專利名稱：一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性多發(fā)腫瘤之一，治療手段之ー是通過飲食調(diào)節(jié)。大約25個(gè)世紀(jì)以前，醫(yī)學(xué)之父希波克拉底就說過“食品即藥品，藥品即食品”，已經(jīng)掲示了飲食和健康之間的密切關(guān)系。據(jù)目前我們所知，可以通過飲食調(diào)節(jié)來預(yù)防35%的癌癥。現(xiàn)代研究表明，天然蔬菜水果中的植物素可以起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，同時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明蔬菜水果的抗增殖作用要強(qiáng)于單一的植物素。分析原因，植物素之間可能存在的協(xié)同或疊加作用可以解釋為什么単一植物素通常不能代替整個(gè)食物的作用。協(xié)同治療作用是指兩種或以上化合物聯(lián)合使用與相同濃度下単一使用相比獲得更強(qiáng)的作用。化合物之間的這種協(xié)同作用在臨床領(lǐng) 域具有重大意義，其意味著在達(dá)到相同效果的前提下，降低単一化合物的用量，也即意味著降低単一化合物可能存在的對宿主細(xì)胞的毒性。因此探索天然植物素之間的協(xié)同作用可以為臨床治療某些疾病提供新的思路。黃酮類化合物是ー類廣泛存在于水果蔬菜中的成分，早在其被分離出之前人們就已經(jīng)知道這類化合物的功效。黃酮類化合物具有抗氧化、抗心血管疾病、保肝護(hù)肝等方面的作用。槲皮素和白藜蘆醇均屬于黃酮類化合物。槲皮素主要存在于綠茶、洋蔥、蘋果中，具有抗心血管疾病、抗氧化、抗凋亡作用，同時(shí)具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的潛力。白藜蘆醇主要存在于紅葡萄和紅酒中，具有抗心血管疾病、抗氧化、抗凋亡作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的組合物，由槲皮素和白藜蘆醇組成。其中，所述槲皮素和白藜蘆醇的摩爾比為兩者單獨(dú)使用時(shí)各自對腫瘤細(xì)胞的半數(shù)有效濃度EC50的比值。以乳腺癌細(xì)胞為例，組合物中的槲皮素和白藜蘆醇的摩爾比為I : (2-9)，優(yōu)選摩爾比為I (3-7)。本發(fā)明所提供的組合物的應(yīng)用主要是在制備下述產(chǎn)品中的應(yīng)用1)真核生物腫瘤細(xì)胞増殖抑制劑；2)預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物；3)保健品；4)食品，;5)營養(yǎng)素補(bǔ)充劑。其中，所述真核生物為人或哺乳動(dòng)物；所述腫瘤細(xì)胞為癌細(xì)胞，所述癌細(xì)胞優(yōu)選為乳腺癌細(xì)胞，如人乳腺癌細(xì)胞MCF-7或MDA-MB-231。所述腫瘤為癌，所述癌優(yōu)選為乳腺癌。本發(fā)明組合物也可用作某些食品或藥物的添加劑或營養(yǎng)補(bǔ)充劑加入到產(chǎn)品中，例如餅干、糖果、飲料、粥等普通食品，保健食品，特殊營養(yǎng)食品，營養(yǎng)素補(bǔ)充劑，藥品等。本發(fā)明的再ー個(gè)目的是提供一種真核生物腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑。本發(fā)明所提供的真核生物腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑，其活性成分為本發(fā)明所述的槲皮素和白藜蘆醇組合物。所述真核生物為人或哺乳動(dòng)物；所述腫瘤細(xì)胞為癌細(xì)胞，所述癌細(xì)胞優(yōu)選為乳腺癌細(xì)胞，如人乳腺癌細(xì)胞MCF-7或MDA-MB-231。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物或保健品。本發(fā)明所提供的藥物或保健品，其活性成分為本發(fā)明所述的槲皮素和白藜蘆醇組合物。所述藥物或保健品中所述活性成分的質(zhì)量含量為0. 01-10%,優(yōu)選2-5%。需要的時(shí)候，在上述藥物或保健品中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合剤、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性剤、吸附載體、潤滑劑等，也可加入其它輔助劑如香味劑、甜味劑等。 以槲皮素和白藜蘆醇的組合物為活性成分制備的藥物或保健品可以制成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、ロ服液等多種形式，優(yōu)選制成靜脈注射劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。本發(fā)明提供的槲皮素和白藜蘆醇組合物的特點(diǎn)是在使用濃度內(nèi)能抑制腫瘤細(xì)胞増殖卻對腫瘤細(xì)胞沒有毒性。由槲皮素和白藜蘆醇組成的組合物，抗腫瘤増殖作用相比于單ー槲皮素和白藜蘆醇顯著增強(qiáng)。聯(lián)合指數(shù)Cl < 1，表明二者之間有協(xié)同作用。在達(dá)到相同效果時(shí)，組合物中單成分使用濃度降低，即意味著降低對宿主正常細(xì)胞可能存在的潛在毒性。


圖I為槲皮素、白藜蘆醇和槲皮素白藜蘆醇組合物對MCF-7的細(xì)胞毒性。圖2為槲皮素、白藜蘆醇和槲皮素白藜蘆醇組合物抑制MCF-7細(xì)胞増殖作用；圖中的*表示P < 0. 05, **表示P < 0. 01,林*表示P < 0. 01 ;槲皮素白藜蘆醇組合物的濃度以其中槲皮素濃度表示。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所用的乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。實(shí)施例I槲皮素和白藜蘆醇對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的細(xì)胞毒性將MCF-7細(xì)胞以4 X IO4/孔的濃度接種96孔板，置于5 % C02/37 V培養(yǎng)箱孵育24小吋。用系列濃度的槲皮素溶液(0，10，20，40，60，80，1001^)、白藜蘆醇溶液(0，20，40，80，120，160，200 ii M)、槲皮素和白藜蘆醇組合物溶液(0+0 u M，2. 75+9. 63 u M，
5.50+19. 25 PM, 11. 00+38. 50 u M, 16. 50+57. 75 u M, 22. 00+77. 00 u M, 27. 50+96. 25 u M)或空白對照分別處理24小吋。去除培養(yǎng)基，每孔加入50ul亞甲基藍(lán)染色固定I小時(shí)，去除染色液，在去離子水中浸洗幾次，直至去離子水中不再顯示藍(lán)色。每孔加入IOOul洗脫液(PBS+50%こ醇+1 %冰醋酸)，室溫?fù)u床脫色20分鐘，用MRXMicroplate Reader在570nm讀取吸收光。每個(gè)樣品的每個(gè)濃度均有3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土SD)表
/Jn o 對于MDA-MB-231細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)方法與MCF-7相同。結(jié)果見圖1，數(shù)據(jù)表明槲皮素、白藜蘆醇以及槲皮素白藜蘆醇組合物與空白對照相比在MCF-7和MDA-MB-231兩個(gè)細(xì)胞系上各個(gè)檢測濃度均沒有細(xì)胞毒性。實(shí)施例2槲皮素和白藜蘆醇組合物抑制MCF-7和MDA_MB_231細(xì)胞增殖將MCF-7細(xì)胞以2. 5X IO4/孔的濃度接種96孔板，置于5% C02/37°C培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)。用系列濃度的槲皮素(0，10，20，40，60，80，IOOii M)、白藜蘆醇(0,20,40,80,120，160，200 ii M)、槲皮素和白藜蘆醇組合物(0+0 u M, 2. 75+9. 63 u M, 5. 50+19. 25 u M,
11.00+38. 50 u M, 16. 50+57. 75 u M, 22. 00+77. 00 u M, 27. 50+96. 25 u M)或空白對照分別處理72小吋。去除培養(yǎng)基，每孔加入50ul亞甲基藍(lán)溶液染色固定I小時(shí)，去除染色液，在去離子水中浸洗幾次，直至去離子水中不再顯示藍(lán)色。每孔加入IOOul洗脫液(PBS+50%こ醇+1 %冰醋酸)，室溫?fù)u床脫色20分鐘，用MRX Microplate Reader在570nm讀取吸收光。每個(gè)樣品的每個(gè)濃度均有3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土SD)表示，采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)后，再進(jìn)行兩兩比較t檢驗(yàn)。結(jié)果見圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明槲皮素和白藜蘆醇對MCF-7均有抑制増殖作用，且二者的作用都是劑量依賴性的。根據(jù)二者的量效曲線求得二者的EC50分別是41. 0±3. 6 PM和147. 7±4. 7iiM。 依據(jù) 0. 0625*EC50、0. 125*EC50、0. 25*EC50、0. 375*EC50、0. 5*EC50、
0.625*EC50的原則確定二者組成組合物的濃度，分別為0+0 u M，2. 75+9. 63 u M，5. 50+19. 25uM,ll. 00+38. 50 u M, 16. 50+57. 75 u M, 22. 00+77. 00 u M, 27. 50+96. 25 u M。利用聯(lián)合指數(shù)(Cl)分析藥物之間的相互作用(參考文獻(xiàn)(l)Chou, T-C. The median-effectprinciple and the combination index for quantitation 01 synergism andantagonism. In T, -C Chouand D.C.Rideout (Eds), Synergism and Antagonism inChemotherapy，1991， pp.61-102， Academic Press， Orlando， FL (2)Chou, T-C. ;Motzer，R. J. ；Tong, Y. Z. ;Bos_l，G. J. Computerized quantitation of synergism and antagonismof taxol, topotecan， and cisplatin against human teratocarcinoma cell growth a rational approach to clinical protocol design. J. Natl. Cancer Inst. 1994,86,1517-1524.)。c/^+^h其中，(D)jP (D)2是指槲皮素白藜蘆醇聯(lián)合使用使生長抑制率達(dá)X時(shí)組合物中槲皮素和白藜蘆醇分別的濃度，(Dx)1, (Dx)2是指槲皮素和白藜蘆醇單獨(dú)使用槲皮素和白藜蘆醇各自的濃度。當(dāng)Cl < 1，表示二者有協(xié)同作用；CI = 1，表示二者有相加作用；CI > 1，表示兩者有拮抗作用。DRI指數(shù)表示達(dá)到同等效果時(shí)，合用劑量比単獨(dú)使用劑量減少的指數(shù)。降低劑量即意味著降低對宿主的毒性，所以DRI指數(shù)在臨床上意義非常重大。槲皮素和白藜蘆醇組合物以劑量依賴方式抑制MCF-7増殖。根據(jù)劑量依賴曲線求得組合物中槲皮素和白藜蘆醇的EC50分別是9. 9±0. 6iiM和68. 2 ±3. 8 y M，與單ー化合物相比分別降低了 3. I和I. 2倍。根據(jù)槲皮素、白藜蘆醇和槲皮素白藜蘆醇組合物三者的抑制MCF-7量效關(guān)系曲線計(jì)算出槲皮素、白藜蘆醇的聯(lián)合指數(shù)(Cl)，且Cl< 1，表示槲皮素和白藜蘆醇之間有協(xié)同作用。根據(jù)上述參考文獻(xiàn)，計(jì)算DRI指數(shù)，數(shù)據(jù)見表3，表明槲皮素白藜蘆醇組合物的使用劑量與單個(gè)槲皮素和白藜蘆醇的使用劑量相比，在各個(gè)抑制率都有明顯降低。對于MDA-MB-231細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)方法MCF-7相同，結(jié)果相似。表I、槲皮素、白藜蘆醇及其組合物對MCF-7的EC50
權(quán)利要求
1.ー種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的組合物，由槲皮素和白藜蘆醇組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于所述槲皮素和白藜蘆醇的摩爾比為兩者単獨(dú)使用時(shí)各自對腫瘤細(xì)胞的半數(shù)有效濃度EC50的比值。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于所述癌細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞，優(yōu)選人乳腺癌細(xì)胞MCF-7或MDA-MB-231 ;所述組合物中的槲皮素和白藜蘆醇的摩爾比為I : (2_9)，優(yōu)選摩爾比為I (3-7)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的組合物在制備下述產(chǎn)品中的應(yīng)用1)真核生物腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑；2)預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物；3)保健品；4)食品；5)營養(yǎng)素補(bǔ)充劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述真核生物為人或哺乳動(dòng)物，所述腫瘤細(xì)胞為癌細(xì)胞，所述癌細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞，優(yōu)選人乳腺癌細(xì)胞MCF-7或MDA-MB-231 ;所述腫瘤為癌，所述癌為乳腺癌。
6.一種真核生物腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑,其活性成分為權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)所述的組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的腫瘤細(xì)胞増殖抑制劑，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為癌細(xì)胞，所述癌細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞，優(yōu)選人乳腺癌細(xì)胞MCF-7或MDA-MB-231。
8.一種預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物或保健品，其活性成分為權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)所述的組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物或保健品，其特征在于所述真核生物為人或哺乳動(dòng)物，所述藥物或保健品中所述活性成分的質(zhì)量含量為0. 01-10%,優(yōu)選2-5%。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的藥物或保健品，其特征在于所述藥物或保健品中還包括藥學(xué)上可接受的載體；所述藥物的劑型為注射制劑或ロ服制劑，優(yōu)選注射制劑，尤其是靜脈注射制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的組合物及其應(yīng)用。該組合物由槲皮素和白藜蘆醇組成；其中，槲皮素和白藜蘆醇的摩爾比為與單用槲皮素和白藜蘆醇各自的半效濃度(EC50)的比值相關(guān)。本發(fā)明組合物可用于制備下述任意一種產(chǎn)品1)真核生物腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑；2)預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物；3)保健品；4)食品；5)營養(yǎng)素補(bǔ)充劑。試驗(yàn)表明，該組合物抗腫瘤增殖作用相比于單一槲皮素和白藜蘆醇顯著增強(qiáng)。聯(lián)合指數(shù)CI＜1，表明二者之間有協(xié)同作用。在達(dá)到相同效果時(shí)，組合物中單成分使用濃度降低，即意味著降低對宿主正常細(xì)胞可能存在的潛在毒性。
文檔編號A61P35/00GK102836149SQ20111016896
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月22日
發(fā)明者楊真威 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所