專(zhuān)利名稱(chēng)：紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖GS-B-W-1、其制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術(shù)：
食藥用真菌具有抗腫瘤抗病毒、降血脂、延緩衰老、護(hù)肝排毒、促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)生物合成等多種功效，在中國(guó)有悠久的使用歷史。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離得到的，為真菌類(lèi)藥物的藥效部位，是能夠控制細(xì)胞分裂分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)衰老的一類(lèi)活性多糖。紫芝(Ganoderma sinense)作為靈芝屬真菌(2005版中國(guó)藥典)，其有較明顯的抗腫瘤、提高免疫力的功效。由于其制備工藝不明確，多糖含量較低(一般<60%)。另外紫 芝粗多糖組分復(fù)雜，主要藥效部位和組分尚未闡明。且由于紫芝子實(shí)體資源稀少，市場(chǎng)上少見(jiàn)紫芝產(chǎn)品。紫芝粗多糖溶解度很差，粘度較大，顏色深，味重，其分子量從幾千到上千萬(wàn)，分子量跨度很大，難找到合適的質(zhì)量控制方法。研究表明，分子量是影響多糖組分藥效的主要因素之一，若能將粗多糖分離純化得到均一多糖，闡明其構(gòu)效關(guān)系，不僅能提高藥效水平，并且對(duì)質(zhì)量控制有很大的幫助。中國(guó)專(zhuān)利200710045369. 4 “一種紫芝發(fā)酵方法及制得的紫芝菌絲體”公開(kāi)了一種紫芝液體深層發(fā)酵產(chǎn)生菌絲體的方法，該菌絲體用水提醇沉法提取得到的粗多糖含量在39 75%，其體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)中，口服劑量為40mg/kg/天時(shí)有一定抗腫瘤活性。中國(guó)專(zhuān)利
200710045368.x “紫芝菌絲體胞內(nèi)多糖及其制備方法和應(yīng)用”公開(kāi)了一種從紫芝液體深層發(fā)酵產(chǎn)生的菌絲體中提取制備得到粗多糖的方法。該方法涉及的水提醇沉法提取得到粗多糖含量在39 75%。其藥理實(shí)驗(yàn)的劑量也為40mg/kg/天(給藥方式口服喂藥)。楊國(guó)紅，楊義芳，金雋迪(紫芝液體深層發(fā)酵的抗腫瘤活性部位研究[J].中草藥，2008，39 (6)877-880)對(duì)紫芝液體深層發(fā)酵的抗腫瘤活性多糖進(jìn)行了研究，從紫芝菌絲體中提取得到胞內(nèi)多糖，其藥理實(shí)驗(yàn)的劑量也為40mg/kg/天(給藥方式口服喂藥)。然而，以上專(zhuān)利申請(qǐng)和文章均未涉及多糖分子量、純度及結(jié)構(gòu)解析方面的研究。鑒于現(xiàn)有技術(shù)的狀況，需要尋找多糖含量高、具有明顯的抗腫瘤活性且給藥劑量比常規(guī)方法提取得到的粗多糖的更低的紫芝菌絲體抗腫瘤多糖組分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種多糖含量高、抗腫瘤活性更明顯且給藥劑量更低的紫芝菌絲體抗腫瘤多糖組分。如本發(fā)明所使用，“液體深層發(fā)酵”是發(fā)酵工業(yè)上常用的一種發(fā)酵方法，它的培養(yǎng)基是液態(tài)的。如本發(fā)明所使用，“菌絲體”是菌絲集合在一起構(gòu)成一定的宏觀結(jié)構(gòu)。
如本發(fā)明所使用，“均一多糖”是單糖通過(guò)聚合而成的多糖，聚合的糖有特定的結(jié)構(gòu)單元。均一多糖可分為相同單糖形成的聚糖和不同單糖形成的雜多糖。本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖，將其命名為GS-B-W-1，其特征在于，所述均一多糖的總糖含量為大于95%，優(yōu)選為大于98. 5% ;且所述均一多糖GS-B-W-I的分子量為3000-10000道爾頓，優(yōu)選為7762. 23道爾頓。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，經(jīng)TLC和HPLC分析可以得知，所述均一多糖GS-B-W-I中的多糖主要由半乳糖和葡萄糖組成，所述半乳糖、葡萄糖的摩爾比為
I.8-2. 2 1，優(yōu)選 I. 98 I。進(jìn)一步,經(jīng)高點(diǎn)酸氧化及Smith降解分析得知，所述均一多糖GS-B_W_1是具有分支的(I — 4) - α -葡萄糖和半乳糖的聚糖，其主鏈上聯(lián)有I — 6連接的半乳糖，和少量未知
單糖。 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體提取物，其包含以上所述的均一多糖，所述均一多糖的總糖含量為大于95%，優(yōu)選為98. 5且所述均一多糖的分子量為3000-10000道爾頓，優(yōu)選為7762. 23道爾頓。本發(fā)明結(jié)合膜技術(shù)和柱層析將不同分子量多糖分離，從而得到紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體抗腫瘤均一多糖GS-B-W-I，該均一多糖GS-B-W-I在降低給藥劑量、并且不增加毒性的前提下能達(dá)到與傳統(tǒng)方法得到的紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體多糖相當(dāng)?shù)乃幮?。超濾技術(shù)是指常溫下以一定壓力和流量，利用不對(duì)稱(chēng)微孔結(jié)構(gòu)和半透膜分離介質(zhì)、以錯(cuò)流方式進(jìn)行過(guò)濾，使溶劑及小分子物質(zhì)通過(guò)，高分子物質(zhì)被濾膜阻留，從而達(dá)到分離過(guò)程無(wú)相變、分離效率高、無(wú)需添加化學(xué)試劑無(wú)污染、無(wú)需加熱、能耗低、條件溫和不破壞成分、操作方便、流程短的特點(diǎn)。利用膜技術(shù)能將不同分子量的樣品分割開(kāi)。柱層析能按照不同的原理將復(fù)雜的混合物分離純化，已得到單一組分為目的。而分離純化的關(guān)鍵在于所選的填料，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明所選擇的兩個(gè)填料分別是陰離子交換樹(shù)脂和葡聚糖凝膠，前者是根據(jù)被分離組分離子交換能力的差別而實(shí)現(xiàn)分離，后者根據(jù)被分離組分分子的線團(tuán)尺寸而進(jìn)行分離。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖GS-B-W-I的制備方法，其特征在于，包括如下步驟紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體經(jīng)水提醇沉得到粗多糖，粗多糖經(jīng)超濾、濃縮和柱層析，得到紫芝液體深層菌絲體均一多糖GS-B-W-I。上述制備方法簡(jiǎn)單易行、生產(chǎn)周期短、成本較低廉。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，超濾步驟通過(guò)超濾膜進(jìn)行。選擇截留分子量為1-5萬(wàn)的超濾膜。更優(yōu)選地，所述超濾膜的截留分子量為3萬(wàn)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述超濾膜可由聚酰胺聚醚砜膜或醋酸纖維素制成。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，濃縮步驟通過(guò)納濾膜進(jìn)行。優(yōu)選由聚酰胺復(fù)合材料構(gòu)成的納濾膜。優(yōu)選截留分子量為150-300的納濾膜。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，柱層析步驟通過(guò)加負(fù)壓進(jìn)行。采取的儀器設(shè)備為螺動(dòng)泵，自動(dòng)收集儀。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明所選擇的兩個(gè)填料分別是陰離子交換樹(shù)脂和葡聚糖凝膠。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，柱層析選擇的填料陰離子交換樹(shù)脂為DEAE-cellulose 52。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，柱層析選擇的填料葡聚糖凝膠的型號(hào)為Sephadex_50o本發(fā)明制備均一多糖GS-B-W-I的具體步驟如下紫芝菌絲體(本發(fā)明所述“紫芝菌絲體”根據(jù)中國(guó)專(zhuān)利200710045369. 4“一種紫芝發(fā)酵方法及制得的紫芝菌絲體”中公開(kāi)的方法所得)加水提取，提取液減壓濃縮后，醇沉(通常使用乙醇)，沉淀部分干燥至恒重后，再溶解于水，過(guò)濾，用一定分子量的超濾膜超濾，再用一定分子量的納濾膜分別濃縮得到截留液和透過(guò)液，將上述透過(guò)液冷凍干燥，得到分子量小于3萬(wàn)的紫芝菌絲體多糖組分GS-B ；再經(jīng)過(guò)陰離子交換樹(shù)脂，葡聚糖凝膠柱得到紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖GS-B-W-I。本發(fā)明利用膜技術(shù)和柱層析將紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體粗多糖純化成均一多糖，藥理實(shí)驗(yàn)表明純化后均一多糖GS-B-W-I有明顯的抗腫瘤作用的活性。
本發(fā)明方法得到的紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖GS-B-W-I含量為大于95%，優(yōu)選為98.5% (苯酚-硫酸法檢測(cè))，其分子量為7762. 23Da。將該均一多糖部位進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)，GS-B-W-I在低濃度下即有顯著的促進(jìn)的T淋巴細(xì)胞增殖活性，而對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)中，GS-B-W-I呈一定的量效關(guān)系，且未見(jiàn)對(duì)給藥動(dòng)物的毒性反應(yīng)。因此，本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖GS-B-W-I在制備抗腫瘤藥物和提高免疫力藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本方法提供的紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖GS-B-W-I的多糖含量更高、給藥劑量更低、純度更高，且其制備工藝亦適于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例I所得紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖GS-B-W-I的HPGPC圖譜圖2為實(shí)施例I步驟3)中GS-B過(guò)DEAE的洗脫曲線。圖3為實(shí)施例I步驟4)中w (14-26)過(guò)Sephadex_50的洗脫曲線。圖4為GS-B-W-I水解后的TLC結(jié)果，其中I為木糖；2為鼠李糖；3為半乳糖；4為甘露醇；5為葡萄糖；6為GS-B ;7為混合單糖；8為GS-B-W-I ;9為阿拉伯糖；10為葡萄糖醛酸；11為半乳糖醛酸；12為巖藻糖。圖5A和5B分別為若干標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物和GS-B_W_1水解并乙?；蟮腉C色譜圖，其中I為鼠李糖；2為阿拉伯糖；3為木糖；4為甘露糖；5為葡萄糖；6為半乳糖。圖6為高碘酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7A-7D分別為水、赤蘚醇、甘油、實(shí)施例I制得的GS-B_W_1降解樣品的HPLC圖
-i'TfeP曰。圖8為實(shí)施例I制得的GS-B-W-I的紫外圖譜。圖9為實(shí)施例I制得的GS-B-W-I的紅外圖譜。圖10為實(shí)施例I制得的GS-B-W-I的1H-NMR圖譜。圖11為實(shí)施例I制得的GS-B-W-I的13C NMR圖譜。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明，通過(guò)以下實(shí)施例來(lái)說(shuō)明，但這些實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖GS-B-W-I的制備I)粗多糖的制備紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體(所述紫芝液體深層發(fā)酵液通過(guò)中國(guó)專(zhuān)利
200710045369.4 “一種紫芝發(fā)酵方法及制得的紫芝菌絲體”中所述方法得到)具體方法如下紫芝菌種(Ganoderma sinense)從山東購(gòu)得。平板培養(yǎng)基在121°C下消毒滅菌30分鐘，28°C培養(yǎng)4-6天。搖瓶種子培養(yǎng)基121°C消毒滅菌30分鐘，冷卻后在無(wú)菌室接種，在28± I°C搖瓶間的搖床上，震蕩培養(yǎng)5-7天，挑選好的搖瓶種子進(jìn)發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)5-6天，最后得到紫芝液體發(fā)酵菌絲體。 將菌絲體用水提取I 3h，提取液減壓濃縮，加入乙醇沉淀，沉淀部分干燥至恒重，得粗多糖。2)超濾分離取粗多糖用200倍的水溶，過(guò)濾，取水溶液進(jìn)行外壓式超濾處理(超濾膜可以是由聚酰胺制成、截留分子量為3萬(wàn)的超濾膜；或由聚醚砜膜制成、截留分子量為I萬(wàn)的超濾膜；或由醋酸纖維素制成、截留分子量為5萬(wàn)的超濾膜)，進(jìn)樣壓力=O. 2Mpa，濃溶液流出壓力=O. 15Mpa，將水溶液分為截留液和透過(guò)液。將透過(guò)液用納濾膜濃縮(納濾膜是聚酰胺復(fù)合材料構(gòu)成的，截留分子量為150、200或250)，并冷凍干燥，得到透過(guò)液部分GS-B。3)柱層析分離取GS-B I. 5g，用少量去離子水溶液溶解，上已平衡好的DEAE-celIulose 52纖維素柱，用去離子水洗脫，以10mL/min管收集洗脫液2個(gè)柱體積。每隔2 5管用苯酚-硫酸法測(cè)定其吸收值，并做洗脫曲線。洗脫曲線見(jiàn)附圖2。根據(jù)該洗脫曲線，分別合并主峰14#-26#、27#_42#，并濃縮凍干，稱(chēng)重。其中14#-26#記為w(14-26)占洗脫液80%量(1203. 8mg)。取少量配成5mg/mL水溶液，進(jìn)行HPGPC檢測(cè)，可知，該洗脫部分主要由保留時(shí)間為31min峰的多糖組成，根據(jù)保留時(shí)間-分子量對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可知該流份w (14-26)平均分子量在5000左右。故選用分離范圍合適的Sephadex-50凝膠柱為下一步的純化載體。4)葡聚糖凝膠Sephadex-50的純化取DEAE柱洗脫的w (14_26) 1200mg，用少量去離子水溶解，上已平衡好的S印hadexG-50柱，用去離子水洗脫，以5mL/min管，收集2個(gè)柱體積。每隔2管用苯酚-硫酸法測(cè)定其吸收值，并做洗脫曲線，洗脫曲線見(jiàn)附圖3。根據(jù)該洗脫曲線，合并8#_14#，濃縮冷凍干燥，稱(chēng)重，得到固體255mg，名為GS-B-W-I0實(shí)施例2 :苯酚硫酸法測(cè)定本發(fā)明紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖GS-B-W-I的
多糖含量具體步驟如下標(biāo)品配制精密稱(chēng)定干燥好的葡萄糖25mg,定溶至100ml,配成250ug/ml標(biāo)品溶液，分別取O. 05,0. 1,0. 15,0. 2,0. 25,0. 3mL于試管中，加去離子水補(bǔ)足O. 3mL，分別加5%苯酚O. 7mL充分搖勻，快速加入濃硫酸4mL，50°C、40min水浴，冷卻后測(cè)定吸光度。空白配制取0.6ml去離子水，加5%苯酚I. 4ml，濃硫酸8ml，水浴加熱，冷卻，作
空白液。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液和空白液用紫外分光光度法于488nm處測(cè)其吸收值，并做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品配制取GS-B-W-I樣品精密稱(chēng)定5mg,加入IOml的去離子水中配制O. 5mg/ml溶液，取O. 05ml于試管中，加水補(bǔ)足O. 3ml，按標(biāo)品液依次加入苯酚、濃硫酸，水浴加熱，冷
卻，作樣品液。檢測(cè)將待測(cè)樣品用紫外分光光度法于488nm處測(cè)其吸收值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得 GS-B-W-I的多糖含量為98. 5%。實(shí)施例3 :用葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品Dextron系列標(biāo)定本發(fā)明紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖GS-B-W-I中多糖的分子量具體方法如下色譜條件TSK-GEL GMPffxl色譜柱；流動(dòng)相為水；流速0. 3mL/nin ;柱溫35°C;檢測(cè)器為示差檢測(cè)器。標(biāo)品Dextron、GS-B-ff-1樣品分別用水溶解,進(jìn)樣。測(cè)定葡聚糖Dextron系列和GS-B-W-l的保留時(shí)間，以Dextron的保留時(shí)間-Dextron系列的分子量對(duì)數(shù)值做標(biāo)準(zhǔn)曲線,將GS-B-W-I的保留時(shí)間帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,可知GS-B-W-I 為 7762. 23 道爾頓。實(shí)施例4 :紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖GS-B-W-I的結(jié)構(gòu)解析I)完全酸水解取5mg實(shí)施例I制得的GS-B-W-1，放入安培瓶中，加入2mL,2mol/L的三氟醋酸(TFA)，充N(xiāo)2后封管，在110°C下水解4h。試管內(nèi)溶液減壓蒸干，然后加入甲醇I 2mL蒸干，重復(fù)三次操作，以完全除去TFA。再向樣品中加入O. 5mL左右的水使樣品溶解。I. 1GS-B-W-1 水解后的 TLC 結(jié)果在高效硅膠板(型號(hào)HSGF254)上分別點(diǎn)多糖水解樣品、單糖及混合單糖，分別以丙酮-水(24 I);正丁醇-乙酸乙酯-異丙醇-醋酸-水-吡啶(35 100 60 35 30 35)上行二次展開(kāi)，取出晾干，用苯胺-鄰苯二甲酸于110°C加熱lOmin。TLC顯示樣品對(duì)應(yīng)處有葡萄糖和半乳糖兩個(gè)斑點(diǎn)，見(jiàn)附圖4。從TLC圖可以看出，本發(fā)明GS-B-W-I是由半乳糖、葡萄糖組成的一種雜多糖。I. 2還原與乙?；皻庀喾治鯥. 2. I還原與乙?；瘜⑺夂蟮臉悠啡苡?mL左右的蒸餾水中，加入20mgNaBH4的于室溫下還2h (不時(shí)地?fù)u振一下)，再逐滴加入冰醋酸破壞過(guò)量的NaBH4,調(diào)節(jié)溶液的PH值至4 5之間，減壓蒸干，加入I 2mL甲醇及一滴冰醋酸，再減壓蒸干，如此重復(fù)三次，最后一次不加冰醋酸，然后于80 90°C真空干燥10 15min或室溫下真空干燥(P2O5) 5 6h。還原后的樣品中加入2mL醋酐，密塞，100°C反應(yīng)lh，減壓蒸干，加入2mL甲苯，再蒸干，重復(fù)三次以完全除去過(guò)剩的醋酐。
I. 2. 2萃取及氣相分析將乙?；蟮漠a(chǎn)物用氯仿和蒸餾水交替溶解轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，振搖后，靜置分層，去除水層，再以等體積的蒸餾水洗滌二次，去處水層，氯仿層以無(wú)水硫酸鈉干燥，振搖后放置lOmin，再過(guò)濾除去硫酸鈉固體，將氯仿溶液濃縮至O. ImL左右后進(jìn)行氣相色譜(GC)分析。I. 2. 2. I 氣相條件色譜柱HP-1 21000mmX0. 2mm彈性石英毛細(xì)管色譜柱；固定相0V_225 ;載氣氮?dú)?；檢測(cè)器氫火焰離子化檢測(cè)器(FID);色譜條件柱室起始溫度130°C，保留5min。
程序升溫4°C /min,終止溫度240°C ;汽化溫度280°C ;檢測(cè)器溫度250°C。I. 2. 2. 2 GS-B-W-I 氣相結(jié)果GS-B-W-I水解并乙?；蟮腉C色譜圖(圖5B)顯示，有葡萄糖峰(6號(hào)峰)、半乳糖峰(5號(hào)峰)和一未知單糖峰(7號(hào)峰)，根據(jù)其峰面積和質(zhì)量比可推得葡萄糖和半乳糖的摩爾比為I : I. 98，而7號(hào)峰占比例較小，這可能是TLC分析時(shí)未檢出其他斑點(diǎn)的原因。2)高碘酸氧化2. I高碘酸標(biāo)準(zhǔn)曲線30mmol/L高碘酸液配制精密稱(chēng)取高碘酸鈉322. 08mg定溶于50mL容量瓶。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取8個(gè)250mL容量瓶分別依次加入高碘酸鈉溶液O. 2,0. 4,0. 6，
O.8，1，1.5，2mL，加去離子水定容。放置IOmin后，以水作為空白，用分光光度法，在223nm的波長(zhǎng)處測(cè)吸收度，以高碘酸鈉μ mol/L為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)表I和圖6。表I、不同濃度高碘酸在223nm的吸收度
高石典B交濃度(μιηοΙ/L )A(223nm)
240.231
480.483
72O 73/z
96 0.978 120 1.212 180 1.829 _240_2.4742. 2高碘酸氧化反應(yīng)精密稱(chēng)取GS-B-W-1 9. 93mg于IOmL容量瓶中，然后加入15mmol/LNaI04定容至刻
度。放置在暗處反應(yīng)(4°C )，間隔時(shí)間(0h、2h、24h、48h、72h......)取樣O. lmL，用蒸餾水
稀釋250倍，用紫外分光光度計(jì)，以蒸餾水作空白對(duì)照，在223nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，直到吸光度值恒定為止。加乙二醇終止反應(yīng)(中和剩余的高碘酸)，高碘酸氧化完成。2. 3用NaOH滴定甲酸的生成量O. lmol/L NaOH滴定液標(biāo)定精密稱(chēng)取105°C恒重的鄰苯二甲酸氫鉀O. 6g溶于50mL新沸過(guò)的冷水，酚酞做為指示液，滴定至溶液顯粉紅色。
最終測(cè)得NaOH溶液濃度為O. 092mol/L。甲基紅指示劑配制精密稱(chēng)取O. 1004g,加O. 05mol/L NaOH溶液7. 4mL使溶解，再加水稀釋至200mL，即得。取2mL上述氧化液，加I滴甲基紅作指示劑，用O. 0092mol/L NaOH(用鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定)滴定，計(jì)算得甲酸生成量。2. 4結(jié)果顯示2. 4. I吸光值恒定時(shí)測(cè)得A吸收值為O. 415。高碘酸液對(duì)照初始A吸收值為O. 607，而高碘酸液在72h后吸收值無(wú)變化。故可以得出高碘酸與樣品反應(yīng)的O. 51mol。2. 4. 2根據(jù)滴定最后計(jì)算得甲酸生成量為O. 23mmolo2. 4. 3通過(guò)NaOH滴定結(jié)果計(jì)算得知有甲酸生成，說(shuō)明存在I —、1 — 6鍵型；而高碘酸消耗量高于甲酸生成量的二倍，說(shuō)明存在被高碘酸氧化不產(chǎn)生甲酸的己糖殘基I — 2、 I — 2，6、1 — 4、1 — 4，6鍵型；甲酸生成量顯示分子中I —、1 — 6鍵型的己糖殘基約占23 %，高碘酸消耗量及甲酸生成量顯示分子中的糖殘基均可被氧化。可以初步推斷可能存在I — 2糖苷鍵，I — 4糖苷鍵，I — 6糖苷鍵結(jié)構(gòu)。3) Smith 降解反應(yīng)將乙二醇處理后的GS-B-W-I用高碘酸氧化后的溶液透析(Mw = 3500)，蒸餾水透析48小時(shí)。濃縮，加入NaBH4還原過(guò)夜。用冰醋酸中和至pH為6 7，透析，減壓蒸至2mL左右，進(jìn)行冷凍干燥。將還原的樣品放入安瓿瓶中，加入2mL 2mol/L后封管，于110°C下水解4h，反應(yīng)瓶中的溶液減壓蒸干，再加入I 2mL的甲醇，蒸干，重復(fù)三次以除盡過(guò)量的TFA，水解后的樣品用ImL水溶解，做HPLC考察。3. I色譜條件液相色譜柱TYPEUG80 (4. 6 X 250mm)軟件處理系統(tǒng)Minennium32版GPC數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)檢測(cè)器Water 2410示差折光檢測(cè)器流動(dòng)相乙腈水=3 I柱溫箱35°C檢測(cè)器溫度35°C流速lmL/min對(duì)照品為赤蘚醇、甘油。3. 2 結(jié)果見(jiàn)附圖 7A-7D。GS-B-W-I降解產(chǎn)物HPLC檢測(cè)出少量甘油和大量赤蘚醇表明多糖GS-B-W-I含有可以產(chǎn)生甘油的鍵型，即I—、I — 2、I — 6、I — 2，6和可生成赤蘚醇的鍵型，即I — 4、I — 4，6，說(shuō)明GS-B-W-I含還原端和I — 4、I — 6、I — 4，6糖苷鍵，其中由I — 4構(gòu)成主鏈結(jié)構(gòu)。4)紫外圖譜見(jiàn)附圖8。取GS-B-W-I樣品進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，在260nm和280nm處未見(jiàn)吸收，證明不含核酸和蛋白質(zhì)。5)紅外圖譜取Img GS-B-W-I樣品，用溴化鉀壓片進(jìn)行IR檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)附圖9。GS-B-W-I紅外光譜圖有多糖特征吸收，3382CHT1處寬峰強(qiáng)吸收為多糖中羥基0_H伸縮振動(dòng)吸收峰，2923CHT1處出現(xiàn)一個(gè)較弱的吸收峰為次甲基的C-H伸縮振動(dòng)4372(^-1是O-H的彎曲振動(dòng)吸收1047(^1和ΙΙΙδαιΓ1是C-O的伸縮振動(dòng)；在835 11_1的吸收峰是α -糖苷鍵的特征吸收，說(shuō)明GS-B-W-I中存在α -糖苷鍵而沒(méi)有β -糖苷鍵(因沒(méi)有895cm—1的特征吸收峰)；在1730cm—1處沒(méi)有吸收峰，說(shuō)明不含糖醛酸。6)核磁圖譜核磁光譜(NMR):取多糖樣品IOmg裝入核磁管，溶于重水中，在核磁共振儀上進(jìn)行1H-NMR, 13C-NMR等光譜分析。結(jié)果見(jiàn)附圖10。1H-NMR圖譜分析主要解決多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵構(gòu)型問(wèn)題，由于多糖的信號(hào)大多堆集在化學(xué)位移δ 3. 5 5. 5的狹小范圍內(nèi)，δ 3. 5 4為糖環(huán)質(zhì)子信號(hào)。除Cl上質(zhì)子信號(hào)易解析外其他C2 C6的質(zhì)子信號(hào)相互重疊交叉，解析困難。從附圖10中可見(jiàn)Cl質(zhì)子化學(xué)位移位于δ 4. 8 5. 3間，則證明GS-B-W-I含α型吡喃己糖，與紅外結(jié)果相符。13C-NMR圖譜分析如附圖11，均顯示多重峰，表示多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。通過(guò)比較化學(xué)位移已歸屬的取代單糖或簡(jiǎn)單寡糖來(lái)歸屬未知多糖，同時(shí)利用苷化經(jīng)驗(yàn)，將GS-B-W-I的 13C-NMR圖譜信號(hào)歸屬如下δ 71. 9為取代后的C6信號(hào)峰，δ 71. I為未取代的C5信號(hào)峰，根據(jù)半乳糖和葡萄糖中各個(gè)C的化學(xué)位移，推測(cè)δ 92. 862為a -D-葡糖糖的異頭碳Cl信號(hào)峰，δ 61. 495為a -D-葡萄糖的C4信號(hào)峰，推測(cè)葡萄糖以I — 4連接；δ 96. 594為a -D-半乳糖的異頭碳Cl信號(hào)峰，δ 71. 180為a -D-半乳糖的C4信號(hào)峰，半乳糖以I — 4連接；其余化學(xué)位移值δ 65 72為糖環(huán)上非連接碳C2、C3、C5信號(hào)峰。δ 63 65存在三組峰，證明另有三種未取代的C6，推測(cè)可能為不同連接方式的a-D-半乳糖與α-D-葡萄糖的C6。δ 56. O可能為未知單糖的甲基部位的信號(hào)峰。實(shí)施例6 :實(shí)施例I制得的紫芝液體深層發(fā)酵均一多糖GS-B-W-I的藥理活性1)GS-B的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)I. I動(dòng)物昆明種小鼠，雄性I. 2實(shí)驗(yàn)方法取生長(zhǎng)良好的小鼠肝癌Η22腹水或Lewis肺癌瘤塊，用生理鹽水以I : 4稀釋(細(xì)胞濃度約1-2 X IO7個(gè)/ml)，每只小鼠右腋皮下接種O. 2ml。接種后次日起給藥，給藥體積為O. 5ml/20g體重，小鼠肝癌H22連續(xù)腹腔注射7天，Lewis肺癌連續(xù)腹腔注射10天。雙靈固本散經(jīng)口灌胃。接種后10日解剖H22，14日解剖Lewis肺癌，取瘤塊，稱(chēng)瘤重，結(jié)果判定根據(jù)以下公式
對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重 腫瘤抑制率％=__X 100% 對(duì)照組平均瘤重I. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果表I、GS-B對(duì)小鼠H22的抑制率劑量給藥動(dòng)物數(shù)動(dòng)物體重(g) 瘤重(g)
組別 -抑瘤率％_(mg/kg) 方案始終 (去瘤后) X士SD
空白對(duì)照15 15 29.49±2.67 2.59±0.67
雙靈固本散250 igx7 10 10 28.38±2.39 1.70士0.45** 34.40
GS-B26.8 ipx7 10 10 24.69±2.79** 1.64±0.28** 36.53與對(duì)照組比較*P < O. 05廣P < O. 01。表2、GS-C對(duì)小鼠H22和Lewis的抑制率
組別劑量給藥動(dòng)物數(shù)動(dòng)物體重(g)瘤重(g)抑瘤率％
(mg/kg) 方案始終(去瘤后) x 士SD
空白對(duì)照10 1021.19±1.353.44土0.64
雙靈固本散250 igx7 6 621.41士1.35 2.32士0.36** 32.45
GS-B26.8 ipx7 6 619.93±1.77 2.62±0.29* 23.77與對(duì)照組比較*P< O. 05, **P < O. Ol0由表1，表2可知分子量小于3萬(wàn)(GS-B)的多糖部位有一定的抗腫瘤作用。2) GS-B-W-I的體外對(duì)人腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用(MTT實(shí)驗(yàn))2. I實(shí)驗(yàn)材料及配制(I)細(xì)胞株A549(人肺癌細(xì)胞株)、SK0V3(人卵巢癌細(xì)胞株)、K562(人白血病細(xì)胞株)、SMMC-7721 (人肝癌細(xì)胞株)。上述細(xì)胞株由上海醫(yī)藥工業(yè)研究藥理室保存，傳代維持。(2)DMEM完全培養(yǎng)基添加10%新生牛血清(GIBCO BRL)、雙抗；⑶O. 25%胰蛋白酶溶液(Trypsin):購(gòu)自Invitrogen公司，_20°C保存。(4)磷酸緩沖液(PBS) NaC18g, KC10. 2g，Na2HPO4L 15g，KH2PO4O. 2g，溶于 IL 雙蒸水，121°C高壓消毒20min，4°C保存。(5) MTT (AMRESC0)溶液用 PBS 配成 5mg/ml 溶液。(6)溶解液每IOOml去離子雙蒸水含SDS 10g，異丁醇5ml，濃鹽酸O. 1ml。(7)對(duì)照品泰素 Bristol Myers Squibb SRL.批號(hào)0E60359。2. 2實(shí)驗(yàn)方法(I)樣品及對(duì)照品制備將樣品溶解于PBS或DMSO中，得到濃度為10mg/ml的溶液。再用PBS作梯度稀釋?zhuān)玫綕舛确謩e為1000 μ g/ml、100 μ g/ml、10 μ g/ml、I μ g/ml、
0.I μ g/ml、0. 01 μ g/ml的稀釋樣品。對(duì)照品原液為6mg/ml，用PBS作梯度稀釋?zhuān)玫綕舛确謩e為 1000 μ g/ml、100 μ g/ml、10 μ g/ml>I μ g/ml、0. I μ g/ml、0. 01 μ g/ml 的稀釋樣品。(2)將稀釋好的樣品和對(duì)照品加入平底96孔板中，每孔10μ 1，每點(diǎn)作兩個(gè)平行測(cè)試。
(3)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并洗滌后懸浮于含10%血清的DMEM培養(yǎng)基中，并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液密度至2 X IO5細(xì)胞/ml。(4)在平底96孔板中，每孔加入90 μ I細(xì)胞，最后一孔加入90 μ I培養(yǎng)基，于37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。(5)每孔中加入20 μ I 5mg/mlMTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫3 4小時(shí)。(6)每孔加入100 μ I溶解液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫過(guò)夜，使生成的甲臢晶體充分溶解。測(cè)定570nm光吸收值。(7)通過(guò)軟件計(jì)算樣品對(duì)各腫瘤細(xì)胞的IC50。2. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
品名稱(chēng) SKOV3SMMC-7721A549 細(xì)跑;
GS-B-W-I>100 ' >100>100由上表看出GS-B-W-1對(duì)SK0V3、SMMC-7721、A549人腫瘤細(xì)胞株沒(méi)有細(xì)胞毒作用。3) GS-B-W-I的體外免疫實(shí)驗(yàn)(Con A和LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性測(cè)試的研究)3. I動(dòng)物ICR小鼠，雌雄不限。3. 2實(shí)驗(yàn)方法3. 2. I試劑配置L-DMEM完全培養(yǎng)基按常規(guī)方法配置。MTT溶液用PBS配成5mg/mL溶液，4°C保存，兩周內(nèi)有效。Con A :用無(wú)血清L-DMEM培養(yǎng)基配成10ug/mL溶液，O. 22um微孔濾膜過(guò)濾除菌。LPS :用無(wú)血清L-DMEM培養(yǎng)基配成40ug/mL溶液，O. 22um微孔濾膜過(guò)濾除菌。3. 2. 2脾細(xì)胞制備小鼠以頸椎脫位致死，無(wú)菌取脾臟，F(xiàn)icoll分離脾細(xì)胞，以L-DMEM培養(yǎng)液洗三次，計(jì)數(shù)，用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液配成2X IO6ceIlAiL細(xì)胞懸液。3. 2. 3小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將小鼠脾細(xì)胞懸液點(diǎn)于96孔培養(yǎng)板上，每孔IOOuL,設(shè)一個(gè)對(duì)照組，再加入50uL的Con A或LPS (終濃度為2. 5ug/mL或10ug/mL)，最后加入不同量的GS-B-W-I (終濃度為10，50，100ug/mL)，每孔培養(yǎng)液補(bǔ)足為200uL。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于含有5% CO2, 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72h后，加入MTT溶液(5mg/mL)10uL，置于5% C02，37°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出反應(yīng)物，離心(2000rpm，5min)，棄上清，每孔加入150uL DMSO,充分振蕩，待凝塊完全溶解后在酶標(biāo)測(cè)定儀上570nm讀出A值。3. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果在體外對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3，表4。表3、GS-B-W-I體外對(duì)Con A誘導(dǎo)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖的影響樣品濃度(ug/mL)平均值SD (相P
__對(duì)偏差)_
對(duì)照-0_185±0.013
_GS-B-W-I_10_0.254±0.020* 0.019 0.00668*P < O. 05，**P < O. 01，與對(duì)照組相比，*P < O. 05，**P < O. 01。表4、GS-B-W-I體外對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖的影響 樣品 _濃度(ug/mL)__平均值SD (相對(duì)偏差)_P
對(duì)照-0.196±0.014
100.195±0.0220.019 0.92723
GS-B-W-I500.190±0.0180.015 0.63941
1000.257土 0.041__0.037 0.05518表3和表4結(jié)果顯示GS-B-W-I在低濃度下即有顯著的促進(jìn)的T淋巴細(xì)胞增殖活性，而對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)中，GS-B-W-I呈一定的量效關(guān)系；提示GS-B-W-I通過(guò)提高機(jī)體免疫能力達(dá)到抗腫瘤作用。
權(quán)利要求
1.紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖，其特征在于，所述均一多糖的總糖含量為大于95%,優(yōu)選為大于98. 5%;且所述均一多糖的分子量為3000-10000道爾頓，優(yōu)選7762. 23道爾頓。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的均一多糖，其特征在于，所述均一多糖主要由半乳糖和葡萄糖組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的均一多糖，其特征在于，所述半乳糖和葡萄糖的摩爾比為I.8-2. 2 1，優(yōu)選 I. 98 I。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的均一多糖，其特征在于，所述均一多糖是具有分支的(I — 4)-α-葡萄糖和半乳糖的聚糖，其主鏈上聯(lián)有I — 6連接的半乳糖和未知單糖。
5.紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體提取物，其包含權(quán)利要求1-4任一所述的均一多糖，所述均一多糖的總糖含量為大于95%,優(yōu)選為大于98. 5 % ;且所述均一多糖的分子量為3000-10000道爾頓，優(yōu)選為7762. 23道爾頓。
6.權(quán)利要求1-4任一所述的均一多糖的制備方法，其特征在于，包括如下步驟紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體經(jīng)水提醇沉得到粗多糖，粗多糖再經(jīng)超濾、濃縮和柱層析得到均一多糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的均一多糖的制備方法，其特征在于，所述超濾步驟通過(guò)截留分子量為1-5萬(wàn)的超濾膜進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的均一多糖的制備方法，其特征在于，所述超濾步驟通過(guò)截留分子量為3萬(wàn)的超濾膜進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的均一多糖的制備方法，其特征在于，所述超濾膜由聚酰胺、聚醚砜膜或醋酸纖維素制成。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的均一多糖的制備方法，其特征在于，所述濃縮步驟通過(guò)納濾膜進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的均一多糖的制備方法，其特征在于，所述納濾膜的截留分子量為150-300。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的均一多糖的制備方法，其特征在于，所述納濾膜由聚酰胺制成。
13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的均一多糖的制備方法，其特征在于，所述柱層析步驟所用的填料為陰離子交換樹(shù)脂和葡聚糖凝膠。
14.權(quán)利要求1-4任一所述的均一多糖在制備抗腫瘤藥物和提高免疫力藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖，其特征在于，所述均一多糖的總糖含量為大于95％，且所述均一多糖的分子量為3000～10000道爾頓，優(yōu)選7762.23道爾頓。本發(fā)明也公開(kāi)上述均一多糖的制備方法。本方法提供的紫芝液體深層發(fā)酵菌絲體均一多糖的多糖含量更高、給藥劑量更低、純度更高，且其制備工藝亦適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K31/715GK102827298SQ201110156759
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2011年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月13日
發(fā)明者楊義芳, 牛莉鑫, 金雋迪 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院