專利名稱：長春新堿納米靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種長春新堿納米靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體及制備方法，屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
長春新堿為夾竹桃科植物長春花中提取的有效成分?？鼓[瘤作用靶點是微管，主要抑制微管蛋白的聚合而影響紡錘體微管的形成，使有絲分裂停止于中期。還可干擾蛋白質(zhì)代謝及抑制RNA多聚酶的活力，并抑制細胞膜類脂質(zhì)的合成和氨基酸在細胞膜上的轉(zhuǎn)運。長春新堿對急性白血病、急性淋巴細胞白血病、惡性淋巴瘤、生殖細胞腫瘤、小細胞肺癌、尤文肉瘤、腎母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病、消化道癌、黑色素瘤及多發(fā)性骨髓瘤等療效顯著。長春新堿雖然抗腫瘤作用良好，但毒副作用大，主要是神經(jīng)毒性，因而極大的限制了其臨床應(yīng)用。長春新堿脂質(zhì)體為現(xiàn)在的熱點研究方向，用來降低長春新堿的神經(jīng)毒性。脂質(zhì)體是目前降低藥物毒性常見的制劑手段之一，但是以傳統(tǒng)的卵磷脂、膽固醇制備的常規(guī)脂質(zhì)體在體內(nèi)多被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system,RES)吞噬，在血液循環(huán)中駐留時間較短。并且其物理化學穩(wěn)定性差，儲存和應(yīng)用過程中容易發(fā)生融合聚集，包封藥物容易泄漏；官能團少，不易進行多功能化修飾等。近年來，開發(fā)新型脂質(zhì)體的研究受到廣泛關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于長春新堿在腫瘤治療上的存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種長春新堿納米靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體及其制備方法。這種高分子脂質(zhì)體表面含有聚乙二醇及葉酸， 聚乙二醇可減少脂質(zhì)體被人體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕捉，使其具有體內(nèi)長循環(huán)性能；由于在多種腫瘤細胞(如卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、腎細胞癌等)膜表面葉酸受體高度表達，故制備的表面富含葉酸的高分子脂質(zhì)體具有腫瘤靶向性能；制備的高分子脂質(zhì)體緩釋時間長，載藥率高，穩(wěn)定性好，可提高藥物的利用效率，降低由于藥物突釋造成的毒性；同時由于這種高分子脂質(zhì)體粒徑小，具有穿過靶組織內(nèi)皮細胞的能力，可以被腫瘤細胞攝取進入細胞內(nèi)，將所包含的長春新堿在細胞內(nèi)釋放，從而大大提高藥物的利用效率。本發(fā)明利用分別經(jīng)聚乙二醇(PEG)和葉酸(FA)修飾的雙親性殼聚糖衍生物賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(0QLCQ與膽固醇通過反相蒸發(fā)法或薄膜分散法制備出一種長春新堿納米靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體。如圖2的粒徑分析測試結(jié)果所示，其有效粒徑在50 200nm之間。如圖1透射圖片所示，其粒徑均勻，分散性好，很少發(fā)生團聚現(xiàn)象。具體技術(shù)方案如下本發(fā)明的一種長春新堿納米靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體，其所使用雙親性高分子為聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(PEG-0QLCQ和葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(FA-OQLCS)，其粒徑在50 200nm之間，粒徑均勻，表面含有聚乙二醇及葉
3酸修飾。本發(fā)明的長春新堿納米靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法，其原料質(zhì)量份數(shù)比配比為葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽FA-OQLCS 聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽PEG-0QLCS 長春新堿=1 1 2 0. 5 1 ;FA-0QLCS與 PEG-0QLCS總量膽固醇=4 2 1 ；采用反相蒸發(fā)法時，制備步驟如下a.將長春新堿溶于蒸餾水中，形成水相，待用；b.將聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽、葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽、膽固醇，溶于二氯甲烷中，形成油相，油相與步驟a)中水相體積比為 1 2 3 ；c.將水相在50 200w功率范圍下進行超聲，加入油相，超聲形成水油均勻的分散乳液；d.將步驟c)乳液在30 50°C下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行旋蒸，同時向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入氮氣流加以保護，當有機溶劑完全揮發(fā)后，即得到高分子脂質(zhì)體。本發(fā)明可以將反相蒸發(fā)法改用薄膜分散法時，制備步驟如下a.將聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽、葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽和膽固醇溶于二氯甲烷中；b.將步驟a)混合物置于反應(yīng)器中，在30 50°C下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行旋蒸，同時向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入氮氣流加以保護，使反應(yīng)器中的有機溶劑完全揮發(fā)；c.將長春新堿溶于蒸餾水中，加入步驟b)的反應(yīng)器中，將脂質(zhì)膜水化，然后用超聲波清洗器進行超聲分散，即得到高分子脂質(zhì)體。上述的FA-OQLCS和PEG-0QLCS可以采用任何方法制備的都可以，也可以采用市售的，也可以采用如下方法制備本發(fā)明所述的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(0QLCQ按照常津等提供的方法(申請(專利)號200710056993.4)進行制備。將十八烷基二甲基叔胺12g置四口瓶中，加入 60mL溶劑，劇烈攪拌，升溫至55攝氏度，緩慢滴加環(huán)氧氯丙烷5. 5g，保溫回流數(shù)小時，減壓蒸餾除去未反應(yīng)的環(huán)氧氯丙烷及溶劑，得淺黃色膏狀物二甲基環(huán)氧丙基十八烷基氯化銨。 取水溶性賴氨酸殼聚糖(粘均分子量10萬，脫乙酰度80%)3. Og溶于濃度為42% (w/v)的氫氧化鈉溶液IOOmL中，攪拌均勻后，加入異丙醇50mL，緩慢分批加入二甲基環(huán)氧丙基十八烷基氯化銨0. lmol，控制溫度在80攝氏度-85攝氏度，攪拌48h。鹽酸調(diào)pH= 7，無水丙酮洗滌，真空烘干得雙親性賴氨酸殼聚糖十八烷基氯化銨。所述的PEG-0QLCS，其制備過程中，各組分的含量為OQLCS 0. 3 0. 5g ；單羧基化聚乙二醇QOOODa) 0. 2 l.Og ；乙基_ (3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸(EDC) 1 3g ；N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)O. 6 2. Ogo其制備過程如下稱取OQLCS 0. 3 0. 5g溶于IOmL 蒸餾水中，待用；稱取單羧基化聚乙二醇0. 2 1. Og溶于IOmL蒸餾水中，稱取EDC 1 3g 加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，隨后稱取NHS 0. 6 2. Og加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，10 40min后將上述溶液加入到OQLCS水溶液中，反應(yīng)12 Mh，反應(yīng)結(jié)束后，用 8000-14000的透析袋透析1-7天，凍干即得PEG-0QLCS。
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所述的FA-0QLCS，其制備過程中，各組分的含量為=OQLCS 0. 3 0. 5g ；葉酸 0. 2 1. Og ；三乙胺1 5mL ；乙基_ (3- 二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸(EDC) 1 3g ；N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)O. 6 2. Og ；二甲基亞砜(DMSO) 110 200mL。其制備過程如下將葉酸溶于60 IOOmLDMSO中，向其加入1 5mL三乙胺，將1 3g EDC與0. 6 2. Og NHS 用少量的DMSO使其溶解后加入到上述反應(yīng)體系中避光反應(yīng)12 Mh以上。將產(chǎn)物過濾， 得到黃色固體NHS-FA活性脂。取NHS-FA活性脂溶于50 80mLDMS0中，加入0. 3 0. 5g OQLCS0用Na2HPO4與NaOH緩沖溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH = 10，反應(yīng)1 1.證。反應(yīng)結(jié)束后，用8000-14000的透析袋透析1-7天，凍干即得FA-0QLCS。本發(fā)明的有益效果整個制備過程簡單快捷，制備周期短，產(chǎn)率高。所制備的長春新堿納米靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體的性能包括有效粒徑大小在50 200nm之間，粒徑均勻；載藥能力強，制備的高分子脂質(zhì)體載藥率高達8-10% ；穩(wěn)定性好，可在水溶液中保存至少2個月；緩釋性能明顯，緩釋時間可調(diào)。本發(fā)明所提供的脂質(zhì)體(反相蒸發(fā)法)主要質(zhì)量指標如下表
具體指標高分子脂質(zhì)體傳統(tǒng)脂質(zhì)體
有效粒徑50nm 200nm約500nm
載藥率高達8-10%<8% 緩釋時間高達15天<15天
功能化長循環(huán)、腫瘤靶向無
穩(wěn)定性可在水溶液中保存2個月易發(fā)生融合聚集


圖1 實施例4中制備的長春新堿納米靶向緩釋脂質(zhì)體透射照片；圖2 實施例9中制備的長春新堿納米靶向緩釋脂質(zhì)體粒度分析圖。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。實施例1PEG-0QLCS制備過程。稱取OQLCS 0. 3g溶于IOmL蒸餾水中，待用；稱取單羧基化聚乙二醇0. 2g溶于IOmL蒸餾水中，稱取EDC Ig加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，隨后稱取NHS 0. 6g加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，IOmin后將上述溶液加入到OQLCS水溶液中，反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后，用8000-14000的透析袋透析1天，凍干即得PEG-0QLCS。FA-OQLCS制備過程。將葉酸溶于60mLDMS0中，向其加入ImL三乙胺，將Ig EDC與
50.6g NHS用少量的DMSO使其溶解后加入到上述反應(yīng)體系中避光反應(yīng)12h。將產(chǎn)物過濾， 得到黃色固體NHS-FA活性脂。取NHS-FA活性脂溶于50mLDMS0中，加入0. 3g OQLCS0用 Na2HPO4與NaOH緩沖溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH= 10，反應(yīng)Ih。反應(yīng)結(jié)束后，用8000-14000的透析袋透析1天，凍干即得FA-OQLCS。實施例2PEG-0QLCS制備過程。稱取OQLCS 0. 4g溶于IOmL蒸餾水中，待用；稱取單羧基化聚乙二醇0. 6g溶于IOmL蒸餾水中，稱取EDC 2g加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，隨后稱取NHS 1. 3g加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，25min后將上述溶液加入到OQLCS水溶液中，反應(yīng)18h，反應(yīng)結(jié)束后，用8000-14000的透析袋透析4天，凍干即得PEG-0QLCS。FA-OQLCS制備過程。將葉酸溶于80mLDMS0中，向其加入3mL三乙胺，將2g EDC與
1.3g NHS用少量的DMSO使其溶解后加入到上述反應(yīng)體系中避光反應(yīng)18h以上。將產(chǎn)物過濾，得到黃色固體NHS-FA活性脂。取NHS-FA活性脂溶于65mLDMS0中，加入0. 4gOQLCS。用 Na2HPO4與NaOH緩沖溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH = 10，反應(yīng)1. 25h。反應(yīng)結(jié)束后，用8000-14000 的透析袋透析4天，凍干即得FA-0QLCS。實施例3PEG-0QLCS制備過程。稱取OQLCS 0. 5g溶于IOmL蒸餾水中，待用；稱取單羧基化聚乙二醇l.Og溶于IOmL蒸餾水中，稱取EDC 3g加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，隨后稱取NHS 2. Og加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，40min后將上述溶液加入到OQLCS水溶液中，反應(yīng)Mh，反應(yīng)結(jié)束后，用8000-14000的透析袋透析7天，凍干即得PEG-0QLCS。FA-OQLCS制備過程。將葉酸溶于IOOmLDMSO中，向其加入5mL三乙胺，將3g EDC與
2.Og NHS用少量的DMSO使其溶解后加入到上述反應(yīng)體系中避光反應(yīng)Mh以上。將產(chǎn)物過濾，得到黃色固體NHS-FA活性脂。取NHS-FA活性脂溶于80mLDMS0中，加入0. 5g0QLCS。用 Na2HPO4與NaOH緩沖溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH = 10，反應(yīng)1.證。反應(yīng)結(jié)束后，用8000-14000 的透析袋透析7天，凍干即得FA-0QLCS。實施例4反相蒸發(fā)法。稱取2. 5mg長春新堿，溶于4. 5mL的蒸餾水中，形成水相；稱取 5mgPEG-0QLCS，5mgFA-0QLCS、2. 5mg膽固醇，溶于2mL二氯甲烷中形成油相，將油相在50W功率下進行超聲，加入水相，超聲形成水油均勻的分散體系。將上述乳液在30°C下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行旋蒸，同時向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。當反應(yīng)器中的有機溶劑完全揮發(fā)后，即得到產(chǎn)品。制備的長春新堿靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體有效粒徑為97. 8nm, 分散性好；表面含有聚乙二醇和葉酸，具有長循環(huán)性及腫瘤靶向性；載藥率為8. 7% ；體外緩釋時間達到12天；穩(wěn)定性好，可在水溶液中保存至少2個月。實施例5反相蒸發(fā)法。稱取7mg長春新堿，溶于15mL的蒸餾水中，形成水相；稱取 15mgPEG-0QLCS, 1 OmgFA-OQLCS, IOmg膽固醇，溶于5mL 二氯甲烷中形成油相，將油相在100W 功率下進行超聲，加入水相，超聲形成水油均勻的分散體系。將上述乳液在35°C下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行旋蒸，同時向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。當反應(yīng)器中的有機溶劑完全揮發(fā)后，即得到產(chǎn)品。制備的長春新堿靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體有效粒徑為117. 7·，分散性好；表面含有聚乙二醇和葉酸，具有長循環(huán)性及腫瘤靶向性；載藥率為9. 1% ；體外緩釋時間達到15天；穩(wěn)定性好，可在水溶液中保存至少2個月。實施例6反相蒸發(fā)法。稱取IOmg長春新堿，溶于20mL的蒸餾水中，形成水相；稱取 20mgPEG-0QLCS, 1 OmgFA-OQLCS、15mg膽固醇，溶于IOmL 二氯甲烷中形成油相，將油相在 200W功率下進行超聲，加入水相，超聲形成水油均勻的分散體系。將上述乳液在50°C下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行旋蒸，同時向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。當反應(yīng)器中的有機溶劑完全揮發(fā)后，即得到產(chǎn)品。制備的長春新堿靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體有效粒徑為100. 3·，分散性好；表面含有聚乙二醇和葉酸，具有長循環(huán)性及腫瘤靶向性；載藥率為 9. 4% ；體外緩釋時間達到17天；穩(wěn)定性好，可在水溶液中保存至少2個月。實施例7薄膜分散法。稱取1 OmgPEG-OQLCS，IOmg FA-OQLCS, 5mg膽固醇，溶于5mL 二氯甲烷中。稱取5mg長春新堿溶于5mL水中，待用。將該混合物置于茄形瓶中，在30°C下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行旋蒸，同時向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。使茄形瓶中的有機溶劑完全揮發(fā)。之后將茄形瓶取下，向茄形瓶中加入長春新堿水溶液，將脂質(zhì)膜水化，然后用超聲波清洗器以50W的功率進行超聲分散，直至形成半透明乳液，即得到高分子脂質(zhì)體溶液。制備的長春新堿靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體有效粒徑為93. 3nm，分散性好；表面含有聚乙二醇和葉酸，具有長循環(huán)性及腫瘤靶向性；載藥率為8. 3% ；體外緩釋時間達到10 天；穩(wěn)定性好，可在水溶液中保存至少2個月。實施例8薄膜分散法。稱取langPEG-OQLCS，8mg FA-OQLCS, 7mg膽固醇，溶于6mL 二氯甲烷中。稱取5mg長春新堿溶于4mL水中，待用。將該混合物置于茄形瓶中，在40°C下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行旋蒸，同時向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。使茄形瓶中的有機溶劑完全揮發(fā)。之后將茄形瓶取下，向茄形瓶中加入長春新堿水溶液，將脂質(zhì)膜水化，然后用超聲波清洗器以200W的功率進行超聲分散，直至形成半透明乳液，即得到高分子脂質(zhì)體溶液。制備的長春新堿靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體有效粒徑為97. 8nm，分散性好；表面含有聚乙二醇和葉酸，具有長循環(huán)性及腫瘤靶向性；載藥率為9. 3% ；體外緩釋時間達到12天； 穩(wěn)定性好，可在水溶液中保存至少2個月。實施例9薄膜分散法。稱取1 OmgPEG-OQLCS，5mg FA-OQLCS, 7. 5mg 膽固醇，溶于 3mL 二氯甲烷中。稱取5mg長春新堿溶于6mL水中，待用。將該混合物置于茄形瓶中，在50°C下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行旋蒸，同時向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。使茄形瓶中的有機溶劑完全揮發(fā)。之后將茄形瓶取下，向茄形瓶中加入長春新堿水溶液，將脂質(zhì)膜水化， 然后用超聲波清洗器以100W的功率進行超聲分散，直至形成半透明乳液，即得到高分子脂質(zhì)體溶液。制備的長春新堿靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體有效粒徑為105. 7nm，分散性好；表面含有聚乙二醇和葉酸，具有長循環(huán)性及腫瘤靶向性；載藥率為9. 7% ；體外緩釋時間達到16 天；穩(wěn)定性好，可在水溶液中保存至少2個月。
權(quán)利要求
1.長春新堿納米靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體，其特征其粒徑在50 200nm之間，表面含有聚乙二醇及葉酸修飾。
2.權(quán)利要求1的長春新堿納米靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法，其原料質(zhì)量份數(shù)比配比為葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽FA-OQLCS 聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽PEG-0QLCS 長春新堿=1 1 2 0. 5 1 ；FA-0QLCS與 PEG-0QLCS總量膽固醇=4 2 1 ；采用反相蒸發(fā)法時，制備步驟如下a.將長春新堿溶于蒸餾水中，形成水相，待用；b.將聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽、葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽、膽固醇，溶于二氯甲烷中，形成油相，油相與步驟a)中水相體積比為1 2 3;c.將水相在50 200w功率范圍下進行超聲，加入油相，超聲形成水油均勻的分散乳液；d.將步驟c)乳液在30 50°C下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行旋蒸，同時向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入氮氣流加以保護，當有機溶劑完全揮發(fā)后，即得到高分子脂質(zhì)體。
3.如權(quán)利要求2的所述的制備方法，其特征是所述的反相蒸發(fā)法改用薄膜分散法時， 制備步驟如下a.將聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽、葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽和膽固醇溶于二氯甲烷中；b.將步驟a)混合物置于反應(yīng)器中，在30 50°C下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行旋蒸，同時向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入氮氣流加以保護，使反應(yīng)器中的有機溶劑完全揮發(fā)；c.將長春新堿溶于蒸餾水中，加入步驟b)的反應(yīng)器中，將脂質(zhì)膜水化，然后用超聲波清洗器進行超聲分散，即得到高分子脂質(zhì)體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種長春新堿納米靶向緩釋長循環(huán)脂質(zhì)體及制備方法。脂質(zhì)體粒徑在50～200nm之間，其粒徑均勻，表面富含聚乙二醇和葉酸。原料質(zhì)量份數(shù)比配比為葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(FA-OQLCS)∶聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(PEG-OQLCS)∶長春新堿＝1∶1～2∶0.5～1；FA-OQLCS與PEG-OQLCS總量∶膽固醇＝4～2∶1；采用反相蒸發(fā)法或薄膜分散法制備；整個制備過程簡單快捷，制備周期短，制備的高分子脂質(zhì)體載藥率可高達9.7％；通過表面聚乙二醇修飾，可使高分子脂質(zhì)體不易被人體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕捉，延長在體內(nèi)的循環(huán)時間，通過葉酸修飾，可使高分子脂質(zhì)體具有腫瘤靶向性。
文檔編號A61K31/475GK102225053SQ201110161829
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者常津, 康世胤, 王漢杰, 王生, 蘇文雅 申請人:天津大學