鼠給藥。40min后,用量程為50iU的微量注射器向受試組中每只小鼠右足底皮下注射5%的福爾馬林溶液20 yl，立即置入一個懸掛在鐵架臺上容積為2000ml的大燒杯中，容器下方放置一個傾斜30°的鏡子，從鏡面觀察小鼠對皮下注射5%福爾馬林溶液的右足底反應(yīng)。陽性對照藥嗎啡(IOmg/kgs. c.)在給小鼠右足底皮下注射福爾馬林溶液前30min皮下注射給藥。小鼠足底皮下注射福爾馬林溶液后引發(fā)的反應(yīng)可分為兩個時相0 IOmin出現(xiàn)者為I相(早期相)、10 60min出現(xiàn)的反應(yīng)為II相(遲發(fā)相)。I相反應(yīng)主要是直接刺激c纖維所致，II相反應(yīng)有炎性機(jī)制參與。注射5%福爾馬林溶液90 120min后疼痛反應(yīng)明顯降低。我們將0 5min設(shè)定為I相(早期相)、15 25min設(shè)定為II相(遲發(fā)相)；在兩個時間段中觀察小鼠舔，抖動被注射足的持續(xù)時間長短作為疼痛指標(biāo)。做組間t檢驗比較各給藥組與空白組在I相和II相中小鼠舔，抖動被注射足的持續(xù)時間是否存在統(tǒng)計學(xué)差異。(3)小鼠辣椒素試驗在給小鼠足底皮下注射辣椒素溶液前25min，將PAME低、中、高劑量20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg以腹腔注射的方式給已禁食15h的小鼠給藥。25min后，用量程為50 yl的微量注射器向受試組中每只小鼠右足底皮下注射辣椒素溶液(I. g，20iU)，立即置入一個懸掛在鐵架臺上容積為2000ml的大燒杯中，容器下方放置一個傾斜30度的鏡子，從鏡面觀察小鼠對皮下注射辣椒素溶液的右足底的反應(yīng)。陽性對照藥嗎啡(10mg/kg s.c.)在給小鼠右足底皮下注射辣椒素溶液前30min皮下注射給藥。小鼠足底皮下注射辣椒素溶液后，引發(fā)的疼痛反應(yīng)是有外周神經(jīng)元參與的炎性疼痛反應(yīng)。注射辣椒素溶液8 IOmin后疼痛反應(yīng)明顯降低。我們將0 5min設(shè)定為觀察時段；在這段時間內(nèi)觀察小鼠舔，抖動被注射足的持續(xù)時間長短作為疼痛指標(biāo)。做組間t檢驗比較各給藥組與空白組在0 5min內(nèi)小鼠舔，抖動被注射足的持續(xù)時間是否存在統(tǒng)計學(xué)差異。3、實驗結(jié)果(I)對醋酸所致小鼠扭體的影響模型組小鼠給予0. 6%醋酸后，疼痛癥狀明顯，扭體動作多?；衔颬AME20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg三個劑量對腹腔注射醋酸引發(fā)的小鼠扭體次數(shù)有顯著的抑制作用，并呈一定的量效關(guān)系。ED(50)為39.07mg/kg。空白組、陽性對照藥組、PAME低、中、高五個劑量組的醋酸扭體實驗結(jié)果，見表I。表IPAME對醋酸所致小鼠扭體次數(shù)的影響(mean土SEM)
組別動物(只) 劑M(mg/kg )扭體次數(shù)(次/15min)
f 們對照10—45.9012.49 Pl 丨性對照100.529. 10+1. 77"
高劑M組108023.30+2. 17"
中劑104028.80+2.35"
低劑'M組102029. 10+3.65"
I-注與模型組比較，林P < 0. 01。(2)對福爾馬林所致小鼠疼痛的影響在小鼠福爾馬林實驗中，與模型對照組相比,化合物PAME20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg三個劑量對足底皮下注射5%福爾馬林溶液在I相和II相中所引發(fā)的小鼠舔，抖動被注射足的持續(xù)時間有顯著的抑制作用，并呈一定的量效關(guān)系；抑制疼痛的效果類似麻醉性鎮(zhèn)痛藥嗎啡的抑制效果?？瞻捉M、陽性對照藥組、化合物PAME低、中、高劑量組的小鼠福爾馬林實驗結(jié)果，見表2。表2PAME對福爾馬林所致小鼠疼痛的影響(mean土SEM)
組別動物劑MI相舔足時間 II相藤足時間
(只) (mg/kg)(0 5 min)(15 25 min)
稅項對照 10—83.90±6.4150.40±6.23
Pl I 性對照10105.97±1.36tt0.00±0.00**
高劑 M 組108033.40±4.03**4.60±1.13**
中劑:W:組104037.40±3.18**13.20±3.22**
低劑—M 組102051.20±6.29*20.80±4.13*
注與模型組比較，*P < 0. 05，林P < 0. 01。(3)對小鼠辣椒素所致疼痛的影響在小鼠辣椒素實驗中，與模型對照組相比，PAME20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg三個劑量對足底皮下注射辣椒素溶液(I. g，20iil)在0 5min內(nèi)所引發(fā)的小鼠舔和抖動被注射足的持續(xù)時間有顯著的抑制作用，并呈一定的量效關(guān)系?？瞻捉M、陽性對照藥組、PAME低、中、高劑量組的小鼠辣椒素實驗結(jié)果詳見表3。表3PAME對辣椒素所致小鼠舔、抖足時間的影響(mean土SEM)
權(quán)利要求
1.紫花牡荊素在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是紫花牡荊素用于制備鎮(zhèn)痛藥物的新用途。經(jīng)動物試驗，發(fā)現(xiàn)紫花牡荊素具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，因而可用于制備治療疼痛癥狀的藥物。本發(fā)明為制備新的鎮(zhèn)痛藥物提供了一種藥物來源。
文檔編號A61P29/00GK102743373SQ201110101590
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者冉霞, 張宏, 秦路平, 賈敏, 鄭承劍, 韓婷, 魏艷潔, 黃寶康 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)