專利名稱：普洱茶抗神經(jīng)傷害之用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及普洱茶用于神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)之用途，特別是用于保護(hù)因癲癇所引發(fā)之神經(jīng)細(xì)胞過度興奮傷害。
背景技術(shù)：
癲癇(Epilepsy)俗稱羊暈、羊癲瘋，是一種先天或后天因素引起的慢性腦疾病，其特征為腦細(xì)胞不正常放電引起反復(fù)發(fā)作。大部份學(xué)者將癲癇持續(xù)狀態(tài)定義為癲癇發(fā)作至少30分鐘。癲癇持續(xù)狀態(tài)之原因包括急性神經(jīng)、急性全身性疾病、或抗癲癇藥物中斷。癲癇持續(xù)狀態(tài)可造成病人腦損傷甚至病人死亡。癲癇一再發(fā)作也可能會造成腦組織損傷而影響智力，在兒童常常造成學(xué)習(xí)障礙。動物實(shí)驗(yàn)中，電刺激及化學(xué)物引發(fā)之癲癇持續(xù)狀態(tài)會造成腦部神經(jīng)元的死亡(Hsieh PF, 1999, Neurol Res 21 :399-403 ；Gupta YK 等人，2002， Pharmacol Biochem Behav 71 (1-2) :245-49)。癲癇持續(xù)狀態(tài)亦可造成內(nèi)側(cè)顳葉硬化與自發(fā)性反復(fù)發(fā)作(癲癇)(ffasterlain CG 等人，1996, Epilepsy Res 26 :255-65)。在過去的二十幾年中，有許多新的抗癲癇藥物不斷的被發(fā)明出來，使得百分之八十的病人能夠不再受發(fā)作之苦。藥物治療的主要目的是，通過藥物控制發(fā)作讓其完全不再發(fā)生，或退而求其次使發(fā)作的次數(shù)及嚴(yán)重度大幅降低。定期服用可抑制癲癇發(fā)作，使患者可以過著正常的生活。不同類型的癲癇癥所需的抗癲癇藥不同，醫(yī)生會因應(yīng)患者的情況而下藥，有些患者或會需要服用多種藥物。常用的抗癲癇藥物包括癲能停(diIantin)、癲通(tegretol)、帝拔癲(valproic acid)、邁蘇靈(mysoline)、芬那必(phenobabital)、clobazam(Frisium)、Clonazepam(Rivotril)等，另外有Valium肛門栓劑,對于小朋友發(fā)作時由肛門塞入相當(dāng)有用。服用的抗癲癇藥物經(jīng)胃腸吸收后，進(jìn)血流而到腦部，使得造成異常放電的區(qū)域穩(wěn)定而使癲癇得以控制，要良好控制癲癇則必須血中的藥物濃度日夜皆能維持穩(wěn)定，若忘記吃藥則血中濃度下降，常造成多次發(fā)作；若服用太多的藥物，令人驚訝的是也可能造成發(fā)作?？拱d癇藥物雖不會成癮，但有時候是有副作用的。副作用包括嗜睡、體重增加、暫時性掉頭發(fā)、皮膚起疹、牙齦腫脹、不平衡與胃腸不適。近年來中藥在抗癲癇的研究上也相當(dāng)有成果，現(xiàn)代藥理證明，石菖蒲主要成分細(xì)辛醚，具有抗驚厥，以及鎮(zhèn)靜中樞的作用；天麻可以通過利用影響腦部不同區(qū)域兒茶酚胺類的神經(jīng)傳遞物質(zhì)的代謝，來協(xié)調(diào)腦部興奮以及抑制的平衡。其它如鉤藤、遠(yuǎn)志、酸棗仁也有鎮(zhèn)定安神的作用。普洱茶是以云南省一定區(qū)域內(nèi)的云南大葉種曬青毛茶為原料，經(jīng)過后發(fā)酵加工成的散茶和緊壓茶。其外形色澤褐紅；內(nèi)質(zhì)湯色紅濃明亮，香氣獨(dú)特沉香，滋味醇厚回甘，葉底褐紅。普洱茶的產(chǎn)地因在清朝時屬云南省普洱府(今普洱市，2007年前為思茅市)，故以此泛稱之。實(shí)際上，現(xiàn)在被稱為滇普洱茶的泛指中國云南地區(qū)生產(chǎn)的一種茶葉。普洱茶自古被認(rèn)為有治理腸胃、解油膩的功能。主食為牛羊肉及淀粉(青稞)的西藏人，據(jù)說只要沒有茶，就會生病。現(xiàn)代中國、日本及法國的臨床實(shí)驗(yàn)均顯示普洱茶有降低膽固醇和血脂的功效，對心血管疾病保健很有幫助。本發(fā)明首先通過活體外神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)及動物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)普洱茶用于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞過度興奮傷害之用途，尤其可用于保護(hù)因癲癇所引發(fā)之神經(jīng)細(xì)胞過度興奮傷害。

發(fā)明內(nèi)容
于一方面，本發(fā)明涉及一種神經(jīng)保護(hù)性組合物，其包含普洱茶水溶液提取物。于本發(fā)明之一項(xiàng)具體實(shí)施方案，該組合物用于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞過度興奮傷害。于本發(fā)明之另一項(xiàng)具體實(shí)施方案，該組合物用于保護(hù)因癲癇所引發(fā)之神經(jīng)細(xì)胞損傷。


圖I顯示PC12細(xì)胞傷害程度(Cytotoxicity, %, 1A)及于卡英酸150 ii M逆境處理下之細(xì)胞存活率(Cell Viability, %，1B)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中PC12細(xì)胞傷害程度(Cytotoxicity, % )以加入卡英酸150 y M之實(shí)驗(yàn)組為100% (% );而PC12細(xì)胞存活率(Cell Viability, % )則以對照組為 100% (% )。圖2顯示以小膠質(zhì)細(xì)胞BV2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測試臺洱茶對于LPS引發(fā)一氧化氮清除程度之結(jié)果。數(shù)據(jù)皆以平均值土 s. e. m.表不，*代表p < 0. 05。圖3顯示臺洱茶對于卡英酸引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞過度興奮傷害保護(hù)之鈣離子的釋放結(jié)果。圖4顯示臺洱茶對于卡英酸引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞過度興奮傷害保護(hù)之含氧自由基的生成結(jié)果。圖5為正常鼠、單獨(dú)以卡英酸處理(對照組)及有喂食臺洱茶之小鼠大腦梨狀皮質(zhì)的腦神經(jīng)切片HE染色結(jié)果。放大倍率如各圖上方標(biāo)示。圖6為單獨(dú)以卡英酸處理(對照組)及有喂食臺洱茶之小鼠大腦海馬回與梨狀皮質(zhì)的腦神經(jīng)切片DAPI&TUNEL染色結(jié)果。放大倍率如各圖上方標(biāo)示。其中綠熒光染色為TUNEL染色，代表神經(jīng)細(xì)胞的凋亡(apoptosis);藍(lán)熒光染色為染色體染上DAPI的背景。實(shí)施方式本發(fā)明之其他特色及優(yōu)點(diǎn)將于下列實(shí)施范例中被進(jìn)一步舉例與說明，而該實(shí)施范例僅作為輔助說明，并非用于限制本發(fā)明之范圍。
實(shí)施例卡英酸(Kainate，KA)是一種谷氨酸的類似物，它具有很強(qiáng)的神經(jīng)興奮性，常被用來誘發(fā)動物邊緣葉性癲癇包括癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epilepticus)。在大鼠的腹腔或腦內(nèi)注射卡英酸會造成海馬(hippocampus)和杏仁核(amygadala)區(qū)神經(jīng)元的損傷，而發(fā)展成為癲癇發(fā)作，誘發(fā)強(qiáng)直一陣攣性癲癇發(fā)作和邊緣性運(yùn)動癥候，包括濕狗抖(wet dogshakes,濕答答的狗兒甩水動作)、面肌陣攣(facial myoclonia)和腳掌震顫動作(pawtremor)等現(xiàn)象。于下述實(shí)施例之實(shí)驗(yàn)中，所使用的神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12購自食品工業(yè)發(fā)展研究所生資中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC, Hsin-Chu, Taiwan),編號BCRC 60048 ;小膠質(zhì)細(xì)胞株BV_2得自元培科技大學(xué)侯建維老師實(shí)驗(yàn)室。
以下所稱之“臺洱茶”得自宸信生技公司，其制法如下茶菁與特定接種菌株曲霉(Aspergillus spp.)和鏈霉菌(Streptomyces spp.)(黑曲霉(A. niger) + 灰色鏈霉菌(S. Cinereus))進(jìn)行發(fā)酵2個月；發(fā)酵2個月之后，將茶葉烘干而得干燥茶葉，即所稱之臺洱茶。進(jìn)行細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)時，將所得之臺洱茶葉中加入等體積的蒸餾水，用攪拌機(jī)研磨粉碎機(jī)(Sonicator) (hiescher,UIP250,德國)，將茶葉+蒸懼水混合物進(jìn)行研磨,接著將該臺洱茶水溶液提取物進(jìn)行過濾，而得臺洱茶水溶液提取物。對于動物實(shí)驗(yàn)，將過濾后的新鮮臺洱茶水溶液提取物直接喂食動物；而對于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，則將過濾后的新鮮茶葉水溶液提取液以無菌膜過濾滅菌后，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例I :普洱茶對于卡英酸引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞損傷之保護(hù)功效卡英酸會造成神經(jīng)細(xì)胞腫脹、細(xì)胞器破碎或甚至死亡，以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，例如星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte)與小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)的活化與增生,而以小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)出現(xiàn)得較星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)為早。Taniwaki等人亦發(fā)現(xiàn)大鼠腦內(nèi)注射卡英酸處可觀察到活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，且活化的現(xiàn)象可能歸因于神經(jīng)受損或過度的神經(jīng)興奮。將卡英酸直接注射于海馬或杏仁核時，CA3(海馬角3部位，Cornu Ammonis 3，大腦皮層的海馬結(jié) 構(gòu)的齒狀回CA3部位)所呈現(xiàn)的神經(jīng)細(xì)胞損傷程度較CAl (海馬角I部位，Cornu Ammonis1，大腦皮層的海馬結(jié)構(gòu)的齒狀回CAl部位)或CA4(海馬角4部位，Cornu Ammonis 4，大腦皮層的海馬結(jié)構(gòu)的齒狀回CA4部位)更為嚴(yán)重。于是，本實(shí)施例利用神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12加入卡英酸引發(fā)興奮毒性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)臺洱茶具有降低神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12傷害之功效。I.細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞存活率分析將小鼠神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12以DMEM培養(yǎng)液(10 %胎牛血清、100IU/ml青霉素、100 u g/ml鏈霉素)培養(yǎng)于含有5% CO2之37°C恒溫培養(yǎng)箱中。于卡英酸處理前24小時，將細(xì)胞接種于24孔板，每孔中以Iml培養(yǎng)液培養(yǎng)5 X IO5個細(xì)胞。于各孔加入卡英酸150 u M、不同濃度之臺洱茶水溶液提取物(臺洱茶最終含量即為換算OiUUOO Ul及500iU成為0iig、、50iig& 250iig)或氨基丁酸GABA 10 y M (做為陽性比較組)與細(xì)胞作用，經(jīng)過24小時培養(yǎng)后，以臺盼藍(lán)(Trypan blue dye)染色，并在顯微鏡下進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)。以無添加任何藥劑作用之細(xì)胞為對照組。而關(guān)于神經(jīng)細(xì)胞受損程度之測試，將處理細(xì)胞進(jìn)行四甲基噻唑藍(lán)(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)_2，5- 二苯基-溴化四唑(3-(4，5-dimethyl thiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide) ,MTT)實(shí)驗(yàn),利用活細(xì)胞之線粒體中琥拍酸脫氫酶會使MTT之四唑鐵(tetrazolium)轉(zhuǎn)為藍(lán)色之產(chǎn)物MTT甲月朁i (formazan)的作用，來測試神經(jīng)細(xì)胞之存活率。如圖I所示，臺洱茶可降低神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12之傷害率，且隨著臺洱茶劑量增加，對于PC12神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)效果越好。2. 一氧化氮(NO)釋放量測試一氧化氮(Nitric oxide, NO)是腦中主要的傳導(dǎo)物質(zhì)之一，許多的研究報告顯示出一氧化氮與實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作之間有密切關(guān)聯(lián)，有些學(xué)者認(rèn)為實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)癲癇發(fā)作所造成一氧化氮的大量產(chǎn)生可導(dǎo)致癲癇發(fā)作的抑制或終止，但另外一些學(xué)者則認(rèn)為一氧化氮的大量產(chǎn)生會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的破壞。Kashihara發(fā)現(xiàn)一氧化氮的產(chǎn)生關(guān)系到卡英酸誘發(fā)癲癇發(fā)作的發(fā)生，可能是由于一氧化氮能增加大腦血流而增加神經(jīng)元的活性所致(Kashihara K等人，1998,Neurosci. Res. 32 :189-94)?？ㄓ⑺崽幚砜梢允股窠?jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生一氧化氮,造成神經(jīng)興奮毒性的發(fā)生，因此，本實(shí)驗(yàn)測試小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2加入卡英酸引發(fā)之一氧化氮的釋放量實(shí)驗(yàn)，以測試普洱茶水溶液提取物對于卡英酸引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞之一氧化氮清除程度。將5X IO5個BV-2細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，分別加入卡英酸及GABAlO ii M(做為比較組)或不同濃度的臺洱茶水溶液提取物(011§、50118及250110，于1^3 2 ii g/ml存在下，于37°C，5% CO2培養(yǎng)24小時后，取上清液測試一氧化氮釋放量，測試方法如下每個細(xì)胞上清液樣品取IOOii I力口至Ij 96孔ELISA測量板(reader plat e)中，再加入100 U I的Griess試劑(溶于5%磷酸鹽溶液之I %苯磺胺溶液與0. I % NED (N-1-萘二胺二鹽酸鹽(N-l-napthylenediamine dihydrochloride))溶液以 I : I 體積混合)，利用 ELISA 酶標(biāo)儀于波長540nm下測量吸光值，此方法主要是測定N02_的含量(NO會變成穩(wěn)定的N02_)，共作三次重復(fù)。由圖2之結(jié)果顯示，對于LPS 2 g/ml逆境處理，加入臺洱茶時可產(chǎn)生一氧化氮清除效果，而且隨著臺洱茶的劑量增加，則對于清除一氧化氮的作用越強(qiáng)。3.細(xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度測定神經(jīng)細(xì)胞之凋亡作用，可以由大量鈣離子的釋放引發(fā)，由于細(xì)胞內(nèi)鈣離子的大量增加，而活化了鈣、鎂離子依賴性之內(nèi)切酶，導(dǎo)致脫氧核糖核酸斷裂片段之神經(jīng)細(xì)胞凋亡。卡英酸通過活化卡英酸受體(谷氨酸受體亞型)通道，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞之膜去極化，由鈣離子電位調(diào)控之通道釋放鈣離子。Kanada等學(xué)者利用銀杏葉子提取物，來降低卡英酸引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞之鈣離子的釋放濃度，以達(dá)到對大鼠的小腦神經(jīng)細(xì)胞之保護(hù)作用(Kanada A等人，2005，Biol Pharm Bull. 28 :934-6)。紅楠提取物，也同樣可以降低卡英酸引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞之I丐離子的釋放，以達(dá)到對大鼠的大腦皮質(zhì)初級細(xì)胞(primary cortical cells)之保護(hù)作用。于是，本實(shí)驗(yàn)測試神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12在加入卡英酸后所引發(fā)之鈣離子的釋放，以測試臺洱茶之抑制神經(jīng)細(xì)胞鈣離子的釋放程度，進(jìn)一步測試臺洱茶對于卡英酸引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞之凋亡傷害保護(hù)程度。實(shí)驗(yàn)前將PC12與BV-2細(xì)胞分別接種于玻片上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞以2iiM fura-2乙酰氧基甲酯(fura_2acetoxymethyl ester,fura-2AM)于37°C恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)30分鐘，使fura_2AM進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。于UV光照(illumination)下觀察,并記錄細(xì)胞中每秒fura_2的顏色變化。在開始記錄數(shù)據(jù)后30秒，加入卡英酸150 ii M及GABA IOii M(作為比較組)或不同濃度之臺洱茶水溶液提取物(0 ii g、50 ii g及250 u g)，持續(xù)記錄10分鐘。利用掃描儀檢測，激發(fā)波長為每秒交替I次的340nm與380nm，吸收波長為510nm。在PC12細(xì)胞分別于卡英酸或臺洱茶水溶液提取物實(shí)驗(yàn)處理后，取上清液測試鈣離子的濃度測試。由圖3之結(jié)果顯示，臺洱茶對于卡英酸引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞過度興奮傷害具有保護(hù)效果。4 含氧自由基(ROS)由于卡英酸能導(dǎo)致腦中脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxides)濃度升高，因此被認(rèn)為和氧化自由基有關(guān)。通過興奮毒性機(jī)制，添加谷氨酸類似物-卡英酸，將使PC12細(xì)胞產(chǎn)生自由基，最后造成神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生活性氧含氧自由基(R0S),造成血腦屏障(blood-brainbarrier, BBB)損壞和神經(jīng)退化。ROS是以氧原子為中心的高反應(yīng)分子,包括(例如)超氧陰離子自由基(superoxide anion radical, O2O、過氧化氫(hydrogenperoxide, H2O2)、氫氧自由基(hydroxyl radical, OF)及其所衍生的氧化活性分子等。由前述之實(shí)驗(yàn)結(jié)果已知普洱茶具有抗氧化活性，本實(shí)驗(yàn)則更進(jìn)一步測試，普洱茶之抑制神經(jīng)細(xì)胞含氧自由基(ROS)的釋放量程度，以及普洱茶對于卡英酸引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞之自由基清除程度。含氧自由基ROS之測定方法如下取0. Iml細(xì)胞(I X 105/ml)貼附于96孔培養(yǎng)板上，與 Iul 之 10mM2，，7，-二氯突光素二乙酯(2，，7，-dichlorofluorescein diacetate)(H2DCFDA,購自 Molecular Probes, Eugene, OR, USA)于 37°C下培育 60 分鐘。接著加入卡英酸150 ii M及GABA 10uM(作為比較組)或不同濃度的臺洱茶水溶液提取物(0 y g、50 y g及250 u g)繼續(xù)培養(yǎng)5、10及30分鐘。H2DCFDA可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，其乙酰殘基可被酯解切除，而留下不能穿透細(xì)胞膜之DCFDA，當(dāng)DCFDA與ROS作用會被氧化成DCF-R0S，經(jīng)熒光檢測儀激發(fā)后，可在波長525nm接收到熒光，而于波長590nm下檢測到熒光。由圖4之結(jié)果顯示，臺洱茶可通過減少自由基的生成，而增加對于卡英酸引發(fā)之神經(jīng)細(xì)胞過度興奮傷害的神經(jīng)保護(hù)作用。
由上述四甲基噻唑藍(lán)(MTT)與細(xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度測試神經(jīng)細(xì)胞受損程度證實(shí)，臺洱茶具有神經(jīng)保護(hù)作用。此外，由含氧自由基(ROS)之測試實(shí)驗(yàn)證實(shí)，臺洱茶可以減少自由基的生成，而增加神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)施例2 :普洱茶保護(hù)因癲癇所引發(fā)之神經(jīng)細(xì)胞過度興奮傷害已知卡英酸會造成持續(xù)性癲癇發(fā)作與不可逆的神經(jīng)細(xì)胞受損?？ㄓ⑺徇€會造成神經(jīng)細(xì)胞腫脹、細(xì)胞器破碎或甚至死亡，以及小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，且活化的現(xiàn)象可能歸因于神經(jīng)受損或過度的神經(jīng)興奮。本實(shí)驗(yàn)以動物模型觀察對于減少卡英酸造成之持續(xù)性癲癇發(fā)作，以及防止因癲癇造成的不可逆神經(jīng)細(xì)胞受損方面之功效。將成年雄性FVB/NJNarl鼠(年齡為8_9周，體重30-35克)以經(jīng)由強(qiáng)迫口胃管灌入的方式，喂食臺洱茶水溶液提取物，(劑量100mg/kg，每組n = 12)喂食3天,第四天以皮下注射卡英酸(紅藻氨酸、kainic acid, 30mg/kg)誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)。第一對照組正常鼠加卡英酸(30mg/kg)皮下注射。第二實(shí)驗(yàn)組臺洱茶加卡英酸(30mg/kg)皮下注射。依據(jù)Racine，癲癇持續(xù)狀態(tài)之行為可區(qū)分成第0階段，正?；顒?；第I階段，靜止；第2階段，姿態(tài)僵硬；第3階段，點(diǎn)頭；第4階段，抽筋+倒下；第5階段，持續(xù)抽筋+倒下；及第6階段，全身強(qiáng)直抽筋攣。觀察記錄癲癇持續(xù)狀態(tài)之行為嚴(yán)重度5小時之后，讓動物自然恢復(fù)。結(jié)果如下表I所示。其中，將嚴(yán)重等級以I (initial，輕微，嚴(yán)重級數(shù)1-2)、M (middle，嚴(yán)重級數(shù)3)與C (critical，嚴(yán)重級數(shù)4_6)表示，I <M < C ;嚴(yán)重級數(shù)1 < 2<3<4<5<6。表I.
~I~I-^i~I-C~~I~\~2~~~~r~6~
對照組(n = 12) 0 0 12 0 0 0 2 0 lo""
~臺洱茶(n = 12) 0 10 2 0 0 10 2 0 0~
待恢復(fù)之后，再隔24小時，以致死量(120mg/kg)戍巴比妥(pentobarbital)進(jìn)行腹腔注射，以4%低聚甲醛(paraformaldehyde)灌流固定將小鼠處死。取冠狀石蠟切片，以H&E染色顯示神經(jīng)元損傷。因癲癇持續(xù)狀態(tài)造成神經(jīng)細(xì)胞的死亡有部分是源于凋亡作用，故另以末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶染色(TUNEL染色)，檢測脫氧核糖核酸斷裂情形。方法簡述如下先將制成石蠟切片的樣品進(jìn)行脫蠟，再加入蛋白酶proteinase K(20ug/mL)至樣品上，并于室溫下作用15分鐘，隨后再以二次蒸餾水(ddH20)進(jìn)行沖洗。使用熒光染色試劑盒(ApopTag in situ Apoptosis Detection Kit-Peroxidase,Oncogene,San Diego,CA,USA)進(jìn)行TUNEL染色分析，樣品中DNA斷裂的部位于外加酶(末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶)的作用下，與異輕基洋地黃毒苷聯(lián)結(jié)脫氧尿喃唳核苷三磷酸(digoxygenin-conjugated dUTP)進(jìn)行結(jié)合標(biāo)記。最后計算呈陽性反應(yīng)的細(xì)胞核數(shù)目，以表示細(xì)胞凋亡之程 度。將實(shí)驗(yàn)組與對照組比較。由圖5之腦神經(jīng)切片結(jié)果顯示，在蘇木精與伊紅染色法(HE stain)下，正常的神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)為圓形，而當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞死亡時，則收縮為長梭形。由腦神經(jīng)切片得知，于喂食臺洱茶之小鼠大腦梨狀皮質(zhì)內(nèi)，呈現(xiàn)因?yàn)榭ㄓ⑺嵴T發(fā)癲癇神經(jīng)細(xì)胞死亡之?dāng)?shù)目較少。此外，由圖6之腦神經(jīng)切片的4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚染色(DAPI&TUNEL stain)得知，在喂食臺洱茶之小鼠大腦海馬回與梨狀皮質(zhì)中，因卡英酸所誘發(fā)之癲癇神經(jīng)細(xì)胞的凋亡數(shù)目，相較于對照組有明顯較少。由前述的說明及圖示已揭示本發(fā)明之較佳實(shí)施例。必須了解到各種增添、修改和取代可能使用于本發(fā)明較佳實(shí)施例，而不會脫離如所附權(quán)利要求所界定的本發(fā)明之精神及范圍。因此，本發(fā)明之范圍應(yīng)由所附權(quán)利要求所界定，并涵蓋其合法均等物，而不限于先前的描述。
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)保護(hù)性組合物，其包含普洱茶水溶液提取物，及食品上或醫(yī)藥上可接受之載體或賦形劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其用于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞之過度興奮傷害。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的組合物，其用于保護(hù)因癲癇所引發(fā)之神經(jīng)細(xì)胞損傷。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的神經(jīng)保護(hù)性組合物，其用于制備治療因癲癇所引發(fā)之神經(jīng)細(xì)胞損傷的醫(yī)藥品。
全文摘要
本發(fā)明涉及普洱茶用于保護(hù)因癲癇所引發(fā)之神經(jīng)細(xì)胞損傷的新用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含普洱茶之抗癲癇組合物。
文檔編號A61K36/82GK102772576SQ20111012241
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者侯建維, 陳玉舜 申請人:宸信生物科技股份有限公司