專(zhuān)利名稱(chēng)：用于促進(jìn)骨髓干細(xì)胞歸巢的含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物及其應(yīng)用，具體地說(shuō)，涉及一種用于促進(jìn)骨髓干細(xì)胞歸巢的含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物。
背景技術(shù)：
股骨頭壞死是一種發(fā)病率、致殘率均較高的骨傷科常見(jiàn)難治性疾病，目前，我國(guó)的發(fā)病人數(shù)約為500 750萬(wàn)，且每年的新增患者達(dá)10 20萬(wàn)。股骨頭壞死的治療治療有非手術(shù)和手術(shù)治療兩類(lèi)，但是總體療效并不滿(mǎn)意，因此，尋求有效的治療方法仍然是研究者們探索的方向。干細(xì)胞治療股骨頭壞死是近年來(lái)興起的治療方法，但目前多集中在MSCs移植替代的研究，并且大多數(shù)研究還處于體外和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)階段，要在臨床推廣應(yīng)用還需要大量的研究和人體實(shí)驗(yàn)。干細(xì)胞治療的另一種方法是動(dòng)員自體MSCs到外周血，通過(guò)血液循環(huán)使其“歸巢” 到病灶，以其無(wú)創(chuàng)傷性、不需外科手術(shù)或介入治療的專(zhuān)門(mén)設(shè)備、不必首先在體外分離純化并擴(kuò)增干細(xì)胞等特點(diǎn)，因而更具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是由于因損傷引起機(jī)體自身修復(fù)反應(yīng)，釋放到外周血的BMSCs數(shù)量較少，歸巢到病灶部位的干細(xì)胞數(shù)目更是極少，其自我修復(fù)的作用也極為有限。因此，如何增加外周血的干細(xì)胞數(shù)目及促進(jìn)干細(xì)胞“歸巢”到病灶， 是自體干細(xì)胞治療的難點(diǎn)。研究已證實(shí)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是強(qiáng)有力的干細(xì)胞動(dòng)員劑、可以在較短時(shí)間內(nèi)使外周血干細(xì)胞增高數(shù)十倍至數(shù)百倍。因此，亟需研發(fā)具有促進(jìn)干細(xì)胞歸巢作用的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于促進(jìn)骨髓干細(xì)胞歸巢的含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于促進(jìn)骨髓干細(xì)胞歸巢的含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物，由如下重量份的原料藥制成牛膝10 20、黃芪15 45、當(dāng)歸10 20、川芎 10 20、赤芍6 18、桃仁10 20、紅花10 20、地龍10 20、桂枝10 20、木瓜10 20和威靈仙10 20。優(yōu)選地，前述含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物，由如下重量份的原料藥制成牛膝 12 18、黃芪20 40、當(dāng)歸12 18、川芎12 18、赤芍9 15、桃仁12 18、紅花12 18、地龍12 18、桂枝12 18、木瓜12 18和威靈仙12 18。更優(yōu)選地，前述含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物，由如下重量份的原料藥制成牛膝 15、黃芪30、當(dāng)歸15、川芎15、赤芍12、桃仁15、紅花15、地龍15、桂枝15、木瓜15和威靈仙 15。用于制備本發(fā)明中藥組合物的原料藥，其中，黃芪甘溫，益氣助推血行、當(dāng)歸甘溫， 養(yǎng)生活血，兩者共用為君藥；赤芍酸寒，活血化瘀，桂枝辛溫，溫經(jīng)通脈，散寒止痛，地龍通經(jīng)活絡(luò)，川芎血中之氣藥，辛溫走竄而行氣，三者活血化瘀止痛為臣藥；木瓜、威靈仙長(zhǎng)于疏通經(jīng)絡(luò)，與地龍相配增強(qiáng)疏經(jīng)通痹之功，桃仁、紅花優(yōu)于散瘀止痛、通絡(luò)，共為佐藥；牛膝，入血分，活血通經(jīng)，且能引血下行，“能引諸藥下行”，直達(dá)病所，為使藥。諸藥合用，共奏益氣活血、疏經(jīng)通痹之功。本發(fā)明所述的重量份可以是yg、mg、g或kg等醫(yī)藥領(lǐng)域公知的重量單位。本發(fā)明所述含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物，優(yōu)選使用口服制劑，包括水煎劑、丸劑、 膠囊劑、顆粒劑、沖劑或口服液等，上述劑型均可以通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法制備得到。其中，優(yōu)選為水煎劑(湯劑)，其制備方法為將原料藥加5 7倍重量的水，浸泡1 1. 5小時(shí)，然后煎煮30分鐘，過(guò)濾；藥渣再加3 5倍重量的水，煎煮20分鐘，過(guò)濾；合并兩次濾液，制成水煎劑。本發(fā)明還提供上述中藥組合物在制備促進(jìn)骨髓干細(xì)胞歸巢藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述中藥組合物在制備治療股骨頭壞死的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物，是基于中醫(yī)藥引經(jīng)理論、干細(xì)胞歸巢的理論以及干細(xì)胞技術(shù)，結(jié)合多年臨床研究，采用益氣活血、疏經(jīng)通痹之品和引經(jīng)藥牛膝組成。本發(fā)明提供的含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物具有促進(jìn)骨髓干細(xì)胞歸巢到股骨頭組織中的作用， 從而促進(jìn)骨修復(fù)與血管新生，起到延緩股骨頭壞死疾病進(jìn)程的作用，對(duì)治療早中期股骨頭壞死效果尤佳，且毒副作用小、價(jià)格低廉。


圖1為顯微鏡下#時(shí)四組動(dòng)物股骨頭組織中Brdu免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，A偽手術(shù)組、B模型組、C活骨組、D本發(fā)明組。圖2為顯微鏡下#時(shí)四組動(dòng)物股骨頭組織中SDF-I免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，A偽手術(shù)組、B模型、C活骨組、D本發(fā)明組。圖3為顯微鏡下#時(shí)四組動(dòng)物股骨頭組織病理形態(tài)學(xué)變化，A偽手術(shù)組、B模型組、C活骨組、D本發(fā)明組。圖4為顯微鏡下#時(shí)四組動(dòng)物股骨頭組織中BMP2原位雜交檢測(cè)結(jié)果，A偽手術(shù)組、B模型組、C活骨組、D本發(fā)明組。圖5為顯微鏡下#時(shí)四組動(dòng)物股骨頭組織中VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，A偽手術(shù)組、B模型組、C活骨組、D本發(fā)明組。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物(水煎劑)及其制備方法牛膝15 黃芪30 當(dāng)歸15 川芎15赤芍12 桃仁15 紅花15 地龍15桂枝15 木瓜15 威靈仙15按處方量稱(chēng)重上述原料藥并混合，向原料藥中加5倍重量的水，浸泡1. 5小時(shí)后， 煎煮30分鐘，過(guò)濾；藥渣再加3倍重量的水，煎煮20分鐘，過(guò)濾；合并兩次濾液，制成水煎劑。
實(shí)施例2含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物(水煎劑)及其制備方法牛膝10 黃芪15 當(dāng)歸10 川芎10赤芍6 桃仁10 紅花10 地龍10桂枝10 木瓜10 威靈仙10按處方量稱(chēng)重上述原料藥并混合，向原料藥中加5倍重量的水，浸泡1. 5小時(shí)后， 煎煮30分鐘，過(guò)濾；藥渣再加3倍重量的水，煎煮20分鐘，過(guò)濾；合并兩次濾液，制成水煎劑。實(shí)施例3含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物(水煎劑)及其制備方法牛膝20 黃芪45 當(dāng)歸20 川芎20赤芍18 桃仁20 紅花20 地龍20桂枝120 木瓜20 威靈仙20按處方量稱(chēng)重上述原料藥并混合，向原料藥中加7倍重量的水，浸泡1小時(shí)后，煎煮30分鐘，過(guò)濾；藥渣再加5倍重量的水，煎煮20分鐘，過(guò)濾；合并兩次濾液，制成水煎劑。實(shí)施例4含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物(丸劑)及其制備方法1、按處方量稱(chēng)重下述原料藥牛膝15 黃芪30 當(dāng)歸15 川芎15赤芍12 桃仁15 紅花15 地龍15桂枝15 木瓜15 威靈仙152、制備方法(1)將牛膝、川芎、木瓜、桂枝、威靈仙研磨成粗粉，用80%乙醇回流提取2次，料液重量比為1 20，提取液減壓濃縮，干燥得浸膏。(2)將地龍打粉，過(guò)100目篩，備用。(3)向赤芍、桃仁、紅花中加入10倍重量的純化水，回流提取，提取液減壓濃縮，干
燥得浸膏。(4)當(dāng)歸和黃芪用6倍重量的水煎煮提取3次，每次2小時(shí)，提取液醇沉，沉淀真空干燥，得到的藥渣再以8倍重量的70%乙醇提取2次，每次1.證，提取液濃縮干燥，得浸膏。(5)將⑴、(3)和(4)中得到的浸膏與地龍細(xì)粉混勻。(6)以水或黃酒、醋為黏合劑，泛制法制成水丸劑。(7)以煉蜜為黏合劑，制成蜜丸。實(shí)施例5含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物(膠囊劑)及其制備方法1、按處方量稱(chēng)重下述原料藥牛膝15 黃芪30 當(dāng)歸15 川芎15赤芍12 桃仁15 紅花15 地龍15桂枝15 木瓜15 威靈仙152、制備方法(1)將牛膝、川芎、木瓜、桂枝、威靈仙研磨成粗粉，用80%乙醇回流提取2次，料液重量比為1 20，提取液減壓濃縮，干燥得浸膏。(2)將地龍打粉，過(guò)100目篩，備用。(3)向赤芍、桃仁、紅花中加入10倍重量的純化水，回流提取，提取液減壓濃縮，干燥得浸膏。(4)當(dāng)歸和黃芪用6倍重量的水煎煮提取3次，每次2小時(shí)，提取液醇沉，沉淀真空干燥，得到的藥渣再以8倍重量的70%乙醇提取2次，每次1.證，提取液濃縮干燥，得浸膏。(5)將(1)、(3)和(4)中得到的浸膏與地龍細(xì)粉混合，加入1 1 3(重量比) 的淀粉、糊精或乳糖等輔料，混勻，制粒，裝膠囊，即得。實(shí)施例6含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物(顆粒劑)及其制備方法1、按處方量稱(chēng)重下述原料藥牛膝15 黃芪30 當(dāng)歸15 川芎15赤芍12 桃仁15 紅花15 地龍15桂枝15 木瓜15 威靈仙152、制備方法(1)將牛膝、川芎、木瓜、桂枝、威靈仙研磨成粗粉，用80%乙醇回流提取2次，料液重量比為1 20，提取液減壓濃縮，干燥得浸膏。(2)將地龍打粉，過(guò)100目篩，備用。(3)向赤芍、桃仁、紅花中加入10倍重量的純化水，回流提取，提取液減壓濃縮，干
燥得浸膏。(4)當(dāng)歸和黃芪用6倍重量的水煎煮提取3次，每次2小時(shí)，提取液醇沉，沉淀真空干燥，得到的藥渣再以8倍重量的70%乙醇提取2次，每次1.證，提取液濃縮干燥，得浸膏。(5)將(1)、(3)和(4)中得到的浸膏與地龍細(xì)粉混合，加入1 1 3(重量比) 的淀粉、糊精或乳糖等輔料，混勻，制粒，即得。實(shí)施例7含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物(沖劑)及其制備方法1、按處方量稱(chēng)重下述原料藥牛膝15 黃芪30 當(dāng)歸15 川芎15赤芍12 桃仁15 紅花15 地龍15桂枝15 木瓜15 威靈仙152、制備方法(1)將牛膝、川芎、木瓜、桂枝、威靈仙研磨成粗粉，用80%乙醇回流提取2次，料液重量比為1 20，提取液減壓濃縮，干燥得浸膏。(2)將地龍打粉，過(guò)100目篩，備用。(3)向赤芍、桃仁、紅花中加入10倍重量的純化水，回流提取，提取液減壓濃縮，干
燥得浸膏。(4)當(dāng)歸和黃芪用6倍重量的水煎煮提取3次，每次2小時(shí)，提取液醇沉，沉淀真空干燥，得到的藥渣再以8倍重量的70%乙醇提取2次，每次1.證，提取液濃縮干燥，得浸膏。(5)將(1)、(3)和(4)中得到的浸膏與地龍細(xì)粉混合，加入1 1 3(重量比) 的淀粉、糊精或乳糖等輔料，混勻，制成粉劑或顆粒狀沖劑。實(shí)驗(yàn)例含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物在促進(jìn)骨髓干細(xì)胞歸巢和治療股骨頭壞死中的應(yīng)用1材料實(shí)施例1的水煎劑(水浴加熱濃縮至含生藥lg/mL)、健康成年日本大耳白兔(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。
2方法與結(jié)果2. 1 方法2. 1. 1模型制備和給藥采用液氮冷凍左側(cè)股骨頭方法建立兔股骨頭壞死模型，造模后將其隨機(jī)分為3 組，并設(shè)立偽手術(shù)對(duì)照。造模后各組動(dòng)物給予皮下注射G-CSF 30yg/kg*d，連續(xù)7天，同時(shí)分別給予實(shí)施例1的水煎劑(本發(fā)明組)、活骨湯(實(shí)施例1不含牛膝)水煎劑(活骨組) 及蒸餾水(模型組、偽手術(shù)組)。2. 1. 2動(dòng)員骨髓干細(xì)胞與干細(xì)胞歸巢指標(biāo)檢測(cè)各組動(dòng)物于皮下rhG-CSF注射前、注射后3、5、7天分別檢測(cè)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察不同時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢(shì)，以間接反應(yīng)骨髓干細(xì)胞的動(dòng)員情況。取材前3天所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射BrdU50mg/kg，連續(xù)3天。給藥2w和#后，每組4只動(dòng)物處死取左側(cè)股骨頭，4%多聚甲醛固定、鹽酸甲酸溶液脫鈣、梯度酒精脫水，常規(guī)石切片。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)BrdU和SDF-I的表達(dá)，以觀察對(duì)骨髓干細(xì)胞歸巢的作用。2. 1. 3對(duì)股骨頭壞死兔的治療作用上述組織，分別采用H E染色股骨頭組織病理學(xué)觀察，以鑒定本發(fā)明中藥組合物對(duì)股骨頭壞死兔的治療作用。2. 1. 4對(duì)股骨頭壞死兔骨修復(fù)的影響動(dòng)物處死前取血，分離血清，ELISA法檢測(cè)血清骨鈣素(BGP)的水平，上述骨組織切片，經(jīng)原位雜交檢測(cè)股骨頭BMP2的表達(dá)，以確定股骨頭骨修復(fù)的情況。2. 1. 5對(duì)股骨頭壞死兔血管新生的影響上述骨組織切片，經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)股骨頭VEGF的表達(dá)，以明確股骨頭血管新生的情況。2. 2 結(jié)果2. 2. 1干細(xì)胞動(dòng)員情況G-CSF是一種常用的骨髓干細(xì)胞動(dòng)員劑，它可將骨髓干細(xì)胞動(dòng)員后，釋放到外周血。因此常用外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)其動(dòng)員情況。本發(fā)明中，采集各組動(dòng)物注射rhG-CSF 前和注射后3、5、7天靜脈血，通過(guò)測(cè)量血細(xì)胞數(shù)量，主要是白細(xì)胞數(shù)量，來(lái)觀察不同時(shí)間點(diǎn)骨髓干細(xì)胞的動(dòng)員情況，結(jié)果如表1所示。表1 rhG-CSF對(duì)各組動(dòng)物外周WBC計(jì)數(shù)的影響
權(quán)利要求
1.一種用于促進(jìn)骨髓干細(xì)胞歸巢的含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物，其特征在于，所述中藥組合物由如下重量份的原料藥制成牛膝10 20、黃芪15 45、當(dāng)歸10 20、川芎10 20、赤芍6 18、桃仁10 20、紅花10 20、地龍10 20、桂枝10 20、木瓜10 20和威靈仙10 20。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于，所述中藥組合物由如下重量份的原料藥制成牛膝12 18、黃芪20 40、當(dāng)歸12 18、川芎12 18、赤芍9 15、桃仁 12 18、紅花12 18、地龍12 18、桂枝12 18、木瓜12 18和威靈仙12 18。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中藥組合物，其特征在于，所述中藥組合物由如下重量份的原料藥制成牛膝15、黃芪30、當(dāng)歸15、川芎15、赤芍12、桃仁15、紅花15、地龍15、桂枝15、 木瓜15和威靈仙15。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的中藥組合物，其特征在于，其為口服制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的中藥組合物，其特征在于，所述口服制劑為水煎劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、沖劑或口服液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的中藥組合物，其特征在于，所述水煎劑的制備方法為將原料藥加5 7倍重量的水，浸泡1 1. 5小時(shí)，然后煎煮30分鐘，過(guò)濾；藥渣再加3 5倍重量的水，煎煮20分鐘，過(guò)濾；合并兩次濾液，制成水煎劑。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的中藥組合物在制備促進(jìn)骨髓干細(xì)胞歸巢藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的中藥組合物在制備治療股骨頭壞死藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于促進(jìn)骨髓干細(xì)胞歸巢的含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物，所述中藥組合物由如下重量份的原料藥制成牛膝10～20、黃芪15～45、當(dāng)歸10～20、川芎10～20、赤芍6～18、桃仁10～20、紅花10～20、地龍10～20、桂枝10～20、木瓜10～20、威靈仙10～20。本發(fā)明提供的含引經(jīng)藥牛膝的中藥組合物具有促進(jìn)自體骨髓干細(xì)胞歸巢的作用，從而促進(jìn)股骨頭內(nèi)骨修復(fù)與血管再生，對(duì)延緩股骨頭壞死等骨關(guān)節(jié)疾病的病情發(fā)展具有顯著效果，且毒副作用小，價(jià)格低廉。
文檔編號(hào)A61K35/64GK102423351SQ20111015425
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月9日
發(fā)明者孔祥英, 林娜, 王榮田, 田能, 陳衛(wèi)衡 申請(qǐng)人:中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所