專利名稱：一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學皮膚組織工程領域，更具體的涉及一種異種脫細胞真皮基質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
燒傷、創(chuàng)傷、戰(zhàn)傷等因素造成的皮膚缺損常遺留瘢痕增生和攣縮畸形，嚴重影響外觀和功能，Loewe最早證實真皮組織能增強移植皮的韌性、抑制肉芽組織的生長和瘢痕形成，降低創(chuàng)面攣縮程度。若將重建真皮結(jié)構(gòu)與其他促進創(chuàng)面愈合的措施結(jié)合起來，可有效減輕瘢痕的形成，提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。皮膚一直的關鍵問題在于免疫排斥反應，其免疫排斥反應主要源于表皮細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等細胞成分。脫細胞真皮基質(zhì)(Acellular Dermal Matrix, ADM )是一種可用于全層皮膚缺損的真皮替代物，來源于天然皮膚。它是天然皮膚經(jīng)過一定的理化方法處理，去除了表皮和真皮中的細胞成分，但保留了真皮細胞外基質(zhì)成分和其三維空間結(jié)構(gòu)。因去除了皮膚中抗原性較強的細胞成分而保留了抗原性微弱的膠原蛋白等細胞外基質(zhì)成分，同時又具有天然真皮的三維超微結(jié)構(gòu)，可為皮膚再生提供“真皮模板”，誘導移植后宿主細胞成分如成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等循支架結(jié)構(gòu)生長。真皮基質(zhì)還可以支持成纖維細胞的浸潤、新血管的生成，使成纖維細胞合成和分泌具有正常結(jié)構(gòu)和功能的細胞外基質(zhì)成分，使肉芽組織快速成熟及真皮深層再生，減少成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，從而減少達到減少疤痕或無疤痕的臨床效果。1995 ip Livesey ( Livesey, S. Α. , D. N. Herndon, et al. (1995). "Transplanted acellular allograft dermal matrix. Potential as a template for the reconstruction of viable dermis. 〃 Transplantation 60(1): 1-9.)等首先 艮道了脫細胞真皮基質(zhì)的制備，同年，Wainwright ( Wainwright DJ. Use of an acellular allograft dermal matrix (AlloDerm) in the management of full-thickness burns. Burns. 1995;21:243-8.)首先報道了脫細胞真皮基質(zhì)的臨床應用。美國LifeCell公司將這一成果商品化，用新鮮的人尸體皮膚制成脫細胞真皮基質(zhì)，命名為Alloderm，并通過了美國FDA的批準進入了醫(yī)用生物材料市場。國內(nèi)陳壁等人最早開始對異體真皮脫細胞的實驗和臨床研究，且目前已有Alloderm的類似產(chǎn)品上市，但由于人異體皮的來源有限， 且涉及到倫理道德問題，無法滿足臨床需求，因此異種脫細胞真皮基質(zhì)成為解決這一矛盾的有效途徑。然而現(xiàn)有的異種脫細胞真皮基質(zhì)制備雖然已經(jīng)比較成熟，但在其制備過程中存在較多問題，如制備過程復雜，處理時間過長，所用的方法對天然真皮超微結(jié)構(gòu)破壞性較大， 細胞外基質(zhì)成分保留較差，殘留較多的化學物質(zhì)等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷而提供的一種異種脫細胞真皮基質(zhì)的制備
3方法，其特點是采用健康哺乳動物皮膚為材料，依次經(jīng)過真皮的制備、滲透休克處理、去污劑結(jié)合超聲波處理、環(huán)氧乙烷消毒后所得到的產(chǎn)品。具有制備過程簡單、所需時間適中、細胞成分去除較徹底、細胞外基質(zhì)成分保留較好的特點。本發(fā)明所提供的上述一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的簡易方法，包括以下步驟
包括以下的步驟
(1)、對剝離的哺乳動物皮膚進行剔除毛發(fā)的處理；
(2)、用0.1%苯扎溴銨溶液清洗浸泡后再用消毒液消毒皮膚，在無菌條件下并用機械法制得網(wǎng)狀層真皮；
(3)、將真皮置于低滲溶液內(nèi)震蕩處理0.5小時-12小時，再置于高滲溶液內(nèi)震蕩處理0. 5小時-12小時；
(4)、重復步驟(3)1-6次；
(5)、將真皮置于洗滌劑內(nèi)用超聲波清洗器處理12小時-48小時；
(6)、用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌1-6次，環(huán)氧乙烷消毒即得脫細胞真皮基質(zhì)。在上述制備方法中，步驟(1)中可用于制備脫細胞真皮基質(zhì)的哺乳動物的選擇是多種多樣的，包括人、豬、牛、羊、大鼠或者兔等。步驟(1)中的哺乳動物皮膚來源自出生不超過14天的健康哺乳動物的皮膚。步驟(1)中所述的清除毛發(fā)是指采用機械方式去除。步驟(2)中所述的消毒液選自碘伏、75%酒精、碘酒等，優(yōu)先選擇碘伏。步驟(2)中所述的網(wǎng)狀層真皮的厚度為0. 1 mm -0. 5 mm，優(yōu)先選擇0. 3 mm。步驟(3)中所述的低滲溶液是指蒸餾水或者10 mM Trizma HCl和10 mM EDTA 的混合液，優(yōu)先選擇蒸餾水；高滲溶液是指1 M NaCl或者50 mM Trizma HC1、1 M NaCl 和10 mM EDTA的混合液，優(yōu)先選擇1 M NaCl。步驟(3)中所述的低滲溶液處理時間0. 5小時-12小時，優(yōu)先選擇2小時；高滲溶液處理時間0.5小時-12小時，優(yōu)先選擇2小時。步驟(3)中所述的震蕩處理，震蕩方式可以為水平，也可以為旋轉(zhuǎn)，震蕩頻率為50 -200/分。步驟(4)中所述的重復步驟(3) 1 - 6次，優(yōu)先選擇3次。步驟(5)中所述的洗滌劑為Tween-20、Tween-80、SDS、Triton X-100、Triton X-200、CHAPS中的一種或幾種組合，優(yōu)先選擇Triton X-100，Triton X-100濃度可以為 0.1%、0.5%、1.0%、2.0%，優(yōu)先選擇 0.5%。步驟(5)中所述的超聲波清洗器的頻率設定在20 kHz - 80 kHz之間，功率設定在 100 W - 400 W 之間。步驟(6)中所述的磷酸鹽緩沖液pH值在7.2 - 7. 4之間，洗滌時間在5 min -30 min之間。本發(fā)明提供了一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的簡易方法。在該脫細胞真皮基質(zhì)制備方法中采用了滲透壓休克法裂解細胞，配合后續(xù)的洗滌劑去除細胞成分，超聲波的使用提高了洗滌劑的洗滌效力，達到了較為理想的去除細胞的效果。由于沒有使用酶類， 比如胰蛋白酶、DNase、RNase等，避免了對細胞外基質(zhì)成分的較大破壞，進而最大程度上保留了真皮細胞外基質(zhì)成分，并且不涉及酶類物質(zhì)殘留引起移植后不利的免疫反應。本發(fā)明的優(yōu)點
(1)獲得的真皮基質(zhì)不含細胞成分，抗原性低；
(2)在一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的簡易方法中，采用了簡單的方法組合，所涉及方法對環(huán)境友好，制備工藝簡單實用，制作周期短，價格較低，適于規(guī)?；a(chǎn)。(3)制備過程中未使用固定劑、交聯(lián)劑等，因而所制備的異種脫細胞真皮基質(zhì)保留了真皮的天然三維結(jié)構(gòu)。


圖1為異種脫細胞真皮基質(zhì)凍干后的照片； 圖2為處理之前真皮基質(zhì)組織學圖片；
圖3為處理之后真皮基質(zhì)組織學圖片； 圖4為處理之前真皮基質(zhì)DAPI染色； 圖5為處理之后真皮基質(zhì)DAPI染色；
圖6為脫細胞前后真皮基質(zhì)內(nèi)DNA的電泳圖；附圖6中MR代表Marker，為 D15000+2000，U代表經(jīng)本方法處理殘留在真皮內(nèi)的DNA，A代表未經(jīng)任何處理真皮內(nèi)的DNA， 由DNA電泳圖可看出，經(jīng)本方法處理后的真皮內(nèi)DNA含量明顯降低。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進一步說明。實施例1、制備異種脫細胞真皮基質(zhì)
(1)剝離健康新生牛皮膚，剃除毛發(fā)；
(2)用0.1%苯扎溴銨溶液清洗浸泡，碘伏消毒皮膚5min，在無菌條件下用取皮鼓取厚度為0.2 mm的網(wǎng)狀層真皮；
(3)將網(wǎng)狀真皮置于蒸餾水內(nèi)震蕩處理2小時，再置于1M NaCl內(nèi)震蕩處理2小
時；
(4)重復步驟(3)3次；
(5)再將網(wǎng)狀真皮置于0.5%Triton X-100內(nèi)用超聲波清洗器處理M小時，超聲波清洗器處理的頻率設定為40 kHz，功率為250 W；
(6)用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次15min，環(huán)氧乙烷消毒即得脫細胞真皮基質(zhì)。實施例2、制備異種脫細胞真皮基質(zhì)
(1)剝離健康清潔級SD大鼠皮膚，剃除毛發(fā)；
(2)用0.1%苯扎溴銨溶液清洗浸泡，碘伏消毒皮膚5min，在無菌條件下用取皮鼓取厚度為0.3 mm的網(wǎng)狀層真皮；
(3)將網(wǎng)狀真皮置于蒸餾水內(nèi)震蕩處理1小時，再置于1M NaCl內(nèi)震蕩處理1小
時；
(4)重復步驟(3)3次；
(5)在將網(wǎng)狀真皮置于0.5%Triton X_100內(nèi)用超聲波清洗器處理12小時，頻率設
5定為40 kHz，功率為250 W ；
(6)用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次15 min，環(huán)氧乙烷消毒即得脫細胞真皮基質(zhì)。 實施例3、制備異種脫細胞真皮基質(zhì)
(1)剝離健康兔皮皮膚，剃除毛發(fā)；
(2)用0.1%苯扎溴銨溶液清洗浸泡，75%酒精消毒皮膚5min，在無菌條件下用取皮鼓取厚度為0. 3 mm的網(wǎng)狀層真皮；
(3)將網(wǎng)狀真皮置于10mM Trizma HCl與10 mM EDTA的混合液內(nèi)震蕩處理2小時， 再置于1 M NaCl內(nèi)震蕩處理2小時；
(4)重復步驟(3)3次；
(5)再將網(wǎng)狀真皮置于0.5%Tween-20內(nèi)用超聲波清洗器處理20小時，超聲波清洗器處理的頻率設定為30 kHz，功率為250 W；
(6)用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次15min，環(huán)氧乙烷消毒即得脫細胞真皮基質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的方法，包括以下的步驟(1)、對剝離的哺乳動物皮膚進行剔除毛發(fā)的處理；(2)、用0.1%苯扎溴銨溶液清洗浸泡后再用消毒液消毒皮膚，在無菌條件下并用機械法制得網(wǎng)狀層真皮；(3)、將真皮置于低滲溶液內(nèi)震蕩處理0.5小時-12小時，再置于高滲溶液內(nèi)震蕩處理0. 5小時-12小時；(4)、重復步驟(3)1-6次；(5)、將真皮置于洗滌劑內(nèi)用超聲波清洗器處理12小時-48小時；(6)、用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌1-6次，環(huán)氧乙烷消毒即得脫細胞真皮基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(1)中的哺乳動物皮膚來源自出生不超過14天的健康哺乳動物的皮膚。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 所述哺乳動物為豬、牛、羊、大鼠或者兔。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(2)中的消毒劑選自碘伏、75%酒精和碘酒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(2)中的網(wǎng)狀層真皮的厚度為0. 1 mm -0. 5 mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(3)中所述的低滲溶液是指蒸餾水或者10 mM Trizma HCl與10 mM EDTA的混合液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(3)中所述的高滲溶液是指1 M NaCl或者50 mM Trizma HC1、1 M NaCl和10 mM EDTA的混合液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(3)中所述的震蕩處理，震蕩方式可以為水平或旋轉(zhuǎn)，震蕩頻率為50 - 200/分。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(4)所述的洗滌劑選自 Tween-20、Tween-80、SDS, Triton X-100、Triton X-200和 CHAPS，其濃度分別為0. 1% - 2. 5%ο
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于步驟(5)中超聲波清洗器的頻率為20 - 80 kHz，功率為100 - 400 W。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脫細胞真皮基質(zhì)的制備方法。方法包括對剝離的哺乳動物皮膚進行剔除毛發(fā)的處理；用消毒液消毒皮膚，在無菌條件下并用機械法制得網(wǎng)狀層真皮；將真皮置于低滲溶液內(nèi)震蕩處理0.5小時-12小時，再置于高滲溶液內(nèi)震蕩處理0.5小時-12小時；重復前步驟1-6次；將真皮置于洗滌劑內(nèi)用超聲波清洗器處理12小時-48小時；用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌1-6次，環(huán)氧乙烷消毒即得脫細胞真皮基質(zhì)。本發(fā)明制備工藝簡單實用，細胞去除較為徹底，制作周期短，對周圍環(huán)境友好，價格較低，適于規(guī)?；僮?。
文檔編號A61L27/60GK102225218SQ20111010526
公開日2011年10月26日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者彭代智, 陳博 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院