專利名稱：一種高純度丹酚酸a的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物藥物領(lǐng)域，特別是涉及一種高純度丹酚酸A的制備方法。
背景技術(shù)：
丹參是唇形科鼠尾草屬植物，作為我國常用中藥材已有悠久的臨床應(yīng)用歷史，在心血管疾病的治療中具有重要的地位，其顯著的療效已得到臨床上的廣泛認(rèn)可。丹參的有效化學(xué)成分主要有兩大類脂溶性丹參酮類化合物和水溶性丹酚酸類化合物。丹酚酸具有廣泛的抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基等作用，在已知酚類化合物中丹參酚酸類化合物的抗氧化活性最強，其中又以丹參酚酸A(簡稱丹酚酸A)抗氧化活性最強。丹酚酸A具有良好的脂溶和透膜能力，與丹參中大部分酚酸類物質(zhì)相比，其細(xì)胞滲透能力更強，生物利用度更高。因此，丹酚酸A具有很高的藥用開發(fā)價值。但是，在丹參中的丹酚酸A的天然含量極低(約為丹參藥材的0. 01 0. 06% )， 從丹參中提取丹酚酸A不僅原藥材成本過高，分離純化難度也大，嚴(yán)重制約著該產(chǎn)品的研究和開發(fā)，成為其產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。近年來為解決丹酚酸A的來源問題，人們嘗試從丹參中對丹酚酸A進(jìn)行轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)通過丹酚酸B的降解可以得到一定量的丹酚酸A，而丹酚酸B也是丹參中重要的有效成分。如中國專利200710001055. 4公開了一種丹參丹酚酸A的制備方法，是通過對丹酚酸B 降解處理而獲得丹酚酸A。由于丹參中還含有重要的脂溶性有效成分如丹參酮IIA、隱丹參酮等，顯然，以犧牲丹參眾多的有效成分而僅僅獲得丹酚酸A的做法不符合科學(xué)合理、充分利用資源的理念。此外，丹參這味藥材用途很多，很多中成藥如丹參注射液、復(fù)方丹參片、復(fù)方丹參滴丸等均需用丹參提取，需要消耗大量的丹參藥材。此外，在相關(guān)學(xué)科學(xué)者的研究中指出丹參的栽培并不很容易，丹參喜生長在氣候溫和、陽光充足、空氣濕潤的地方，生長最適溫度為20 ^°C，最適空氣相對濕度為80%。其根系發(fā)達(dá)，怕旱又忌澇。丹參種植時宜選擇土層深厚、疏松肥沃、地勢較高、排水良好的砂質(zhì)壤土地塊種植。平地要作排水溝；山地、嶺地宜選向陽的低山坡，坡度不宜太大，1(Γ30度較好，土壤PH值為6. 5 7. 5之間。而且丹參不宜連作，通過對廣4年不同連作年限地塊丹參生長發(fā)育情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，連作嚴(yán)重危害丹參生長，主要表現(xiàn)在6 9月份生長期枯苗率大幅度上升，地上、地下部生長量下降，根系數(shù)量、直徑和長度減小，產(chǎn)量降低，根系外觀畸形， 有效成分含量降低，這也在一定程度上影響了丹參的產(chǎn)量。因此，丹參的栽培狀況以及其眾多的用途注定會使丹參供不應(yīng)求，近年來丹參的價格飆升已經(jīng)證明了這一點。要使得丹酚酸A的制備水平達(dá)到產(chǎn)業(yè)化，必須尋找新的資源來解決丹酚酸A的來源問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種能夠獲取丹酚酸A新來源，以及從中獲得高純度丹酚酸A的制備方法；既解決丹酚酸A的來源問題，同時也提供一種收率高、成本低、制備工藝過程簡單，利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)高純度丹酚酸A的工藝方法。這種高純度丹酚酸A的制備方法，其特征在于它以紫草為原料，通過水加熱提取及酸調(diào)轉(zhuǎn)化、樹脂吸附、洗脫分離和純化濃縮工序獲得高純度丹酚酸A。具體制備方法，包括如下步驟(1)提取、(2)轉(zhuǎn)化，(3)分離，(4)純化；
(1)提取將藥材紫草根及根莖的切片在溫度為7(T10(TC的水中加熱至少提取二次， 合并過濾后獲得提取液；
(2)轉(zhuǎn)化將提取液適度濃縮，并以濃度為0.r2mol/L的無機酸調(diào)節(jié)pH值至1_6，在 100°C下回流反應(yīng)；或?qū)饪s液置于高壓釜中加熱反應(yīng)，獲得含有高濃度丹酚酸A的轉(zhuǎn)化液；
(3)分離將轉(zhuǎn)化液用填充了非極性、弱極性或中極性大孔吸附樹脂的吸附柱進(jìn)行吸附，待吸附平衡后，用水進(jìn)行洗脫除去雜質(zhì)，然后以水/醇溶劑系統(tǒng)洗脫分離，收集3 5個柱體積后即獲得含丹酚酸A的洗脫液；
(4)純化將此洗脫液經(jīng)濃縮后上聚酰胺、葡聚糖凝膠kphadexLH-20、MCI GEL CHP20P、C4、C8或C18鍵合相硅膠柱制備，以水/醇溶劑系統(tǒng)洗脫，或以液滴逆流色譜純化， 收集含有高純度丹酚酸A的流份，經(jīng)濃縮干燥后得到高純度丹酚酸A產(chǎn)品。所述步驟(2)中采用的無機酸為鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸中的任一種酸；回流狀態(tài)下反應(yīng)時間為214小時；在高壓釜中的加熱反應(yīng)條件為溫度10廣152°C，壓力 0. Γ0. 5Mpa,反應(yīng)時間為0. 5 12h。所述步驟(3)中采用的非極性、弱極性或中極性大孔吸附樹脂，為天津海光化工廠生產(chǎn)的AB-8，D101、DM301吸附樹脂中的一種，或山東魯抗樹脂廠生產(chǎn)的330、CAD45、DMl 30、 860021、DM-18、D312型吸附樹脂中的一種。所述步驟(3)、(4)中水/醇溶劑系統(tǒng)按水醇=95 :5 5 95配置。所述步驟(4)中的干燥方法包括冷凍干燥、噴霧干燥或真空干燥。根據(jù)以上方法提出的該種高純度丹酚酸A的制備方法，通過選用藥材紫草作為制備丹酚酸A的原材料，不僅拓展藥用原材料的來源，節(jié)省了原來的丹參用材，而且也可大大降低原材料的使用成本；同時這種紫草為原料的丹酚酸A的制備方法，工藝過程簡單，制備的丹酚酸A收率及純度高、成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明所采用的紫草中紫草酸的分子結(jié)構(gòu)式； 圖2為本發(fā)明所述的丹酚酸A的分子結(jié)構(gòu)式；
圖3為紫草酸分子轉(zhuǎn)化為丹酚酸A分子的轉(zhuǎn)化機理圖； 圖4為紫草經(jīng)水溶液提取獲得的液相色譜圖； 圖5為紫草提取液經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得的液相色譜圖。
具體實施例方式本發(fā)明提出的利用中藥材紫草提取高純度丹酚酸A的方法，解決了目前只能從丹參提取丹酚酸A存在的資源短缺和資源價高的困境，為大規(guī)模工業(yè)化獲得高純度丹酚酸A 提出了資源發(fā)展途徑。該技術(shù)方案利用紫草中含量豐富屬于咖啡酸聚合物的紫草總酚酸(主要是紫草酸)，在一定工藝條件下高效地轉(zhuǎn)化成丹酚酸Α。這種轉(zhuǎn)化是利用無機酸在一定工藝條件下實現(xiàn)的，其轉(zhuǎn)化的機理由以下分子結(jié)構(gòu)式表示
在上述表達(dá)式中，上部的左式為紫草酸分子結(jié)構(gòu)式，下部左式為丹酚酸A的分子結(jié)構(gòu)式，上部的右式為紫草酸分子結(jié)構(gòu)在無機酸處理過程中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化的示意圖。其變化的過程為紫草酸分子在酸性條件下加熱，其中的呋喃環(huán)遇酸不穩(wěn)定，環(huán)中的醚鍵易于水解開環(huán)，發(fā)生加成反應(yīng)，使呋喃環(huán)上的氧原子加成后分別生成一個脂羥基和一個酚羥基，繼而在酸性高溫條件下脂羥基與鄰位的氫發(fā)生消除反應(yīng)，脫去一分子水，同時原呋喃環(huán)上的羧基解離后脫去一分子二氧化碳，生成丹酚酸A分子。在發(fā)明人多年研究中，發(fā)現(xiàn)紫草ilithospermum erythrorhizon)中含有豐富的酚酸成分，其中以紫草酸的含量最高，可達(dá)4 7%，而且紫草總酚酸屬于咖啡酸聚合物，在一定條件下，可將紫草總酚酸(主要是紫草酸)高效地轉(zhuǎn)化成丹酚酸A。由于紫草對自然條件適應(yīng)能力較強，一般土壤均能生長，耐寒，怕澇，多生于山地草叢和干燥的石質(zhì)山坡、山谷及灌木林下，對土壤要求不甚嚴(yán)格，發(fā)芽最適溫度為13 17°C，發(fā)芽率可達(dá)80%以上，較易栽培。 從紫草中提取轉(zhuǎn)化丹酚酸A，收率可達(dá)m左右，較好地解決了丹酚酸A的來源問題。這種利用中藥材紫草獲得高純度丹酚酸A的方法，其具體步驟為(1)提取、(2)轉(zhuǎn)化，(3)分離，(4)純化四步。(1)提取將藥材紫草根及根莖的切片在溫度為7(T10(TC的水中加熱至少提取二次，合并過濾后獲得提取液；
(2)轉(zhuǎn)化將提取液適度濃縮，并以濃度為0.r2mol/L的無機酸調(diào)節(jié)pH值至1_6，在 100°C下回流反應(yīng)；或?qū)饪s液置于高壓釜中加熱反應(yīng)，獲得含有高濃度丹酚酸A的轉(zhuǎn)化液；
(3)分離將轉(zhuǎn)化液用填充了非極性、弱極性或中極性大孔吸附樹脂的吸附柱進(jìn)行吸附，待吸附平衡后，用水進(jìn)行洗脫除去雜質(zhì)，然后以水/醇溶劑系統(tǒng)洗脫分離，收集3 5個柱體積后即獲得含丹酚酸A的洗脫液；
5(4)純化將此洗脫液經(jīng)濃縮后上聚酰胺、葡聚糖凝膠kphadex LH-20、MCI GEL CHP20P、C4、C8或C18鍵合相硅膠柱制備，以水/醇溶劑系統(tǒng)洗脫，或以液滴逆流色譜純化， 收集含有高純度丹酚酸A的流份，經(jīng)濃縮干燥后得到高純度丹酚酸A產(chǎn)品。所述步驟(2)中所用的無機酸為鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸中的任一種酸；回流狀態(tài)下反應(yīng)時間為214小時；在高壓釜中的加熱反應(yīng)條件為溫度10廣152°C，壓力 0. Γ0. 5Mpa,反應(yīng)時間為0. 5 12h。所述步驟(3)的非極性、弱極性或中極性大孔吸附樹脂，為天津海光化工廠生產(chǎn)的AB-8，DlOU DM301吸附樹脂中的一種，或山東魯抗樹脂廠生產(chǎn)的330、CAD45、DM130、 860021、DM-18、D312型吸附樹脂中的一種。所述步驟(3)、(4)中的水/醇溶劑系統(tǒng)按水醇=95 :5 5 95配置。經(jīng)HPLC檢測(附圖4、5)，紫草提取后，按照該工藝進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中的紫草酸基本轉(zhuǎn)化成為丹酚酸A。由圖4可見，紫草經(jīng)水溶液提取獲得的液相色譜圖中，紫草酸(保留時間為8. 67分鐘的峰)為其中的主要成分；圖5為紫草提取液經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得的液相色譜圖。圖中可見，經(jīng)過轉(zhuǎn)化后，原8. 67分鐘紫草酸的峰基本消失，而在15. 69分鐘出現(xiàn)了丹酚酸A的主峰，表明紫草酸大部分轉(zhuǎn)化成丹酚酸A。獲得的高純度丹酚酸A產(chǎn)品采用高效液相色譜方法測定含量，結(jié)果顯示含量為90%以上，收率不低于1. 6%。
對從紫草中獲得的丹酚酸A進(jìn)行的以下藥效學(xué)實驗表明，丹酚酸A對心腦血管疾病具有較好的保護作用。實驗1、對小鼠常壓耐缺氧的保護作用實驗方法
取昆明種小鼠100只，雌雄各半，隨機分為5組，即對照組(給予等容積(含甘露醇 64. Omg/kg)的生理鹽水)、丹參組(丹參注射液10000mg/kg)、丹酚酸A低、中、高(5、10、 20mg/kg)。各組均通過尾靜脈給藥，給藥容積為20ml/kg。靜脈給藥IOmin后，將小鼠置于 125ml密閉廣口瓶中(內(nèi)置鈉石灰20g)。以小鼠張口呼吸停止為小鼠死亡標(biāo)志，記錄小鼠的存活時間，超過60min的以60min計。實驗結(jié)果見表1。表1丹酚酸A對小鼠常壓耐缺氧的保護作用(〒±SD)
權(quán)利要求
1.一種高純度丹酚酸A的制備方法，其特征在于它以紫草為原料，通過水加熱提取及酸調(diào)轉(zhuǎn)化、樹脂吸附、洗脫分離處理和純化濃縮工序獲得高純度丹酚酸A。
2.如權(quán)利要求1所述的一種高純度丹酚酸A的制備方法，具體制備方法，包括如下步驟(1)提取、(2)轉(zhuǎn)化，(3)分離，(4)純化；(1)提取將藥材紫草根及根莖的切片在溫度為7(T10(TC的水中加熱至少提取二次， 合并過濾后獲得提取液；(2)轉(zhuǎn)化將提取液適度濃縮，并以濃度為0.r2mol/L的無機酸調(diào)節(jié)pH值至1_6，在 100°C下回流反應(yīng)；或?qū)饪s液置于高壓釜中加熱反應(yīng)，獲得含有高濃度丹酚酸A的轉(zhuǎn)化液；(3)分離將轉(zhuǎn)化液用填充了非極性、弱極性或中極性大孔吸附樹脂的吸附柱進(jìn)行吸附，待吸附平衡后，用水進(jìn)行洗脫除去雜質(zhì)，然后以水/醇溶劑系統(tǒng)洗脫分離，收集3 5個柱體積后即獲得含丹酚酸A的洗脫液；(4)純化將此洗脫液經(jīng)濃縮后上聚酰胺、葡聚糖凝膠kphadexLH-20、MCI GEL CHP20P、C4、C8或C18鍵合相硅膠柱制備，以水/醇溶劑系統(tǒng)洗脫，或以液滴逆流色譜純化， 收集含有高純度丹酚酸A的流份，經(jīng)濃縮干燥后得到高純度丹酚酸A產(chǎn)品。
3.如權(quán)利要求2所述的一種高純度丹酚酸A的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中所用的無機酸為鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸中的任一種酸；回流狀態(tài)下反應(yīng)時間為214小時； 在高壓釜中的加熱反應(yīng)條件為溫度10廣152°C，壓力0. Γ0. 5Mpa,反應(yīng)時間為0. 5 12h。
4.如權(quán)利要求2所述的一種高純度丹酚酸A的制備方法，其特征在于所述步驟(3)的非極性、弱極性或中極性大孔吸附樹脂，為天津海光化工廠生產(chǎn)的AB-8，DlOU DM301吸附樹脂中的一種，或山東魯抗樹脂廠生產(chǎn)的330、CAD45、DM130、860021、DM-18、D312型吸附樹脂中的一種。
5.如權(quán)利要求2所述的一種高純度丹酚酸A的制備方法，其特征在于所述步驟(3)、 (4)中的水/醇溶劑系統(tǒng)按水醇=95 :5 5 95配置。
6.如權(quán)利要求1所述的一種高純度丹酚酸A的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中的干燥方法包括冷凍干燥、噴霧干燥或真空干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及的一種高純度丹酚酸A的制備方法，其特征在于它以紫草為原料，通過水加熱提取及酸調(diào)轉(zhuǎn)化、樹脂吸附洗脫分離和純化濃縮工序獲得高純度丹酚酸A。通過選用紫草作為制備丹酚酸A的原材料，不僅拓展藥用原材料的來源，節(jié)省了原來的丹參用材，而且也可大大降低原材料的使用成本；同時這種紫草為原料的丹酚酸A的制備方法，工藝過程簡單，制備的丹酚酸A收率及純度高、成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號A61P9/00GK102249920SQ20111014151
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者周長新, 朱志彬, 甘禮社 申請人:上海朗薩醫(yī)藥科技有限公司