專利名稱：一種誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法，具體涉及誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法，尤其涉及芍藥苷誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法及用途。
背景技術(shù)：
據(jù)報(bào)道，細(xì)胞移植治療從細(xì)胞水平入手，促進(jìn)缺血部位新生血管形成，改善血液供應(yīng)，是目前治療缺血性血管疾病的新策略。隨著研究者對各種干細(xì)胞生物學(xué)特性認(rèn)識的不斷深入以及分離純化手段的不斷改進(jìn)，使采用干細(xì)胞等治療性血管生成方法在缺血部位重新建立有效的側(cè)支循環(huán)逐漸成為可能；因此，研究者對通過干細(xì)胞移植增加血管生成治療嚴(yán)重的下肢缺血產(chǎn)生了濃厚的興趣。
目前，將干細(xì)胞用于治療缺血性疾病已經(jīng)成為了基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)之一；有關(guān)臨床前期的研究已經(jīng)顯示出干細(xì)胞移植治療令人鼓舞的成果，但是仍存在許多問題亟需解決，如細(xì)胞來源、免疫反應(yīng)及倫理學(xué)爭議等。有研究發(fā)現(xiàn)，臨床治療下肢缺血時(shí)，取得滿意的患肢再灌注，需要移植異源性干細(xì)胞2xl04/g體重；通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增，IOOml健康成人志愿者的外周靜脈血通常約可產(chǎn)生5. OxlO6個(gè)內(nèi)皮干細(xì)胞，按上述研究結(jié)果預(yù)算，用于治療一條嚴(yán)重缺血的肢體，至少需要12升外周靜脈血才能獲得足夠數(shù)量的內(nèi)皮干細(xì)胞，這無疑是極難實(shí)現(xiàn)的，因此，對上述疾患的治療，干細(xì)胞的來源問題亟需解決。有研究表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是除骨髓、外周血之外又一極具有潛力的干細(xì)胞來源，在組織工程、細(xì)胞移植、基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。臍帶作為干細(xì)胞移植的另一種干細(xì)胞來源，與骨髓和外周血造血干細(xì)胞相比有如下顯著優(yōu)點(diǎn)(I)富含可在體內(nèi)長期植入的干、祖細(xì)胞；在作體外集落形成試驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生的集落形成單位比成人骨髓來源的HSC的更大；(2)干細(xì)胞的端粒酶的長度較成年細(xì)胞更長；(3)移植后移植物抗宿主病發(fā)生率低；(4)在體外的長期培養(yǎng)中仍可以擴(kuò)增。目前，隨著干細(xì)胞技術(shù)的迅速發(fā)展，由多能干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化已經(jīng)有了較為完善的技術(shù)，但仍存在分化效率低等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種涉及誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法，具體涉及誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法，尤其涉及芍藥苷誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供所述的方法在制備內(nèi)皮細(xì)胞制劑中的用途。本發(fā)明中，所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源于離體的胎兒臍帶，獲得的臍帶充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)分離、擴(kuò)增和誘導(dǎo)分化過程制得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明的誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法中，將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分別在含有P -巰基乙醇和維甲酸5%DMEM的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)入含有芍藥苷的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基，獲得所需的內(nèi)皮細(xì)胞。該方法利用芍藥苷誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，能有效解決內(nèi)皮細(xì)胞移植治療中因細(xì)胞分化效率低、細(xì)胞分化周期長等缺陷造成的難題。具體而言，本發(fā)明的誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)無菌條件下獲得離體臍帶，經(jīng)含有雙抗的PBS清洗，切碎，再經(jīng)膠原酶和胰酶分別消化，收集單細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞，然后接種培養(yǎng)；
(2)在含有20%胎牛血清、l-50ng/mlbFGF的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隔天換液，3-4天傳代后得到胎臍帶充質(zhì)干細(xì)胞；
(3)上述制得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在含有P-巰基乙醇1-100 u mol/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)24小時(shí)后，在1-100 ii mol/L 5%DMEM的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)24小時(shí)；
(4)將上述誘導(dǎo)后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，轉(zhuǎn)入含有芍藥苷的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基，每隔兩天半量換液，誘導(dǎo)10-14天，獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源內(nèi)皮細(xì)胞；
所述的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基中，含有芍藥苷I-IOOii mol/L、ECGFlOOii mol/L、VEGF50-100ng/ml、bFGF 10-100ng/ml 5%DMEM 的培養(yǎng)基。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述的含有芍藥苷的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基為芍藥苷
0.25mg/L-50mg/L、ECGFl-100ng/ml、VEGF 50_100ng/ml、bFGF 10-100ng/ml 5%DMEM 的培養(yǎng)基。本發(fā)明中，所述的茍藥苷為茍藥及川赤茍根中提取的單體化合物,是白茍及赤茍的主要有效成分，其分子式C23H28011，分子量480. 45，具有式(I )的結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法，其特征在于，將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分別在含有P -巰基乙醇和維甲酸5%DMEM的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)入含有芍藥苷的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基，獲得所需的內(nèi)皮細(xì)胞，包括以下步驟 (1)無菌條件下獲得離體臍帶，經(jīng)含有雙抗的PBS清洗，切碎，再經(jīng)膠原酶和胰酶分別消化，收集單細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞，然后接種培養(yǎng)； (2)在含有20%胎牛血清、l-50ng/mlbFGF的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隔天換液，3-4天傳代后得到胎臍帶充質(zhì)干細(xì)胞； (3)上述制得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在含有P-巰基乙醇1-100 u mol/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)24小時(shí)后，在1-100 ii mol/L 5%DMEM的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)24小時(shí)； (4)將上述誘導(dǎo)后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，轉(zhuǎn)入含有芍藥苷的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基，每隔兩天半量換液，誘導(dǎo)10-14天，獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源內(nèi)皮細(xì)胞。
2.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基中，含有芍藥苷I-IOOii mol/L、ECGFlOOii mol/L、VEGF 50_100ng/ml、bFGF 10-100ng/ml 5%DMEM。
3.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的芍藥苷分子式為C23H28011，分子量% 480. 45，具有式(I )的結(jié)構(gòu):
4.芍藥苷在制備內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的用途。
5.按權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基中，含有芍藥苷I-IOOii mol/L、ECGFlOOii mol/L、VEGF 50_100ng/ml、bFGF 10-100ng/ml 5%DMEM。
6.權(quán)利要求I的方法所制得的內(nèi)皮細(xì)胞在制備內(nèi)皮細(xì)胞制劑中的用途。
7.按權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的內(nèi)皮細(xì)胞制劑在制備治療缺血性血管疾病的藥物或其它原因引起的血管損傷的組織修復(fù)藥物中的用途。
8.按權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的缺血性血管疾病選自缺血性心血管疾病、缺血性腦血管疾病或缺血性下肢血管疾病。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及芍藥苷誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法及用途。本發(fā)明中，所述的芍藥苷具有式(Ⅰ)的結(jié)構(gòu)；所述方法的誘導(dǎo)分化步驟為將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分別在含有β-巰基乙醇1-100μmol/L和維甲酸1-100μmol/L5%DMEM的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入含有芍藥苷的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基，每隔兩天半量換液，誘導(dǎo)10-14天，獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明中，所述的芍藥苷的用途和方法可促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化，并提高分獲效率，可用于缺血性血管疾病的細(xì)胞移植治療；所獲得的內(nèi)皮細(xì)胞可進(jìn)一步制備成細(xì)胞制劑，用于缺血性血管疾病的治療、及血管組織工程的種子細(xì)胞應(yīng)用。
文檔編號A61K35/44GK102776150SQ20111012391
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月13日
發(fā)明者吳萬齡, 姜博仁, 謝曉云, 陸穎理 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院