專利名稱：一種肌球蛋白atp酶活性微量測定方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肌球蛋白ATP酶活性微量測定方法，以經(jīng)典鉬藍(lán)法的反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，通過底物濃度、反應(yīng)體系的PH值、鈣離子濃度、反應(yīng)時間等影響因素考察，確定優(yōu)化反應(yīng)條件，該方法簡便、快速、響應(yīng)值高，線性范圍寬，并可應(yīng)用于抑制劑的篩選，發(fā)現(xiàn)魯斯可皂苷元抑制肌球蛋白ATP酶活性的用途。
背景技術(shù)：
肌球蛋白最早發(fā)現(xiàn)于動物細(xì)胞的肌肉組織和細(xì)胞質(zhì)中，依據(jù)來源不同可以分為傳統(tǒng)型肌球蛋白和非傳統(tǒng)型肌球蛋白。肌球蛋白參與了包括肌肉收縮、胞質(zhì)分裂、神經(jīng)突觸生長、靶向小泡運輸及信號傳導(dǎo)等內(nèi)在的多種細(xì)胞活動，是生物體內(nèi)非常重要的一大類ATP驅(qū)動蛋白，肌球蛋白能利用自身的ATP結(jié)合位點催化ATP釋放能量，并將這些能量轉(zhuǎn)化為機械能而參與諸多細(xì)胞活動，在細(xì)胞的遷移、黏附、機體的免疫應(yīng)答以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生理病理過程中均發(fā)揮著重要的作用，是國際日益關(guān)注的熱點之一。因此，研究肌球蛋白ATP酶活性既可以探討肌球蛋白生理特性，也是闡釋心血管疾病和腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展機制，并篩選發(fā)現(xiàn)新型抑制劑的重要途徑(宋佳希等.非肌肉肌球蛋白重鏈 II A(NMHC II Α)生理病理功能研究進(jìn)展.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9 (20) =3964-3979 ； Manzanares MV et al. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology,2009,10(11) 778-790 ；Wrighton KH. Autophagy :Myosin II moves in on autophagosomes. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2011,12 :77)。盡管目前關(guān)于測定肌球蛋白ATP酶活性方法的報道很多，如比色法 (包括鉬藍(lán)法、孔雀綠法和其它方法)、放射性標(biāo)記法、NADH酶偶聯(lián)測定法等，后兩類方法由于需要特殊的標(biāo)記物和專用設(shè)備而限制了在一般普通實驗室推廣應(yīng)用。文獻(xiàn)報導(dǎo)的鉬藍(lán)法測定肌球蛋白ATP酶活性方法主要步驟(林麗軍.肌球蛋白的ATPase活性及熱凝膠特性研究[D],南京南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004 35-44)1)分別取Iml肌球蛋白試液(含1 X 10_3mM肌球蛋白)，0. 5ml氯化鈣溶液(含 5. OmM氯化鈣)，補加三羥甲基氨基甲烷(Tris)-馬來酸緩沖液(25mM，pH 5. 5)至終體積為 9ml，混勻25°C水浴共孵IOmin ；2)加入ATP Iml (含l.OmM ATP)，補加Tris-馬來酸緩沖液至終體積為10ml，混勻 25°C水浴孵育IOmin ；3)加入IOml 15% TCA(150g. L—1)，混勻置冰水浴中止反應(yīng)；4) 3000g離心5min，取5ml上清液置于100ml容量瓶中，加入8ml鉬酸銨溶液(25g. ，2ml氯化亞錫溶液(100g. Γ1)，分別補加Tris-馬來酸緩沖液至終體積為100ml，混勻
25 °C水浴反應(yīng)20min ；5)酶標(biāo)儀700nm處測定吸光度(OD)值。由于測定液中磷酸離子濃度與吸光值成正比，所以最后以吸光值代表肌球蛋白 IIATPase 活性。
上述方法由于存在著試劑消耗量和反應(yīng)體系所需液體量均過大(單管反應(yīng)體系達(dá)到100ml)的問題，不利于進(jìn)行大規(guī)模抑制劑的篩選。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種肌球蛋白ATP酶活性微量測定方法，其可用于抑制劑篩選。本發(fā)明建立一種簡便、經(jīng)濟、靈敏度高、線性范圍寬的肌球蛋白ATP酶活性微量測定方法，并驗證了使用該方法篩選抑制劑的可靠性。本發(fā)明可使肌球蛋白水解ATP產(chǎn)生的單體磷在IOmin內(nèi)顯色穩(wěn)定，克服了經(jīng)典方法因顯色緩慢而導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確的問題。同時，經(jīng)方法學(xué)考察證明本方法對單體磷的定量具有更寬的線性范圍?？紤]到測定成本，發(fā)明人按照文獻(xiàn)報道經(jīng)典鉬藍(lán)法(林麗軍.肌球蛋白的AIPase 活性及熱凝膠特性研究[D].南京南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004 :35-44)等比例縮小反應(yīng)體積至 200 μ 1進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)吸光度值較低，響應(yīng)值低、顯色緩慢、線性范圍較窄等不理結(jié)果，見表 1、

圖1，不能滿足測定要求。為經(jīng)濟、簡便、快速的測定肌球蛋白ATP酶活性，發(fā)明人通過考察底物濃度、反應(yīng)時間、ΡΗ、鈣離子濃度等影響酶促反應(yīng)的相關(guān)因素，優(yōu)化試劑比例、反應(yīng)條件，優(yōu)選到一種肌球蛋白ATP酶活性微量方法，明顯減少價格昂貴的肌球蛋白的用量。通過提高底物ATP的相對濃度而有利于提高酶催化的效率，將ATP與肌球蛋白的摩爾比控制為2000 1，控制顯色劑鉬酸銨和氯化亞錫摩爾比為5. 5 1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯色時間較之經(jīng)典方法減少了一半，加快了整個反應(yīng)的進(jìn)程。本發(fā)明方法測得紫外吸收值明顯高于經(jīng)典方法，一方面說明本方法有更高的催化效率，另一方面提高了對單體磷定量的準(zhǔn)確性；對單體磷定量的線性范圍(50-3200 μ Μ. (IOOmir1明顯寬于現(xiàn)有方法(200-1200或100-1600 μ Μ. (100ml)-1) ο并以國際通用的肌球蛋白ATP酶特異性抑制劑-blelAistatin為對照藥，證明了所建立方法的有效性。本發(fā)明的肌球蛋白ATP酶活性的微量測定方法，包括取肌球蛋白試液、氯化鈣溶液、Tris-馬來酸緩沖液混勻后水浴共孵；加入ATP液和Tris-馬來酸緩沖液，混勻后水浴孵育；加入三氯乙酸(TCA)液，混勻后置冰水浴中止反應(yīng)；離心后取上清液依次加入鉬酸銨溶液、氯化亞錫溶液、Tris-馬來酸緩沖液，25°C水浴顯色，用酶標(biāo)儀700nm測定吸光度值， 吸光度值高低則代表肌球蛋白II AIPase活性的大小。其中ATP與肌球蛋白的摩爾比為 2000 1，鉬酸銨溶液和氯化亞錫溶液摩爾比5. 5 1。更為優(yōu)選的肌球蛋白ATP酶活性的微量測定方法，依次包括a.取濃度為2. 5 X 10_4mM的肌球蛋白試液2 μ 1、ImM的氯化鈣溶液10 μ 1，至終體積為100 μ 1的25mM Tris-馬來酸緩沖液，混勻后水浴共孵IOmin ；b.加入0. 5mM的ATP液5 μ 1，補加Tris-馬來酸緩沖液至200 μ 1，混勻后水浴孵育 IOmin ；c.加入15% TCA液，混勻后置冰水浴中止反應(yīng)；d.離心后取上清液60 μ 1置于96孔板中，依次加入ZSg.L—1鉬酸銨溶液20 μ 1， IOOg. L—1氯化亞錫溶液8 μ 1，補加Tris-馬來酸緩沖液至終體積為200 μ 1，混勻25°C水浴顯色I(xiàn)Omin后，用酶標(biāo)儀700nm測定吸光度值。其中Tris-馬來酸緩沖液的pH優(yōu)選為7. 0。
以下為具體優(yōu)化過程1.單體磷回歸曲線的繪制采用現(xiàn)有測定方法(等比縮小體積至200μ1)繪制單體磷曲線，分別取單體磷溶液(0. 5mM)0. 1、0· 2、0· 4μ 1、0· 8μ 1、1· 6μ 1、3· 2μ 1、6· 4μ 1,12. 8、25· 6μ 1，依次力口 Λ 16μ 1鉬酸銨溶液(25g.r1),4y 1氯化亞錫溶液(lOOg.L—1)，補加Tris-馬來酸緩沖液至終體積為200 μ 1，即得終濃度分別為50、100、200、400、800、1600、3200、6400μΜ. (IOOmir1的反應(yīng)體系?；靹?5°C水浴反應(yīng)lOmin，酶標(biāo)儀700nm處測OD值。以測得的吸光度值為縱坐標(biāo)，磷酸根濃度為橫坐標(biāo)作圖，經(jīng)計算，單體磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y = 0. 0001Χ+0. 0221，相關(guān)系數(shù)為0. 995 (圖1)，表明單體磷濃度在100-1600 μ Μ. (100ml”)內(nèi)， 與吸光度值有很好的相關(guān)性。采用本發(fā)明方法繪制單體磷曲線，結(jié)果由圖2可見，表明單體磷濃度在50-3200 μ M. (100ml)-1)內(nèi)，與吸光度值有很好的相關(guān)性，經(jīng)計算，單體磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Υ = 0. 0574Χ-0. 0101，相關(guān)系數(shù)為0. 9992，表明本方法線性范圍寬。2.底物(ATP)濃度對肌球蛋白ATPase的影響 底物濃度是影響酶活性測定的重要指標(biāo)。分別加入ATP溶液(IOOmM)O. Ιμ 、 0. 2μ 1、0. 4μ 1、0. 5μ 1、0. 6μ 1,1. 0μ 1,2. 0μ 1，即得終濃度分別為 0. lmM、0. 2mM、0. 4mM、 0. 5mM、0. 6mM、l. OmM,2. OmM的反應(yīng)體系，其余操作同改進(jìn)肌球蛋白ATP酶活性測定方法。以測得的吸光度值為縱坐標(biāo)，ATP濃度為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果由圖3可見，ATP濃度低于0. 5mM 時，體系的吸光度值隨底物濃度增加而顯著增大。底物濃度高于0. 5mM時，底物濃度成倍增力口，而吸收值僅略有增大。加之ATP自身也是有機磷，濃度過大會給游離磷酸根濃度的測定帶來干擾，因此ATP的使用濃度優(yōu)選0. 5mM。3. pH值對肌球蛋白ATPase的影響文獻(xiàn)報道的關(guān)于鉬藍(lán)法最適pH不盡一致，本實驗將Tris-馬來酸緩沖液(25mM) 使用氫氧化鈉溶液(0. 1M)分別調(diào)節(jié)pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，重新考察了 PH5. 0-8. 0范圍內(nèi)反應(yīng)體系的最適pH。以測得的吸光度值為縱坐標(biāo)，反應(yīng)體系的不同pH值為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果由圖4可見，pH對該反應(yīng)體系下肌球蛋白ATPase影響不顯著。肌球蛋白ATPase在pH 7. 0時有相對最強酶活性，因此pH 7. 0為該體系最適pH值。4.氯化鈣濃度對肌球蛋白ATPase的影響分別加入4μ 1、6μ 1、8μ 1、10μ 1、12μ 1、14μ 1 氯化鈣溶液(0· ImM)，即得到鈣離子終濃度分別為0. 4mM、0. 6mM、0. 8mM、l. OmMU. 2mM、l. 4mM的反應(yīng)體系，采用本方法進(jìn)行 ATP酶活性測定。以測得的吸光度值為縱坐標(biāo)，反應(yīng)體系的不同氯化鈣濃度為橫坐標(biāo)作圖， 結(jié)果由圖5可見，氯化鈣濃度低于LOmM時，體系的吸光度值隨氯化鈣濃度濃度增加而增大；當(dāng)氯化鈣濃度高于1. OmM時，體系的吸光度值反而有較為明顯的下降，因此選擇，氯化鈣的使用濃度優(yōu)選l.OmM。5.孵育時間對肌球蛋白ATPase的影響肌球蛋白與氯化鈣在孵育過程結(jié)合形成活化的鈣調(diào)蛋白，該蛋白-離子復(fù)合物具有催化ATP水解的活性。將孵育時間分別設(shè)定為211^11、51^11、81^11、101^11、151^11、201^11，其余操作同前。以測得吸光度值為縱坐標(biāo)，ATP與氯化鈣共孵育時間為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果由圖 6可見，肌球蛋白與氯化鈣共孵2-lOmin時間段內(nèi)時，該復(fù)合物的ATP水解活性隨時間增加顯著增加。但是隨著共孵時間繼續(xù)增加，復(fù)合物的ATP水解活性基本無變化。因此，肌球蛋白與鈣離子共孵IOmin即可達(dá)到最佳催化活性。6.顯色時間對肌球蛋白AIPase的影響鉬藍(lán)法是測定肌球蛋白ATP酶活性經(jīng)典方法，但是該法顯色緩慢而限制了其推廣應(yīng)用。本方法調(diào)整鉬酸銨和氯化亞錫的比例(5.5 1)后，重新考察了顯色時間對顯色結(jié)果的影響。將加入顯色劑后的反應(yīng)時間分別設(shè)定為2min、5min、8min、10min、20min、30min， 其余操作同前。以測得吸光度值為縱坐標(biāo)，不同顯色時間為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果由圖7可見， 反應(yīng)體系加入顯色劑IOmin后，其吸光度值不再有變化，說明此時顯色反應(yīng)已進(jìn)行完全，并且形成的顯色復(fù)合物穩(wěn)定。因此，改進(jìn)方法在很大程度上克服了經(jīng)典鉬藍(lán)法顯色緩慢的缺點ο因此，本發(fā)明與現(xiàn)有方法比較，不僅成本低，并且線性范圍寬，表1是本發(fā)明方法與現(xiàn)有測定方法的比較，同時還列出了按現(xiàn)有方法等體積縮小至200μ 1后的測定結(jié)果。表1改進(jìn)的肌球蛋白ATP酶活性微量方法與現(xiàn)有測定方法對比表格
權(quán)利要求
1.一種肌球蛋白ATP酶活性的微量測定方法，包括取肌球蛋白試液、氯化鈣溶液、 Tris-馬來酸緩沖液混勻后水浴共孵；加入ATP液和Tris-馬來酸緩沖液，混勻后水浴孵育；加入三氯乙酸液，混勻后置冰水浴中止反應(yīng)；離心后取上清液依次加入鉬酸銨溶液、氯化亞錫溶液、Tris-馬來酸緩沖液，250C水浴顯色，用酶標(biāo)儀700nm測定吸光度值，其特征是ATP與肌球蛋白的摩爾比為2000 1，鉬酸銨與氯化亞錫摩爾比為5. 5 1。
2.權(quán)利要求1的微量測定方法，依次包括a.取濃度為2.5X 10_4mM的肌球蛋白試液2 μ l、lmM的氯化鈣溶液10 μ 1，至終體積為 100 μ 1的25mM Tris-馬來酸緩沖液，混勻后水浴共孵IOmin ；b.加入0.5mM的ATP液5μ 1，補加Tris-馬來酸緩沖液至200μ 1，混勻后水浴孵育 IOmin ；c.加入15%三氯乙酸液，混勻后置冰水浴中止反應(yīng)；d.離心后取上清液60μ 1置于96孔板中，依次加入25g. L-1鉬酸銨溶液20 μ 1，IOOg. Γ1氯化亞錫溶液8 μ 1，補加Tris-馬來酸緩沖液至終體積為200 μ 1，，混勻25°C水浴顯色 IOmin后，用酶標(biāo)儀700nm測定吸光度值。
3.權(quán)利要求1或2的微量測定方法，其中Tris-馬來酸緩沖液的pH為7.0。
4.魯斯可皂苷元作為制備肌球蛋白ATP酶活性抑制劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種肌球蛋白ATP酶活性微量測定方法，其特征是以經(jīng)典鉬藍(lán)法的反應(yīng)方法為基礎(chǔ)，控制ATP與肌球蛋白的摩爾比為2000∶1，鉬酸銨與氯化亞錫摩爾比為5.5∶1。本發(fā)明測定方法簡便、快速、響應(yīng)值高，線性范圍寬，并可應(yīng)用于抑制劑的篩選，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)魯斯可皂苷元抑制肌球蛋白ATP酶活性的用途。
文檔編號A61K31/58GK102288601SQ20111012516
公開日2011年12月21日 申請日期2011年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月16日
發(fā)明者余伯陽, 寇俊萍, 張冠軍 申請人:中國藥科大學(xué)