專利名稱：全人乙肝表面蛋白單克隆抗體及其在制備預(yù)防hbv感染藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了全人乙肝表面蛋白單克隆抗體制備預(yù)防HBV感染中的用途。
背景技術(shù)：
乙肝病毒Ofepatitis B virus,HBV)是雙鏈DNA病毒，引起慢性乙型肝炎，而導(dǎo)致肝硬化和肝癌的發(fā)生。全球大約有三億五千萬HBV感染者，而這也成為世界公共健康問題。 最近幾十年，乙肝疫苗的研制成功，給乙肝的預(yù)防帶來了很大的希望。然而，確有少部分人接種乙肝疫苗卻不能激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗乙肝抗體，這一部分人群一旦接觸到乙肝的高危因素，只能注射人乙肝免疫球蛋白來預(yù)防。但人免疫球蛋白成分相對復(fù)雜，使用的危險因素相對不確定性，限制了人乙肝免疫球蛋白的使用。因此迫切需要開發(fā)一種人源的，危險因素相對可控的生物制品替代人乙肝免疫球蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種全人乙肝表面蛋白(HBsAg)單克隆抗體A2E2，C9G9，其抗體序列是來源于人體單個B細胞，其中抗體A2E2重鏈可變區(qū)核苷酸序列、氨基酸序列分別為SEQID NO :1和SEQ ID NO :2，抗體A2E2輕鏈可變區(qū)核苷酸序列、氨基酸序列分別為SEQ ID NO3和SEQ IDNO :4其中抗體C9G9重鏈可變區(qū)核苷酸序列、氨基酸序列分別為SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6，抗體A2E2輕鏈可變區(qū)核苷酸序列、氨基酸序列分別為SEQ ID NO :7和SEQID NO :8，抗體在體外有良好的針對乙肝病毒(HBV)的中和保護活性。本發(fā)明還公開了全人乙肝表面蛋白單克隆抗體A2E2，C969的制備方法及體外中和活性的鑒定。具體地，分離乙肝疫苗接種志愿者外周血PBMC，熒光標記的抗原和抗體CD19，IgG( )，HBSAg染色，利用流式細胞術(shù)分選HBSAg特異性B細胞(CD19+IgG+HBSAg+)制備成單細胞。單細胞RT-PCR技術(shù)克隆抗體K鏈和H鏈可變區(qū)序列。PCR產(chǎn)物測序后，抗體K鏈和H鏈可變區(qū)基因分別克隆入IgG-AbVec質(zhì)粒和Ig K -AbVec質(zhì)粒，并在CHO細胞系中表達得到全人乙肝表面蛋白單克隆抗體A2E2，C9G9?？贵w中和作用測定的步驟為HBV (2X104copy)抗體分別與clg，A2E2，C969，HBIG(Iug)預(yù)孵育lh，然后加入培養(yǎng)好的H印aRG細胞系(培養(yǎng)基中含4% PEG8000)過夜培養(yǎng)，次日洗三次，換新鮮的培養(yǎng)基。在第2，4，6天檢測HBV-DNA和HBsAg。HBV-DNA檢測使用 SMITEST kit (Genome Science Laboratories, Tokyo, Japan)。HBsAg 測定收集培養(yǎng)上清，用 ELISA kit(R&D)檢測?？贵w中和作用測定結(jié)果表明，本發(fā)明公開的全人乙肝表面蛋白單克隆抗體A2E2，C9G9在體外能有效地阻斷HBV的復(fù)制，因此具有良好的中和乙肝病毒的能力，可作為預(yù)防HBV感染藥物。


圖1，流式 CD19+IgG+HBsAg B cell 分析圖2，單細胞RT-PCR抗體H，K鏈PCR擴增圖3，抗體表達質(zhì)粒圖譜圖4，全人乙肝表面蛋白單克隆抗體A2E2，C9G9與HBsAg特異性結(jié)合曲線
圖5，抗體保護H印aRG細胞免受HBV感染
具體實施例方式以下結(jié)合實施例、實驗例進一步對本發(fā)明進行說明，這些實施例、實驗例不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
實施例I HBSAg特異性單個B細胞的制備具體地，分離乙肝疫苗接種志愿者外周血PBMC，熒光標記的抗原和抗體⑶19，IgG, HBSAg染色，利用流式細胞術(shù)分選HBSAg特異性B細胞(CD19+IgG+HBSAg+)制備成單細胞。(圖I)實施例2單細胞RT-PCR技術(shù)克隆抗體K鏈和H鏈可變區(qū)序列。(Thomas Tller (2008)Efficient generation of monoclonal antibodies fromsingle human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.Journal of Immunological Methods 329:112-124)。PCR 產(chǎn)物測序后，抗體 k 鏈和 H 鏈可變區(qū)基因分別克隆入IgG-AbVec質(zhì)粒和Ig K -AbVec質(zhì)粒，并在CHO細胞系中表達(圖2，圖3)。其中抗體A2E2重鏈可變區(qū)核苷酸序列、氨基酸序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ IDNO :2，抗體A2E2輕鏈可變區(qū)核苷酸序列、氨基酸序列分別為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4其中抗體C9G9重鏈可變區(qū)核苷酸序列、氨基酸序列分別為SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6，抗體A2E2輕鏈可變區(qū)核苷酸序列、氨基酸序列分別為SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :8.實施例3抗體中和作用測定HBV(2X104copy)抗體分別與 clg，A2E2，C9G9，HBIG(Iug)預(yù)孵育 lh，人后加入培養(yǎng)好的H印aRG細胞系(培養(yǎng)基中含4%PEG8000)過夜培養(yǎng)，次日洗三次，換新鮮的培養(yǎng)基。在第 2，4，6 天檢測 HBV-DNA 和 HBsAgo HBV-DNA 檢測使用 SMITEST kit (Genome ScienceLaboratories, Tokyo, Japan)。HBsAg 測定收集培養(yǎng)上清，用 ELISA kit(R&D)檢測。(圖4，圖 5)
權(quán)利要求
1.一種全人乙肝表面蛋白單克隆抗體A2E2，其重鏈、輕鏈可變區(qū)氨基酸序列分別為SEQ ID NO 2 和 SEQID NO :4。
2.一種全人乙肝表面蛋白單克隆抗體C9G9，其重鏈、輕鏈可變區(qū)氨基酸序列分別為SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :8。
3.權(quán)利要求I或2任一所述的全人乙肝表面蛋白單克隆抗體的制備方法，包括分離乙肝疫苗接種志愿者外周血PBMC，利用流式細胞術(shù)分選HBSAg特異性B細胞制備成單細胞；單細胞RT-PCR技術(shù)克隆抗體K鏈和H鏈可變區(qū)序列，PCR產(chǎn)物測序后，抗體K鏈和H鏈可變區(qū)基因分別克隆入IgG-AbVec質(zhì)粒和IgK-AbVec質(zhì)粒，并在CHO細胞系中表達得到。
4.權(quán)利要求I或2任一所述的全人乙肝表面蛋白單克隆抗體在制備預(yù)防HBV感染藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了全人乙肝表面蛋白單克隆抗體A2E2，其重鏈、輕鏈可變區(qū)氨基酸序列分別為SEQ ID NO2和SEQ ID NO4和全人乙肝表面蛋白單克隆抗體C9G9，其重鏈、輕鏈可變區(qū)氨基酸序列分別為SEQ ID NO6和SEQ ID NO8。本發(fā)明還公開了上述兩種抗體在制備預(yù)防HBV感染藥物中的用途。
文檔編號A61P31/20GK102757492SQ201110105709
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者戴建新, 李博華, 樊克興, 郭亞軍 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)