專利名稱：溫敏性核殼型囊泡控釋藥物載體、其制備方法及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及核殼結(jié)構(gòu)型控釋藥物載體，更具體涉及囊泡表面高分子修飾的制備方法及作為藥物載體的應用。
背景技術(shù)：
表面活性劑具有兩親性的分子結(jié)構(gòu)，常用于增強界面活性、降低界面張力，或自組裝形成各種形狀的膠束、液晶，在決定界面的流變學特性以及兩相物質(zhì)傳遞方面起著十分重要的作用，在美容化妝品、醫(yī)藥品以及各種乳化分散技術(shù)中有重要的應用價值。天然生物表面活性劑是一類具有表面活性的天然化合物，它除了具有與一般化學表面活性劑相同的作用外，還以其安全、無毒、良好的生物可降解性和相容性，良好的熱及化學穩(wěn)定性等優(yōu)點，在生物醫(yī)藥、環(huán)保及石油工業(yè)等領(lǐng)域倍受重視。生物表面活性劑的親水基團可以是離子或非離子形式的單糖、二糖、多糖、羧基、氨基或肽鏈；疏水基團則由飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸或帶羥基的脂肪酸組成。其種類很多，依據(jù)它們的化學組成和微生物來源可分為磷脂、糖脂、脂肽和脂蛋白等。其中，磷脂、糖脂是生命組織細胞膜骨架的重要組成，也是近年來的研究熱點之一。兩親性的磷脂分散于水相時，分子的疏水尾部傾向于聚集在一起，避開水相，而親水頭部暴露在水相，形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡，稱為脂質(zhì)體。自從1965年英國科學家Bangham發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體以來，由于其結(jié)構(gòu)類似生物膜，作為藥物載體使用時，囊泡中心的親水區(qū)可包封水溶性藥物而囊泡的疏水基團的夾層中可包封脂溶性藥物，并且可以提高藥物穩(wěn)定性及靶向性，降低藥物毒性，延緩釋放，因此得到廣泛而深入的研究。但是，脂質(zhì)體囊泡仍然存在著文獻D. R. Khan，E. Μ. Rezler, J. L. -Fields and G. B. Fields :Chem. Biol. Drug Des. 71(2008),3 禾口 S. Sriwongsitanont and M. Ueno =Colloid Polym. Sci. 282(2004), 753報道的易聚集、沉降，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差等問題，以及文獻S. K. E. Messerschmidt, A.Musyanovych, M.Altvater, P.Scheurich, K.Pfizenmaier, K. Landfester and R. Ε.Kontermann :J.Controlled Release 137 (2009),69、文獻 S.Sriwongsitanont and Μ. Ueno :Chem. Pharm. Bull. 50(9) (2002)，1238禾口S. Sriwongsitanont and Μ. Ueno =Colloid Polym. Sci. 282(2004),753報道的易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，體內(nèi)循環(huán)周期短等的缺陷，因此，需要進一步對脂質(zhì)體囊泡結(jié)構(gòu)進行修飾和加工。目前，雖然有人通過對脂質(zhì)體囊泡的修飾來增加其體內(nèi)循環(huán)時間和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，但是沒有制備成核殼結(jié)構(gòu)的，且效果都不夠理
術(shù)g
；ο本發(fā)明者以脂質(zhì)體囊泡為核心，依靠化學鍵、靜電力等作用使生物大分子和溫敏高分子在囊泡外表形成“復合凝膠外殼”，以增加囊泡的穩(wěn)定性并達到多重釋放藥物的效果，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種溫敏型核殼結(jié)構(gòu)控釋藥物載體。
本發(fā)明提供的溫敏型核殼結(jié)構(gòu)控釋藥物載體由內(nèi)核囊泡和外層高分子復合凝膠構(gòu)成。本發(fā)明的藥物載體中內(nèi)核采用的囊泡為生物表面活性劑構(gòu)成的脂質(zhì)體囊泡，外層為天然生物大分子構(gòu)成的溫敏性高分子凝膠。構(gòu)成內(nèi)核脂質(zhì)體囊泡的生物表面活性劑可選自磷脂和糖脂，優(yōu)選磷脂。本發(fā)明的藥物載體外層中的天然生物大分子為酸性多糖生物可降解材料，例如， 透明質(zhì)酸(HA)、軟骨素、殼聚糖等，優(yōu)選HA ；溫敏高分子可采用生物相容性和溫度敏感性聚合物，較佳為聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)。本發(fā)明藥物載體中的內(nèi)核脂質(zhì)體囊泡和多糖生物可降解材料間通過化學鍵進行鏈接。在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明選擇透明質(zhì)酸(HA)生物可降解材料，將透明質(zhì)酸 (HA)與甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)連接成HA-GMA，該鏈上的GMA分子內(nèi)含有碳碳雙鍵， 可進行自由基反應，具有很高的反應靈活性，可與內(nèi)核脂質(zhì)體囊泡發(fā)生自由基反應，而形成外層高分子復合凝膠。在一個優(yōu)選實施方式中，外層高分子復合凝膠中的溫敏高分子是聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，由N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)在交聯(lián)劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA) 存在下交聯(lián)反應而形成，并且與酸性多糖分子鏈發(fā)生交聯(lián)反應，所形成的網(wǎng)絡(luò)狀復合凝膠結(jié)構(gòu)能夠固定并包裹在脂質(zhì)體的外側(cè)。本發(fā)明提供的藥物載體的制備方法包括以下步驟1)將生物表面活性劑溶于有機溶劑中，真空下旋轉(zhuǎn)容器蒸發(fā)溶劑至干，脂質(zhì)膜均勻沉積在瓶壁上，真空干燥，于30-60°C水浴超聲預熱10-30min后加入磷酸緩沖溶液水化脂質(zhì)膜；2)將酸性多糖溶于超純水中，加入等體積三乙胺和四丁基溴化銨，反應10_20h后進行冷凍干燥，加水，透析5-10天，然后與1)獲得的脂質(zhì)體溶液超聲混合10-60min ；3)在2、所得分散液中加入交聯(lián)劑1重量份和溫敏高分子單體15重量份，于氮氣保護下滴加催化劑溶液，50-80°C反應2-5小時。本發(fā)明方法中所用的有機溶劑可選自無水氯仿，二氯甲烷和乙醇。所述溫敏高分子單體優(yōu)選NIPAM，所述交聯(lián)劑優(yōu)選MBA。本發(fā)明方法中，步驟1)可將第一種藥物與生物表面活性劑同時溶于有機溶劑中， 得到包裹第一種藥物的脂質(zhì)體。本發(fā)明方法還可包括步驟4)將步驟幻的產(chǎn)物凍干，浸入溶解了第二種藥物的水溶液中，20-40°C保持10-20min后，靜置半天，得到包封第二種藥物的載體。根據(jù)需要，本發(fā)明的藥物載體可僅在脂質(zhì)體囊泡中包裹第一種藥物，未包封的藥物通過葡聚糖微型凝膠柱分離除去；本發(fā)明的藥物載體也可僅在外層溫敏高分子復合凝膠包封第二種藥物，這第二種藥物通過溫敏凝膠外層的相變化被吸附滲入到凝膠層內(nèi)部，靜置后達到飽和吸附，未包封的藥物通過葡聚糖微型凝膠柱分離；更優(yōu)選的是，在脂質(zhì)體囊泡中包裹第一種藥物，在外層溫敏高分子復合凝膠中包封第二種藥物，使第二種藥物先釋放， 然后再釋放第一種藥物。在一個優(yōu)選方案中，本發(fā)明的藥物載體制備方法包括以下步驟
1)薄膜超聲水化法制備納米脂質(zhì)體將生物表面活性劑或生物表面活性劑及憎水性藥物溶于有機溶劑；30-60°C的恒溫水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，脂質(zhì)沉積瓶壁后繼續(xù)抽干。解除真空后，從干燥箱中取出瓶，在瓶中注滿氮氣，放入30-60度的水浴超聲中預熱10-30min，在瓶中加入緩沖溶液水化脂質(zhì)，最后，通過葡聚糖微型凝膠柱分離未包封的藥物。2)合成HA-GMA復合物取HA(透明質(zhì)酸)溶于水中，樣品的濃度是Ι-^ig/mL，加入等量的三乙胺，GMA(甲基丙烯酸縮水甘油酯)，四丁基溴化銨，反應10_20h后，在40-60°C下孵化2-5h。反應后的樣品冷凍干燥1-5天，分散至水中，放入透析袋透析5-10天。3)酸性多糖的包覆取2)透析后的樣品HA-GMA加入水中稀釋，在HA-GMA中逐滴加入囊泡溶液，并且超聲30-60min，此時溶液稱為GHA-Iip。4)殼層合成HA-PNIPAM凝膠GHA-Iip中加入MBA (N，N-亞甲基雙丙烯酰胺)，NIPAM (N-異丙基丙烯酰胺)配成溶液，另再將APS (過硫酸銨)溶于水后加入常壓漏斗里，抽真空通氮氣保護，緩慢滴加到溶液里，滴加完畢，50-80°C下反應2-5小時。5)核殼微粒的外層載藥親水性藥物代表熒光素二鈉將4)所得微粒凍干處理，稱量熒光素二鈉放入到溶解了脂質(zhì)體的磷酸緩沖溶液(PH7.4)中。樣品升溫O0-40°C )保持10-20min后冷卻到室溫(25°C )，熒光素二鈉通過溫敏凝膠外層的相變化被吸附滲入到凝膠層內(nèi)部，靜置半天以使凝膠達到飽和吸附，最后通過葡聚糖微型凝膠柱分離未包封的藥物。本發(fā)明以脂質(zhì)體囊泡為核心，依靠化學鍵、靜電力等的作用，使生物大分子在囊泡外表吸附形成“凝膠外殼”，從而提供一種溫敏型核殼結(jié)構(gòu)脂質(zhì)體控釋藥物載體。該核殼構(gòu)型不但可以增加囊泡的穩(wěn)定性，達到高包封率，同時具有溫敏凝膠的快速響應性。本發(fā)明選用具有良好的生物相容性的酸性多糖和具有溫敏性的N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)，制備溫敏性混合凝膠，這樣使得凝膠的殼層不僅保持酸性多糖的良好生物相容性的優(yōu)異性，還具有聚N-異丙基丙烯酰胺PNIPAM的快速溫度響應，并且凝膠外殼的機械強度也得到了很大的提高。本發(fā)明首次在脂質(zhì)體外側(cè)修飾溫敏性凝膠層，制備了具有溫敏特性的核殼微凝膠，該微粒內(nèi)核的雙層脂質(zhì)體囊泡和外層的溫敏性生物高分子凝膠都可以作為藥物載體載藥，隨著溫度的上升，外層的凝膠會發(fā)生相變化而皺縮，外層凝膠包裹藥物通過調(diào)溫可以快速釋放出來，而內(nèi)層脂質(zhì)體的包容物因為外層凝膠的存在則可以進行緩慢釋放，從而達到多維釋放的效果。本發(fā)明的溫敏型核殼結(jié)構(gòu)脂質(zhì)體控釋藥物載體具有良好的生物相容性和快速溫度響應性，在室溫為可注射型制劑，發(fā)生相變化后沉淀附著于固體表面，可達到定向釋放的目的。本發(fā)明的產(chǎn)品可以用于化妝品領(lǐng)域，也可作為埋植藥物的載體，應用于開放型手術(shù)植入，微創(chuàng)手術(shù)注射或借助內(nèi)窺鏡植入。


圖1是殼層凝膠化的脂質(zhì)體顆粒用原子力顯微鏡觀察到的形貌圖，掃描范圍是 5X5 μ m。圖2是殼層凝膠化的脂質(zhì)體顆粒用透過顯微鏡觀察到的結(jié)構(gòu)。圖3、圖4分別是不同分子量HA制成核殼結(jié)構(gòu)顆粒后粒徑和透過度隨溫度的變化。 HA 分子量■ :3604g mo Γ1 ；· :1. IXlO4g mo Γ1 ;▲ :3. OXlO5g mo Γ1 ；▼ 8. 0 X lO'gmor1圖5和圖6分別是外層及內(nèi)層藥物釋放效應比較。圖中曲線為37°C下釋放情況， 藥物濃度在熒光分光光度計上進行檢測。
具體實施例方式以下用實施例對本發(fā)明作更詳細的描述。這些實施例僅僅是對本發(fā)明最佳實施方式的描述，并不對本發(fā)明的范圍有任何限制。實施例11.取透明質(zhì)酸溶于超純水中，濃度為2mg/mL，加入重量比為1 1 1的三乙胺， 四丁基溴化銨和GMA (甲基丙烯酸縮水甘油酯)，室溫反應IOh后，在40°C下孵化池，然后冷凍干燥2天，透析5天。2.將磷脂溶液中加入Img羅丹明6G，溶液移入圓底燒瓶中，蒸發(fā)溶劑，室溫下真空干燥2-4h，制備含有羅丹明6G的磷脂膜。解除真空后，放入50度的水浴中預熱20min ；加緩沖液水化后制備出包裹羅丹明6G的脂質(zhì)體，使其通過葡聚糖微型凝膠柱分離未包封的部分，可獲得包裹了羅丹明6G的脂質(zhì)體。3.將步驟1所得的反應液加入超純水稀釋，逐滴加入步驟2所得脂質(zhì)體的溶液，超聲 30min。4.將步驟3所得的反應液加入1重量份MBA(N，N-亞甲基雙丙烯酰胺)，10份 NIPAM(N-異丙基丙烯酰胺)，再將1重量份APS (過硫酸銨)，溶于水里面放入常壓漏斗里， 抽真空通氮氣保護，緩慢滴加IOmL的APS到溶液里，滴加完畢，50°C下反應5小時。5.將步驟4所得溫敏性顆粒凍干處理，取熒光素二鈉(固體)放入到溶解了固體溫敏脂質(zhì)體的磷酸緩沖溶液中，熒光素二鈉的最終濃度是0. 027mg/ml。熒光素二鈉通過溫敏凝膠外層的相變化被吸附滲入到凝膠層內(nèi)部，使凝膠達到飽和吸附，使其通過葡聚糖微型凝膠柱分離未包封的部分。6.顆粒中模擬藥物的釋放外層取洗脫液0. 5mL放入透析帶中，再將透析帶放入裝有30mL pH7. 4的磷酸緩沖液中，恒溫37°C，每隔20min外圍重新?lián)Q上已預熱的空白緩沖液，并測試緩沖液的熒光強度值。內(nèi)層繼續(xù)透析，每隔2- 外圍重新?lián)Q上已預熱的空白緩沖液，并測試緩沖液的熒光強度值。實施例21.取軟骨素溶于超純水中，濃度為％ig/mL，加入0. 6mL三乙胺，0. 6g四丁基溴化銨和0. 6mLGMA,室溫反應20小時后，在60°C下孵化2h，然后冷凍干燥5天，透析8天。2.將磷脂溶液中加入0. 5mg羅丹明6G，冷凍干燥制備含有羅丹明6G的脂膜。加緩沖液水化后制備出包裹羅丹明6G的脂質(zhì)體，使其通過葡聚糖微型凝膠柱分離未包封的部分，獲得包裹了羅丹明6G的脂質(zhì)體。3.將步驟1所得的反應液加入超純水稀釋，逐滴加入步驟2所得脂質(zhì)體的溶液，超聲 30min。4.將步驟3所得的反應液加入1份MBA (N，N-亞甲基雙丙烯酰胺)，10份 NIPAM(N-異丙基丙烯酰胺)，再將1重量份APS (過硫酸銨)溶于水里面放入常壓漏斗里， 抽真空通氮氣保護，緩慢滴加APS到溶液里，滴加完畢，70°C下反應3小時。5.將步驟4所得溫敏性顆粒凍干處理，稱量適量的熒光素二鈉(固體)放入到溶解了固體溫敏脂質(zhì)體的磷酸緩沖溶液中。熒光素二鈉通過溫敏凝膠外層的相變化被吸附滲入到凝膠層內(nèi)部，使凝膠達到飽和吸附。使其通過葡聚糖微型凝膠柱分離未包封的部分。研究結(jié)果顯示溫敏性核殼結(jié)構(gòu)微粒用動態(tài)光散射DLS和紫外光度計UV考察其溫敏性，最低臨界溶解溫度都接近34°C，外層的凝膠層包裹一種親水性的模擬藥物熒光素二鈉，包封率72. 96%，累積釋放時間lh，累積釋放率81. 16% ；內(nèi)核脂質(zhì)體包裹一種疏水性的模擬藥物羅丹明6G，由于外層凝膠的交聯(lián)覆蓋作用，內(nèi)部包裹的模擬藥物會達到緩慢釋放的效果，其包封率52. 64%,累積釋放時間40h，累積釋放率82. 28%.兩種不同釋藥方式，不同藥物的釋放時間差從而達到二維釋放。
權(quán)利要求
1.一種溫敏型核殼結(jié)構(gòu)脂質(zhì)體控釋藥物載體，由內(nèi)核脂質(zhì)體和外層溫敏高分子復合凝膠構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求1所述的控釋藥物載體，其中所述內(nèi)核為生物表面活性劑構(gòu)成的脂質(zhì)體囊泡，所述外層溫敏高分子復合凝膠由天然生物大分子和溫敏高分子構(gòu)成。
3.如權(quán)利要求2所述的控釋藥物載體，其中所述生物表面活性劑選自磷脂。
4.如權(quán)利要求2所述的控釋藥物載體，其中所述天然生物大分子選自酸性多糖透明質(zhì)酸、軟骨素、殼聚糖。
5.如權(quán)利要求2所述的控釋藥物載體，其中所述溫敏高分子為PNIPAM，由NIPAM在交聯(lián)劑MBA存在下進行交聯(lián)反應而形成。
6.權(quán)利要求1所述控釋藥物載體的制備方法，包括以下步驟1)將生物表面活性劑溶于有機溶劑中，真空下旋轉(zhuǎn)容器蒸發(fā)溶劑至干，脂質(zhì)膜均勻沉積在瓶壁上，真空干燥，于30-60°C水浴超聲預熱10-30min后加入磷酸緩沖溶液水化脂質(zhì)膜；2)將酸性多糖溶于超純水中，加入等體積三乙胺和四丁基溴化銨，反應10-20h后進行冷凍干燥，加水，透析5-10天，然后與1)獲得的脂質(zhì)體溶液超聲混合10-60min ；3)在2、所得分散液中加入交聯(lián)劑1重量份和溫敏高分子單體15重量份，于氮氣保護下滴加催化劑溶液，50-80°C反應2-5小時。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其中所述的有機溶劑選自無水氯仿，二氯甲烷和乙
8.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其中所述溫敏高分子單體為OTPAM，所述交聯(lián)劑為MBA。
9.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其中所述步驟1)將第一種藥物與生物表面活性劑同時溶于有機溶劑中，得到包裹第一種藥物的脂質(zhì)體。
10.如權(quán)利要求6或9所述的制備方法，其中還包括步驟4)將步驟幻的產(chǎn)物凍干，浸入溶解了第二種藥物的水溶液中，20-40°C保持10-20min后，靜置半天，得到包封第二種藥物的載體。
11.權(quán)利要求1所述控釋藥物載體在制備控釋藥物或化妝品領(lǐng)域的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種溫敏型核殼結(jié)構(gòu)囊泡釋藥載體，由內(nèi)核脂質(zhì)體和外層溫敏高分子復合凝膠構(gòu)成。核殼構(gòu)型不但可以增加囊泡的穩(wěn)定性，其內(nèi)核的脂質(zhì)體和外層的溫敏性生物高分子凝膠都可以作為藥物載體載藥。隨著溫度的上升，外層的凝膠會發(fā)生相變化而皺縮，外層凝膠包裹的藥物通過溫控可以快速釋放出來，而內(nèi)核脂質(zhì)體的包容物因為外層凝膠的存在則可以進行緩慢釋放，從而達到多維釋放的效果。本發(fā)明的釋藥載體具有良好的生物相容性和快速溫度響應性，可以用于化妝品領(lǐng)域，也可作為埋植藥物的載體，應用于開放型手術(shù)植入，微創(chuàng)手術(shù)注射或借助內(nèi)窺鏡植入。
文檔編號A61K8/14GK102198098SQ20111014712
公開日2011年9月28日 申請日期2011年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月2日
發(fā)明者劉洪來, 徐首紅, 李成亮, 翟春濤, 藺肖肖 申請人:上海萊博生物科技有限公司, 華東理工大學