專利名稱：靶向型pten基因復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種靶向型復(fù)合物，特別涉及一種靶向型 PTEN基因復(fù)合物，還涉及該復(fù)合物的制備方法及其在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)膠質(zhì)瘤是威脅人類健康的重要疾病，其治療方法的研究一直是醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究的重點。腫瘤的生物治療已被世界醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為是繼手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療之后的第四大治療方法，其中基因治療更是目前腫瘤生物治療中最活躍的研究領(lǐng)域之一。基因治療的原理是將目的基因用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入靶細(xì)胞，使靶細(xì)胞表達(dá)此基因而獲得特定的功能，繼而執(zhí)行或介導(dǎo)對腫瘤的殺傷和抑制作用，從而達(dá)到治療之目的。癌基因激活和抑癌基因失活是目前公認(rèn)的腫瘤發(fā)生的重要分子機(jī)制。已發(fā)現(xiàn)多種抑癌基因的缺失或突變與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。PTEN基因是1997年發(fā)現(xiàn)的一種與人類多種腫瘤的惡性增殖與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的抑癌基因。該基因定位于人類第10q23 染色體上，具有9個外顯子，含有由1212個核苷酸組成的開放閱讀框，編碼由403個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。有學(xué)者檢測了 41例原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中PTEN基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，59% 的標(biāo)本中存在10q23染色體上PTEN位點的雜合性缺失。也有學(xué)者比較了不同病理等級神經(jīng)膠質(zhì)瘤中PTEN基因的表達(dá)，證實低分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤中PTEN基因的突變率明顯高于高分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤，提示PTEN基因的突變有可能導(dǎo)致其抑瘤活性的降低。目前研究認(rèn)為，PTEN蛋白具有酪氨酸磷酸酶活性，可將磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP2，而PIP3是胰島素、 表皮生長因子等細(xì)胞生長因子的信號傳遞分子，可通過蛋白激酶B抑制細(xì)胞凋亡以及通過其它效應(yīng)分子刺激細(xì)胞增殖，PTEN蛋白可能是通過減少PIP3而最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在腫瘤基因治療中，為了提高殺傷腫瘤細(xì)胞的特異性，尋找腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異十分重要。其中，以外源性腫瘤特異性啟動子調(diào)控目的基因的表達(dá)是一種重要的技術(shù)手段。生存素(Survivin)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，具有抑制細(xì)胞凋亡和維持細(xì)胞有絲分裂的雙重功能。Survivin在正常的終末分化組織中幾乎不表達(dá)，但在幾乎所有惡性腫瘤組織中高表達(dá)，并與疾病的進(jìn)展、預(yù)后密切相關(guān)。既往研究已經(jīng)證實，在肺癌、 胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及黑色素瘤等腫瘤中，Survivin啟動子都具有較強(qiáng)的調(diào)控能力，表明Survivin啟動子是一個廣譜的腫瘤特異性啟動子。HIV-I的反式激活蛋白Tat能主動穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并且，Tat能將與之連接的多肽、蛋白質(zhì)及DNA等以濃度依賴的方式高效、快速地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，而細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能不受影響。由于Tat蛋白具有這種穿膜活性，使得目的分子能被簡單高效地引入細(xì)胞。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長作用最強(qiáng)、特異性最高的一種因子。大量研究表明，VEGF在促進(jìn)新生血管生成，特別是在促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長及轉(zhuǎn)移中起著重要作用。神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中VEGF的表達(dá)水平與腫瘤的血管化程度、惡性程度呈正相關(guān)；VEGF陽性表達(dá)與患者的生存時間具有顯著的相關(guān)性。文獻(xiàn)報道，噬菌體12肽VASAVFYSALVE (又稱為VEGF受體結(jié)合抑制肽)呈劑量依賴性競爭抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞生長，其可能模擬了 VEGF的空間結(jié)構(gòu)表位而與其受體位點結(jié)合，從而阻斷了 VEGF與其受體KDR的作用。但迄今為止，國內(nèi)外尚未見涉及PTEN基因、Survivin啟動子、穿膜肽Tat49_57及上述VEGF受體結(jié)合抑制肽的復(fù)合物的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種靶向型PTEN基因復(fù)合物，通過腫瘤特異性啟動子控制PTEN基因的表達(dá)，使PTEN基因能選擇性地表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，從而準(zhǔn)確殺傷腫瘤細(xì)胞，盡量減少正常組織的損傷。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
靶向型PTEN基因復(fù)合物，由穿膜肽Tat49-57和VEGF受體結(jié)合抑制肽的融合肽與PTEN 基因重組真核表達(dá)載體復(fù)合而成，所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述PTEN 基因重組真核表達(dá)載體由Survivin啟動子調(diào)控PTEN基因的表達(dá)。進(jìn)一步，所述PTEN基因重組真核表達(dá)載體為pcDNA3. I-SurvivinP-PTEN0本發(fā)明的目的之二在于提供一種所述靶向型PTEN基因復(fù)合物的制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
靶向型PTEN基因復(fù)合物的制備方法，將穿膜肽Tat49-57和VEGF受體結(jié)合抑制肽的融合肽溶液滴入處于混旋狀態(tài)的PTEN基因重組真核表達(dá)載體的PBS溶液中，融合肽與PTEN 基因重組真核表達(dá)載體的質(zhì)量比為2 1，滴加完畢后，繼續(xù)混旋15 45分鐘，再靜置15 45分鐘，即制得靶向型PTEN基因復(fù)合物。進(jìn)一步，所述PTEN基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法為
a.以人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的基因組DNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQID No. 2和SEQ ID No. 3所示的上下游引物PCR擴(kuò)增Survivin啟動子片段，再將其與pGEM-T 載體連接，獲得重組質(zhì)粒pGEM-T/SurvivinP ；
b.將人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA，再以總cDNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示的上下游引物PCR擴(kuò)增PTEN基因，再將其與pMD18-T載體連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T/PTEN ；自重組質(zhì)粒pMD18_T/PTEN中用 Hind III和BamH I雙酶切出PTEN基因，與同樣經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切的真核表達(dá)載體 pcDNA3. 1 (+)在T4 DNA連接酶的作用下連接，獲得重組質(zhì)粒pcDNA3. I-PTEN ；
c.自步驟a所得重組質(zhì)粒pGEM-T/SurvivinP中用XhoI和Nco I雙酶切出Survivin 啟動子片段，與同樣經(jīng)Xho I和Nco I雙酶切的步驟b所得重組質(zhì)粒pcDNA3. I-PTEN在T4 DNA連接酶的作用下連接，即獲得PTEN基因重組表達(dá)載體pcDNA3. I-SurvivinP-PTEN0本發(fā)明的目的之三在于提供所述靶向型PTEN基因復(fù)合物在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
靶向型PTEN基因復(fù)合物在制備抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的靶向型PTEN基因復(fù)合物通過穿膜肽的穿膜特性，可以有效地攜帶PTEN基因重組真核表達(dá)載體進(jìn)入細(xì)胞；通過VEGF受體結(jié)合抑制肽的功能活性，可以有效抑制VEGF誘導(dǎo)的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，同時，由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面高表達(dá)受體KDR，因此，通過VEGF受體結(jié)合抑制肽與受體KDR的結(jié)合，可以使PTEN基因重組真核表達(dá)載體更多地靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞；通過Survivin啟動子控制PTEN基因的表達(dá)， 可以使PTEN基因選擇性地表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，從而準(zhǔn)確殺傷腫瘤細(xì)胞，盡量減少正常組織的損傷。體內(nèi)外研究結(jié)果顯示，本發(fā)明的靶向型PTEN基因復(fù)合物能夠有效地靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，特異地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞克隆，有效地抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長，延長荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率。因此，本發(fā)明的靶向型PTEN基因復(fù)合物可用于制備抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的基因治療領(lǐng)域有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。


圖1為Survivin啟動子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為PTEN基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為靶向型PTEN基因復(fù)合物的透射電鏡分析。圖4為感染靶向型PTEN基因復(fù)合物的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞的凋亡率比較。圖5為感染靶向型PTEN基因復(fù)合物的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞的克隆形成率比較。圖6為給予靶向型PTEN基因復(fù)合物的荷瘤裸鼠的腫瘤生長曲線。圖7為給予靶向型PTEN基因復(fù)合物的荷瘤裸鼠的平均生存率。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件， 例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1、靶向型PTEN基因復(fù)合物的制備
一、穿膜肽與VEGF受體結(jié)合抑制肽的融合肽的合成
穿膜肽Tat49-57與VEGF受體結(jié)合抑制肽的融合肽由Tat49_57 (RKKRRQRRR)的羧基端與VEGF受體結(jié)合抑制肽(VASAVFYSALVE)的氨基端直接連接而成，氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。融合肽的合成在AB-431A型多肽合成儀上進(jìn)行。采用標(biāo)準(zhǔn)9_芴甲氧羰基(Fmoc) 方案，以0. 125mmol的對羥甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)樹脂為起始樹脂，按照融合肽的氨基酸序列使肽鏈從C-端逐個向N-端延伸；各種保護(hù)氨基酸的用量為0. 5mmol，偶聯(lián)前用 1-羥基苯并三唑(HOBt)和N，N' - 二環(huán)己基碳二亞胺(Dcc)活化保護(hù)氨基酸的羧基，偶聯(lián)后用體積分?jǐn)?shù)為20%的六氫吡啶的N，N- 二甲基甲酰胺溶液去除氨基酸的Fmoc保護(hù)基。肽鏈合成完畢后，將含有肽鏈的樹脂轉(zhuǎn)移至冰浴條件下的切割液A/C混合液中(切割液A由結(jié)晶苯酚0. 75g、EDT 0. 25mL、苯甲硫醚0. 5mL、三氟乙酸IOml和去離子水0. 5mL組成；切割液 C由EDT 0. 5mL、三氟乙酸IOml和去離子水0. 5mL組成)，待平衡至室溫后，攪拌反應(yīng)2小時使肽鏈從樹脂上裂解下來同時去除各種側(cè)鏈保護(hù)基；反應(yīng)液用G4玻砂漏斗過濾去除樹脂， 收集濾液，室溫下低壓蒸餾至體積廣2ml，加入冰冷乙醚50ml沉淀多肽，4°C放置過夜，用G6玻砂漏斗過濾，得粗肽產(chǎn)物，-20°C保存?zhèn)溆?；將粗肽產(chǎn)物用二甲基亞砜(DMSO)溶解制成濃度為20mg/ml的溶液，用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾后，在AKTA explorer 100型中壓液相色譜儀上用SOURCE凝膠柱進(jìn)行純化，流動相A為體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇+質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0. 1%的三氟乙酸，流動相B為體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇+質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0. 1%的三氟乙酸，二元線性梯度洗脫，先用100%的流動相A平衡1. 5個柱體積，然后將流動相B在8個柱體積內(nèi)由體積分?jǐn)?shù)為0線性上升至80%，最后將流動相B在0. 5個柱體積內(nèi)由體積分?jǐn)?shù)為 80%線性上升至100%，在主峰處收集多肽洗脫液，用Delta 600型高壓液相色譜儀鑒定多肽純度，用API2000 LC/MS型電噴霧粒子化質(zhì)譜儀測定多肽分子量，最后冷凍干燥，得融合肽純品，用DMSO溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩６?、Survivin啟動子調(diào)控的PTEN基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建 1、Survivin啟動子的克隆
采用基因組DNA提取試劑盒提取人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的基因組DNA， 按照試劑盒說明書操作。以所得細(xì)胞基因組DNA為模板，采用上游引物Fl 5‘-gcctcgagctggccatagaacca- gagaagtga-3，(SEQ ID No. 2,下劃線部分為 Xho I 酶切位點)禾口下妨學(xué)弓丨物 Rl :5，-gcccatgg- ccacctctgccaacgggtcccgcg-3，(SEQ ID No. 3，下戈丨」線部分為Nco I酶切位點)PCR擴(kuò)增Survivin啟動子片段(GenBank登錄號為U75285)。PCR 循環(huán)條件參數(shù)為94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性1分鐘、58°C退火1分鐘、72°C延伸1. 5 分鐘，共30個循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖1)、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與PGEM-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞， 用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為 pGEM-T/SurvivinP。2、PTEN基因的克隆
采用Trizol試劑提取人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞總RNA，按照試劑說明書操作。將所得細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA，再以總cDNA為模板，采用上游引物F2 5' -gggaagcttatgacagcca tcatcaaaga-3，(SEQ ID No. 4，下劃線部分為 Hind III酶切位點)和下游引物 R2 5 -atRRRatcctcaRacttttRtaatttRtR-3 (SEQ ID No. 5，下劃線部分為 BamH I酶切位點)PCR擴(kuò)增PTEN基因(GenBank登錄號為NM_000314)。PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性30秒、65°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖2)、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與PMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為pMDIS-T/PTEN。自陽性克隆質(zhì)粒pMD18-T/PTEN中用HindΠI和BamH I雙酶切出PTEN基因，與同樣經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)在T4 DNA連接酶的作用下連接， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，Hind III和BamH I雙酶切鑒定及測序鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為pcDNA3. I-PTEN03、Survivin啟動子調(diào)控的PTEN基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建
自陽性克隆質(zhì)粒pGEM-T/SurvivinP中用Xho I和Nco I雙酶切出Survivin啟動子片段，與同樣經(jīng)Xho I和Nco I雙酶切的陽性克隆質(zhì)粒pcDNA3. I-PTEN在T4 DNA連接酶的作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，Xho I和Nco I雙酶切鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為 pcDNA3. I-SurvivinP-PTEN,即得Survivin啟動子調(diào)控的PTEN基因重組真核表達(dá)載體。三、靶向型PTEN基因復(fù)合物的制備
將濃度為ΙΟΟΟμ g/ml的融合肽溶液100 μ 1以5 μ 1/min的速度滴入處于混旋狀態(tài)的濃度為500 μ g/ml的重組表達(dá)載體pcDNA3. I-SurvivinP-PTEN的PBS溶液100 μ 1中，滴加完畢后，繼續(xù)混旋30分鐘，再靜置30分鐘，即制得靶向型PTEN基因復(fù)合物。將新鮮制備的上述復(fù)合物滴于200目銅網(wǎng)上，吸附3分鐘，吸水紙吸干，晾干30秒，以質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1% 的水溶性醋酸鈾負(fù)染30秒，吸水紙吸干，晾干30秒，用SOkV透射電鏡觀察，結(jié)果顯示，所得靶向型PTEN基因復(fù)合物呈大小均一的近圓形顆粒，絕大多數(shù)顆粒的長徑小于50nm (圖3)。實施例2、靶向型PTEN基因復(fù)合物的抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤作用檢測一、體外抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤作用
1、細(xì)胞凋亡率檢測
分別將人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞和美洲綠猴腎C0S-7細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24小時后，以500 μ 1靶向型PTEN基因復(fù)合物感染細(xì)胞，同時設(shè)置相應(yīng)對照組(用PBS替代靶向型PTEN基因復(fù)合物)，感染3天后收集細(xì)胞，用PBS洗滌并調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X IO5個/ml， 加入濃度為250 μ g/ml的異硫氰酸熒光素標(biāo)記磷脂結(jié)合蛋白V (Annexin V) 5μ 1和濃度為250 μ g/ml的碘化丙啶(PI) 5 μ 1，冰浴避光孵育10分鐘，用PBS洗滌細(xì)胞，再用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況=Armexin V和PI均低染的細(xì)胞為正常活細(xì)胞； Annexin V高染而PI低染的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，Annexin V和PI均高染的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。 結(jié)果見圖4，感染靶向型PTEN基因復(fù)合物或PBS的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的凋亡率分別為 (34士5)%和(8士2)%，而感染靶向型PTEN基因復(fù)合物或PBS的正常組織細(xì)胞C0S-7的凋亡率分別為(7士 1)%和(6士 1)%，表明本發(fā)明的靶向型PTEN基因復(fù)合物能夠有效并且特異地誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。2、細(xì)胞克隆形成率檢測
分別將人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞和美洲綠猴腎C0S-7細(xì)胞各200個接種于6孔板，培養(yǎng) 24小時后，以500 μ 1靶向型PTEN基因復(fù)合物感染細(xì)胞，同時設(shè)置相應(yīng)對照組(用PBS替代靶向型PTEN基因復(fù)合物)，感染2周至細(xì)胞集落形成后，行吉姆薩染色，鏡下計數(shù)大于50個細(xì)胞的集落，計算細(xì)胞克隆形成率細(xì)胞克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)X 100%。結(jié)果見圖5，感染靶向型PTEN基因復(fù)合物或PBS的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的克隆形成率分別為 (8士 1. 2)%和(76士 10)%，而感染靶向型PTEN基因復(fù)合物或PBS的正常組織細(xì)胞C0S-7的克隆形成率分別為(73士 12)%和(72士 11)%，表明本發(fā)明的靶向型PTEN基因復(fù)合物能夠有效并且特異地抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆。二、體內(nèi)抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤作用
將IX IO5個人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞接種于裸鼠皮下建立荷瘤裸鼠，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為兩組對照組和實驗組，對照組尾靜脈注射PBS，實驗組尾靜脈注射500μ 1靶向型PTEN 基因復(fù)合物，觀察60天內(nèi)兩組小鼠的生存率和腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。兩組小鼠的腫瘤生長曲線見圖6，第30天時對照組小鼠腫瘤體積達(dá)到2600mm3，而實驗組小鼠腫瘤生長緩慢，腫瘤體積僅為700mm3。兩組小鼠的平均生存率見圖7，對照組小鼠于35天內(nèi)全部死亡，而實驗組小鼠60天的生存率為50%。表明本發(fā)明的靶向型PTEN基因復(fù)合物能夠有效抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長，同時能夠延長荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率。
最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.靶向型PTEN基因復(fù)合物，其特征在于由穿膜肽Tat49-57和VEGF受體結(jié)合抑制肽的融合肽與PTEN基因重組真核表達(dá)載體復(fù)合而成，所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述PTEN基因重組真核表達(dá)載體由Survivin啟動子調(diào)控PTEN基因的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向型PTEN基因復(fù)合物，其特征在于所述PTEN基因重組真核表達(dá)載體為 pcDNA3. I-SurvivinP-PTEN0
3.權(quán)利要求1所述靶向型PTEN基因復(fù)合物的制備方法，其特征在于將穿膜肽 Tat49-57和VEGF受體結(jié)合抑制肽的融合肽溶液滴入處于混旋狀態(tài)的PTEN基因重組真核表達(dá)載體的PBS溶液中，融合肽與PTEN基因重組真核表達(dá)載體的質(zhì)量比為2:1，滴加完畢后， 繼續(xù)混旋15 45分鐘，再靜置15 45分鐘，即制得靶向型PTEN基因復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向型PTEN基因復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述PTEN 基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法為a.以人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的基因組DNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQID No. 2和SEQ ID No. 3所示的上、下游引物PCR擴(kuò)增Survivin啟動子片段，再將其與pGEM_T 載體連接，獲得重組質(zhì)粒pGEM-T/SurvivinP ；b.將人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA，再以總cDNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示的上、下游引物PCR擴(kuò)增PTEN基因，再將其與pMD18-T載體連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T/PTEN ；自重組質(zhì)粒pMD18_T/PTEN中用 Hind III和BamH I雙酶切出PTEN基因，與同樣經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切的真核表達(dá)載體 pcDNA3. 1 (+)在T4 DNA連接酶的作用下連接，獲得重組質(zhì)粒pcDNA3. I-PTEN ；c.自步驟a所得重組質(zhì)粒pGEM-T/SurvivinP中用XhoI和Nco I雙酶切出Survivin 啟動子片段，與同樣經(jīng)Xho I和Nco I雙酶切的步驟b所得重組質(zhì)粒pcDNA3. I-PTEN在T4 DNA連接酶的作用下連接，即獲得PTEN基因重組表達(dá)載體pcDNA3. I-SurvivinP-PTEN0
5.權(quán)利要求1所述的靶向型PTEN基因復(fù)合物在制備抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種靶向型PTEN基因復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，該復(fù)合物由穿膜肽Tat49-57和VEGF受體結(jié)合抑制肽的融合肽與PTEN基因重組真核表達(dá)載體復(fù)合而成，融合肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，PTEN基因重組真核表達(dá)載體由Survivin啟動子調(diào)控PTEN基因的表達(dá)；其制備方法是按質(zhì)量比為2:1將融合肽溶液滴入處于混旋狀態(tài)的PTEN基因重組真核表達(dá)載體的PBS溶液中，混旋，靜置，即得；本發(fā)明復(fù)合物能夠有效地靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，特異地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞克隆，有效地抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長，延長荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率，可用于制備抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物。
文檔編號A61K38/10GK102241777SQ20111014589
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月1日
發(fā)明者楊衛(wèi)忠, 王如密, 王守森, 石松生, 袁邦青, 趙琳, 鄭兆聰, 陳宏頡, 高進(jìn)喜 申請人:中國人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院