專利名稱：一種雷公藤有效部位粉末的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥有效成分提取分離方法，具體涉及一種雷公藤有效部位粉末的制備方法。
背景技術(shù)：
有關(guān)調(diào)查結(jié)果顯示，我國的慢性腎病患病率在8%左右。各種慢性腎臟疾病如常見的慢性腎炎、慢性腎盂腎炎、自身免疫性疾病腎損害等，給患者家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。慢性腎炎是一組多病因的慢性腎小球病變?yōu)橹鞯哪I小球疾病，目前認(rèn)為它可能是由于各種細(xì)菌、病毒或原蟲等感染，通過免疫機(jī)制炎癥介質(zhì)因子及非免疫機(jī)制等引起，臨床上主要采用激素、免疫抑制劑治療。雷公藤(Tripterygium Wilfordii Hook, f)系衛(wèi)矛科雷公藤屬 植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主產(chǎn)于我國的湖北、湖南、福建等省，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗生育等多種藥理活性，至今已從雷公藤中分離得到了數(shù)百種化學(xué)成分，其中主要的活性成分為萜類成分，包括倍半萜生物堿、二萜以及三萜類化合物。自1977年黎磊石院士等首次報(bào)導(dǎo)中藥雷公藤治療腎小球腎炎以來，雷公藤已廣泛用于各種原發(fā)性和繼發(fā)性腎炎的治療，并顯示了獨(dú)特的療效。雷公藤化學(xué)成分眾多，藥理作用復(fù)雜，其中既含有藥效成分，也含有毒性成分，這使雷公藤提取物具有良好而獨(dú)特的臨床治療效果，同時(shí)又導(dǎo)致其具有明顯的毒副作用，限制了雷公藤在臨床上的應(yīng)用。盡量富集雷公藤提取物中的藥效成分而去除無效和有毒成分，可以大大降低雷公藤提取物的毒性，同時(shí)保持其有效性，使臨床用藥安全得到提高。文獻(xiàn)報(bào)道，雷公藤紅素是一種毒性成分(朱曉明等，中華器官移植雜志，1996，1:21)，由此我們有針對性的除去雷公藤紅素，降低其毒副作用?，F(xiàn)有的雷公藤制劑，其原料來源多用雷公藤的去皮根提取物。雷公藤提取物在制備工藝上有醇提乙酸乙酯萃取法，水提氯仿萃取后柱層析方法，醇提氯仿萃取后柱層析方法等方法(專利 CN 200710043857. I ；CN 200910196969. X ；US 5580562 ;夏志林等，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1994，3，135)，這些制備方法存在如下缺點(diǎn)I.乙酸乙酯直接萃取方法，其提取有效成分復(fù)雜，有效成分含量低，不利于下一步制劑生產(chǎn)。2.用柱層析方法，雖然有效成分含量高，但有機(jī)溶劑用量大，大多數(shù)情況下用到氯仿，毒性大。3.柱層析方法中，用混合溶劑，操作復(fù)雜以及進(jìn)一步回收利用困難。4.針對性不強(qiáng)。雷公藤所含化學(xué)成分復(fù)雜，現(xiàn)有的工藝制備的原料沒有根據(jù)不同疾病對化學(xué)成分成分進(jìn)行有針對性的取舍，導(dǎo)致副作用高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雷公藤有效部位粉末的制備方法，解決現(xiàn)有提取方法針對性不強(qiáng)，生產(chǎn)成本高、處理過程復(fù)雜等問題。
本發(fā)明的一種雷公藤有效部位粉末的制備方法，包括以下步驟(1)粉碎選用雷公藤根莖，干燥粉碎后制得雷公藤粉末；(2)醇提將雷公藤粉末用濃度為90wt% IOOwt%的乙醇回流提取2 3次，將各次提取液合并后，回收乙醇，得粗提浸膏；(3)第一次萃取將粗提浸膏用乙酸乙酯溶劑萃取I 3次，乙酸乙酯溶劑與粗提浸膏用量比為5 8mL lg，合并各次萃取液，濃縮萃取液至原體積的20% 40%，得到濃縮萃取液；(4)第二次萃取以碳酸鹽水溶液對步驟(3)所得濃縮萃取液萃取2 3次，棄去碳酸鹽水溶液，得到二次萃取液，用等體積的水洗二次萃取液2 3次后，回收二次萃取液溶劑，干燥得到有效部位粉末；所述碳酸鹽水溶液中碳酸鹽的含量為2wt% 5wt%，碳酸鹽水溶液和濃縮萃取液的體積比為0.5 1.5 I。以上述方法制備的雷公藤有效部位粉末，萜類成分總含量超過50%，有毒成分雷公藤紅素含量少于0. 2%，主要用于慢性腎炎的治療。所述的制備方法，優(yōu)選地，所述粉碎步驟中，所述雷公藤根莖為帶皮的雷公藤根莖；所述步驟(4)中，所述碳酸鹽為碳酸鈉或碳酸鉀。本發(fā)明中所用乙醇、乙酸乙酯溶劑，可以回收以后繼續(xù)使用。本發(fā)明操作簡單，有毒有機(jī)溶劑使用少，溶劑均可以方便的回收使用，生產(chǎn)成本低，易于工業(yè)化生產(chǎn)，在第二次萃取步驟中去除了毒性的酸性成分(紅素)，本方法制備的粉末主要針對慢性腎炎疾病，有效成分的含量高于50%，毒副作用少。
具體實(shí)施例方式以下本發(fā)明所制備的有效部位粉末中的萜類成分中總二萜內(nèi)酯，總?cè)坪?，倍半萜生物堿，雷公藤紅素的測定如下?？偠苾?nèi)酯含量測定(I)對照品溶液的制備精密稱取雷公藤甲素對照品，用濃度70%的乙醇超聲溶解，制備濃度為0. 15mg/mL的對照品忙備液；(2)供試品溶液的制備取雷公藤有效部位粉末30mg，用5mL氯仿溶解后，上柱(SPE小柱，長6. 0cm、直徑0. 8cm，填料用量I. 5g，為100-200目氧化鋁)，以20mL氯仿-甲醇混合溶劑(體積比95 5)洗脫，收集流出液和洗脫液，減壓蒸干，用濃度70%的乙醇超聲溶解，定容至25mL;(3)線性關(guān)系考察:分別準(zhǔn)確移取對照品貯備液0. lmL、0. 2mL、0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0. 6mL、0. 8mL于具有塞子的刻度試管中，加入濃度70%的乙醇至4. OmL，再加入濃度2%的3，5- 二硝基苯甲酸溶液0. 5mL,濃度2%的KOH溶液0. 5mL,搖勻，使之反應(yīng)。測定在549nm下顯色30min時(shí)的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y = 0. 0172x+0. 0234，R2 = 0. 9991 ；(4)含量測定吸取I. OmL供試品溶液，加入濃度70%的乙醇至4. OmL，再加入濃度2%的3，5- 二硝基苯甲酸溶液0. 5mL,濃度2%的KOH溶液0. 5mL,搖勻，使之反應(yīng)。測定在549nm下顯色30min時(shí)的吸光度,按下列公式計(jì)算總二職內(nèi)酯含量總二萜內(nèi)酯含量=(供試品吸光度/對照品吸光度)X對照品濃度X 125。
總?cè)坪繙y定(I)對照品溶液的制備精密稱取雷公藤內(nèi)酯甲對照品，乙醇超聲溶解，制備濃度為0. 175mg/mL的對照品忙備液(2)供試品溶液的制備取雷公藤有效部位粉末5mg，5mL氯仿溶解上住(SPE小柱，長6. Ocm,直徑0. 8cm,填料100-200目氧化鋁，用量I. 5g)，以20mL氯仿-甲醇混合溶液(95 5)洗脫，收集流出液和洗脫液，減壓蒸干，乙醇超聲溶解，定容至25mL。(3)線性關(guān)系考察準(zhǔn)確移取對照品貯備液20^、40^、60^，80^、100^、120 u L于具塞刻度試管中，吹干。加入5%香草醛-冰醋酸0. 2mL、高氯酸0. 8mL，60°C水浴中加熱顯色15min，冷卻后加入冰醋酸4mL。測定在540nm下吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y = 9. 9688X+0. 5251，R2 = 0. 9926 ； (4)含量測定吸取0. ImL供試品溶液，吹干。加入5%香草醛-冰醋酸0. 2mL、高氯酸0. 8mL，60°C水浴中加熱顯色15min，冷卻后加入冰醋酸4mL。測定在540nm下的吸光度，按下列公式計(jì)算總?cè)坪靠側(cè)坪?(供試品吸光度/對照品吸光度)X對照品濃度X 1250?？偙栋胼粕飰A含量測定(I)對照品溶液的制備精密稱取雷公藤次堿對照品，乙醇超聲溶解，制備濃度為0. 4mg/mL的對照品忙備液。(2)供試品溶液的制備取雷公藤有效部位粉末10mg，5mL氯仿溶解上住(SPE小柱，長6. Ocm,直徑0. 8cm,填料100-200目氧化鋁，用量I. 5g)，以20mL氯仿-甲醇混合溶劑(95 5)洗脫，收集流出液和洗脫液，減壓蒸干，乙醇超聲溶解，定容至25mL。(3)線性關(guān)系考察精密吸取上述對照品貯備液0. 3mL, 0. 5mL, I. OmL, 2. OmL,4. OmL置于5mL容量瓶中，乙醇定容，搖勻。在267nm處測定吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y = 0. 0051x+0. 0007, R2 = 0. 9998。(4)含量測定取供試品溶液lmL，定容至5mL，在267nm處測定吸光度值。按下面公式計(jì)算總生物堿的含量?？偙栋胼粕飰A含量=(供試品吸光度/對照品吸光度)X對照品濃度X 125。雷公藤紅素含量測定(I)對照品溶液的制備精密稱取雷公藤紅素對照品，甲醇超聲溶解，制備濃度為0. 2mg/mL的對照品忙備液。(2)供試品溶液的制備取雷公藤有效部位粉末15mg，用IOmL乙醇溶解后，定容到25mL。溶液過0. 45 ii m微孔濾膜后，取續(xù)濾液作為供試品溶液。(3)線性關(guān)系考察精密吸取上述對照品貯備液0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6. OmL置于IOmL容量瓶中，甲醇定容，搖勻。進(jìn)HPLC檢測，得到紅素色譜峰，并計(jì)算色譜峰峰面積大小。色譜條件色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18柱(250_X4. 6_X5um);流動(dòng)相甲醇1%醋酸=(90 10);流速d.OmL/min—1 ;檢測波長425nm，進(jìn)樣量10iiL ;柱溫25°C。以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y =13771X-7. 9093(r = 0. 9999)(4)含量測定取供試品溶液,進(jìn)HPLC檢測，進(jìn)樣量10ii L。記錄峰面積，按下面公式計(jì)算雷公藤紅素含量。
紅素含量=(供試品峰面積/對照品峰面積)X對照品濃度X 25。下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例I本實(shí)施例所述雷公藤有效部位粉末的制備方法，包括以下步驟(I)粉碎步驟選用雷公藤帶皮根莖I. 0kg，干燥粉碎后制得雷公藤粉末；(2)醇取步驟將雷公藤粉末用濃度為100%的乙醇回流提取2次，將2次提取液合并后，回收乙醇，得粗提浸膏70g ；(3)第一次萃取步驟將粗提浸膏用乙酸乙酯溶劑萃取I次，乙酸乙酯溶劑與粗提浸膏用量比為8mL lg，濃縮萃取液至原體積的40%，得到濃縮萃取液；
(4)第二次萃取步驟以濃度為2wt %的碳酸鈉水溶液對濃縮萃取液萃取3次，碳酸鈉水溶液和濃縮萃取液的體積比為0.5 I ;棄去碳酸鈉水溶液，得到二次萃取液，用等體積的水洗二次萃取液2次后，回收二次萃取液溶劑，干燥得到有效部位粉末15g。萜類成分為59.3%，其中總二萜內(nèi)酯含量1.3%，總?cè)坪?4%，倍半萜生物堿為44%，雷公藤紅素含量0. 09%。實(shí)施例2本實(shí)施例所述雷公藤有效部位粉末的制備方法，包括以下步驟(I)粉碎步驟選用雷公藤帶皮根莖I. 0kg，干燥粉碎后制得雷公藤粉末；(2)醇取步驟將雷公藤粉末用濃度為90wt%的乙醇回流提取3次，將各次提取液合并后，回收乙醇，得粗提浸膏76g ；(3)第一次萃取步驟將粗提浸膏用乙酸乙酯溶劑萃取2次，乙酸乙酯溶劑與粗提浸膏用量比為5mL lg，合并各次萃取液，濃縮萃取液至原體積的20%，得到濃縮萃取液；(4)第二次萃取步驟以5wt %的碳酸鈉水溶液對濃縮萃取液萃取2次，碳酸鈉水溶液和濃縮萃取液的體積比為I : I ;棄去碳酸鈉水溶液，得到二次萃取液，用等體積的水洗二次萃取液2次后，回收二次萃取液溶劑，干燥得到有效部位粉末19g ;萜類成分為56%，其中總二萜內(nèi)酯含量1.2%，總?cè)坪?5 %，總倍半萜生物堿為40 %，雷公藤紅素含量0. 11%。實(shí)施例3本實(shí)施例所述雷公藤有效部位粉末的制備方法，包括以下步驟(I)粉碎步驟選用雷公藤帶皮根莖I. 0kg，干燥粉碎后制得雷公藤粉末；(2)醇取步驟將雷公藤粉末用濃度為90wt%的乙醇回流提取3次，將各次提取液合并后，回收乙醇，得粗提浸膏76g ；(3)第一次萃取步驟將粗提浸膏用乙酸乙酯溶劑萃取3次，乙酸乙酯溶劑與粗提浸膏用量比為5mL lg，合并各次萃取液，濃縮萃取液至原體積的20%，得到濃縮萃取液；(4)第二次萃取步驟以5wt%的碳酸鈉水溶液對濃縮萃取液萃取3次，碳酸鹽水溶液和濃縮萃取液的體積比為I : 1，棄去碳酸鹽水溶液，得到二次萃取液，用等體積的水洗二次萃取液3次后，回收二次萃取液溶劑，干燥得到有效部位粉末18g ;萜類成分為57. 5 %，其中總二萜內(nèi)酯含量1.5%，總?cè)坪?4%，總倍半萜生物堿為42%，雷公藤紅素含量0. 08%。實(shí)施例4
本實(shí)施例所述雷公藤有效部位粉末的制備方法，包括以下步驟(I)粉碎步驟選用雷公藤去皮根莖I. 0kg，干燥粉碎后制得雷公藤粉末；(2)醇取步驟將雷公藤粉末用濃度為100%的乙醇回流提取3次，將各次提取液合并后，回收乙醇，得粗提浸膏45g ；(3)第一次萃取步驟將粗提浸膏用乙酸乙酯溶劑萃取2次，乙酸乙酯溶劑與粗提浸膏用量比為8mL lg，合并各次萃取液，濃縮萃取液至原體積的20%，得到濃縮萃取液；(4)第二次萃取步驟以濃度為2wt %的碳酸鉀水溶液對濃縮萃取液萃取3次，碳酸鉀水溶液和濃縮萃取液的體積比為1.5 I ;棄去碳酸鉀水溶液，得到二次萃取液，用等體積的水洗二次萃取液3次后，回收二次萃取液溶劑，干燥得到有效部位粉末Ilg ;萜類成分為52. 5 %，其中總二萜內(nèi)酯含量I. 5%，總?cè)坪?4%，總倍半萜生物堿為37%，雷公藤紅素含量0. 02%。 通過上述測定可以看出，本發(fā)明制備的雷公藤有效部位粉末中，活性成分萜類成分含量高，有毒成分紅素含量限制在較低范圍。實(shí)施例5 毒性實(shí)驗(yàn)在臨床應(yīng)用中，雷公藤提取物肝毒性是常見的副反應(yīng)。我們選用人IH常肝細(xì)胞系HL-7702，將雷公藤粗提浸膏、雷公藤有效部位粉末溶液與肝細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時(shí)，以空白溶劑作為對照(100%存活)，采用IC5tl(半數(shù)致死量)值來反映測試物的毒性大小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表I。藥效評價(jià)慢性腎炎中，系膜細(xì)胞的炎性增殖既是慢性腎炎的初期反映，也是后續(xù)病情惡化的發(fā)起者。抑制系膜細(xì)胞的增殖可以有效緩解慢性腎炎發(fā)展。取雷公藤粗提浸膏、雷公藤有效部位粉末進(jìn)行抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)來評價(jià)各個(gè)部位針對慢性腎炎的活性大小，采用EC5tl(半數(shù)有效量)來反映各個(gè)部位活性大小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表I。表I實(shí)施例I各個(gè)部位毒性和活性大小
_樣品__IC50(tig/mL) EC50(tig/mL) IG50/ EC50雷公藤粗提浸膏 4.89 士0.30 1.28士 0.193.82 雷公藤有效部位粉末 14.52±1.41 2.42±0.29 6.0IC50越大表明毒性越小，耐受性越高；ec5Q越小表明活性越強(qiáng)，效果好，ic5Q/ec5Q值綜合反映了藥物的安全性，值越大表明安全范圍越廣，藥物越安全。通過表I可以看出，本發(fā)明制備的雷公藤有效部位粉末顯示良好的抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖作用，EC50為2.42i!g/mL，并且毒效比(IC5Q/EC5(i)比雷公藤粗提浸膏要大，這表明針對慢性腎炎疾病，雷公藤有效部位粉末安全性更高。以上是針對本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說明，但該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。
權(quán)利要求
1.一種雷公藤有效部位粉末的制備方法，其特征是，包括以下步驟 (1)粉碎選用雷公藤根莖，干燥粉碎后制得雷公藤粉末； (2)醇提將雷公藤粉末用濃度為90wt% IOOwt%的乙醇回流提取2 3次，將各次提取液合并后，回收乙醇，得粗提浸膏； (3)第一次萃取將粗提浸膏用乙酸乙酯溶劑萃取I 3次，乙酸乙酯溶劑與粗提浸膏的用量比為5 8mL lg，合并各次萃取液，濃縮萃取液至原體積的20% 40%，得到濃縮萃取液； (4)第二次萃取以碳酸鹽水溶液對步驟(3)所得濃縮萃取液萃取2 3次，棄去碳酸鹽水溶液，得到二次萃取液，用等體積的水洗二次萃取液2 3次后，回收二次萃取液溶劑，干燥得到有效部位粉末；所述碳酸鹽水溶液中碳酸鹽的含量為2wt% 5wt%，碳酸鹽水溶液和濃縮萃取液的體積比為0. 5 I. 5 I。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征是，所述步驟(I)中，所述雷公藤根莖為帶皮的雷公藤根莖。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的制備方法，其特征是，所述步驟(4)中，所述碳酸鹽為碳酸鈉或碳酸鉀。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于治療慢性腎炎的雷公藤有效部位粉末的制備方法，屬于中藥有效成分提取分離技術(shù)。本方法包括以下過程將雷公藤根莖粉末以乙醇提取，回收溶劑，浸膏用乙酸乙酯溶劑萃取后濃縮至一定體積；乙酸乙酯萃取液用2wt％-5wt％碳酸鹽水溶液萃取2-3次后，回收有機(jī)層，干燥得到粉末。制得有效部位粉末萜類成分含量超過50％，有毒成分紅素含量小于0.2％。本方法操作簡單，生產(chǎn)成本低，有效成分含量高、毒性低，主要用于治療慢性腎炎疾病。
文檔編號A61K36/37GK102793737SQ201110139090
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者林偉基, 楊祥良, 謝培山, 徐輝碧, 顏玉貞, 方偉, 彭帆, 張聰, 葉曉川 申請人:澳門科技大學(xué)