專利名稱：流感口服緩釋疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地是涉及一種包括全病毒滅活苗、裂解苗和亞單位苗在內(nèi)的流感口服緩釋疫苗及其的制備方法。本發(fā)明是中國專利申請200910103512X的分案申請。
背景技術(shù)：
流行性感冒簡稱流感，是由甲、乙、丙三個型的流感病毒(influenza virus)分別引起的急性呼吸道傳染病。甲型流感的流行通常會引起世界性的流感大流行，并能在家畜和家禽中引起流感流行；乙型常會引起流感局部爆發(fā)，但不引起世界性流感大流行；丙型以散發(fā)病例形式出現(xiàn)，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行。流感在流行病學上的特點是突然爆發(fā)，迅速蔓延，波及面廣，發(fā)病率高，在年邁體衰和慢性病患者中死亡率較高。其流行具有一定的季節(jié)性，在溫、寒帶地區(qū)，通常在冬春季流行，但在熱帶和亞熱帶地區(qū)，則任何季節(jié)都可流行。流感患者是流感的主要傳染源，人感染后的潛伏期為1 3天，從潛伏期末到發(fā)病的急性期(約7天)都有傳染性。嬰幼兒和年老者常易從單純型轉(zhuǎn)為肺炎型，少數(shù)則損害全身血液系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，出現(xiàn)腦炎癥狀而呈中毒型。近百年已經(jīng)出現(xiàn)了 5次世界性流感大流行，給人類造成了大量人員死亡與財產(chǎn)損失。流感病毒屬于正粘病毒科，包括甲、乙、丙和動物的甲和丙型。流感病毒核衣殼為螺旋對稱，包膜含有血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，HA具有粘附和融合功能；核酸為單負鏈RNA，分8個節(jié)段；分節(jié)段基因組的易變性與疾病流行有關(guān)；血凝抑制抗體為中和抗體，具有保護作用。世界上幾乎所有的國家都在接種流感疫苗，但接種策略和接種率有很大差異。從最近發(fā)表的四個國家流感疫苗使用報告中看，目前流感疫苗接種率在美國最高，每1，000 人中有270人使用，接種率27%。歐洲國家接種率在7. 8%-17. 7%不等。我國流感疫苗接種率平均不到1%。亞洲的日本、韓國、新加坡和我國的臺灣和香港地區(qū)，流感疫苗接種率也普遍高于我們。目前中國的流感疫苗生產(chǎn)能力還遠遠低于預(yù)防大流行的需求。要預(yù)防大流行，國人的流感疫苗接種水平至少應(yīng)該達到或超過目前發(fā)達國家的接種水平，即30%以上的接種率，對流感疫苗的需求應(yīng)該達到4億人份左右。但是，根據(jù)2006年SFDA等機構(gòu)對中國流感疫苗生產(chǎn)企業(yè)的調(diào)查，總體生產(chǎn)能力為4500萬人份左右。而實際每年生產(chǎn)2000萬人份左右。加上進口 2000萬人份，中國每年接種也就在4000萬人左右，不到總?cè)丝诘?%。 為此，提高流感疫苗的年生產(chǎn)量，開發(fā)低成本、使用方便且保存運輸方便的流感疫苗是十分重要的。我國用于預(yù)防流感的三種疫苗均為滅活疫苗，均含有流行的甲1、甲3及乙型3種流感病毒抗原成分。三種滅活疫苗分別為全病毒滅活苗、裂解疫苗和亞單位疫苗，這三種疫苗均為注射針劑型，對預(yù)防流感有一定局限性，因為其誘發(fā)的血液中的抗體水平很高，但流感病毒首先感染上呼吸道的上皮細胞，這才是需要的第一道免疫防御門戶?，F(xiàn)行的疫苗不能在此粘膜表面激發(fā)分泌型抗體(SlgA)或感染恢復所需要的細胞介導免疫應(yīng)答，這是宿主對感染的典型應(yīng)答，理想的疫苗應(yīng)當激發(fā)這種免疫應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種覆蓋人群廣、免疫效率高、生產(chǎn)成本較低、保存運輸方便、無需專業(yè)人員就可進行接種，且流感病毒免疫原可以在不同時間被釋放，接種于不同粘膜部位的流感口服緩釋疫苗制劑。本發(fā)明的另一個目的是提供一種可大量生產(chǎn)制備高效且低成本的口服流感緩釋疫苗的制備方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的第一個目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是，該疫苗包括疫苗核心以及包覆于疫苗核心外的包衣，所述疫苗核心包含有流感免疫抗原、保護劑以及賦形劑。通過將包含有流感免疫抗原及其佐劑的疫苗核心用包衣材料包衣后，口服一段時間后，包衣破裂，引起活性物質(zhì)從疫苗核心中釋放，可延遲疫苗有效成分的釋放，例如在胃或消化道中接種。將包衣后的制劑與未包衣的可立即釋放制劑混合于一粒膠囊中，則可造成流感病毒免疫原在不同時間被釋放，接種于不同粘膜部位。進一步設(shè)置是還包含有膠囊，該膠囊內(nèi)包含有包衣后的疫苗核心和未包衣的可立即釋放的疫苗核心。通過本設(shè)置可使流感病毒免疫抗原在不同時間被釋放，接種于不同粘膜部位。進一步設(shè)置是所述的流感免疫抗原為流感全病毒滅活液、流感病毒裂解液、提取的流感病毒亞單位抗原三種中的一種或其組合。通過本設(shè)置選用不同類型流感免疫抗原及其組合以適應(yīng)不同的接種群體，提高了本疫苗的覆蓋群體面積。進一步設(shè)置是該口服含片疫苗含抗酸劑。抗酸劑溶于唾液并吞下時，可提高胃內(nèi)含物PH，使疫苗抗原在胃內(nèi)基本上不降解，保證流感疫苗抗原成分被咽下后仍能通過消化道和胃粘膜刺激免疫應(yīng)答。適用于本發(fā)明口服疫苗含片的抗酸劑包括有機抗酸劑或無機抗酸劑，其中有機抗酸劑可選檸檬酸鹽，包括檸檬酸鈉或檸檬酸鉀；適用的無機抗酸劑是不溶于水的無機鹽碳酸鈣，它能與抗原締合，且抗原在與碳酸鈣締合期間能保持其抗原活性，本發(fā)明優(yōu)選碳酸鈣為抗酸劑。進一步設(shè)置是所述包衣為水不溶性包衣材料制備，例如乙基纖維素，其他水不溶性纖維素衍生物和聚甲基丙烯酸酯。其中，乙基纖維素為首選包衣材料。包衣還可含有 2-20%水溶性增塑劑和有效量的脆性誘導劑。影響包衣裂開的因素有(1)增厚包衣，會增加溶解和漏出水溶性增塑劑的時間，包衣裂開時間也會增加；( 脆性誘導物質(zhì)增多，包衣將裂開更早；C3)增塑劑量增大后，也會增加滯后時間。水溶性增塑劑可選檸檬酸三乙酯、 檸檬酸三丁酯、丙二醇、聚乙二醇、甘油三乙酸酯和月桂基硫酸鈉；首選的增塑劑是檸檬酸三乙酯，濃度為包衣材料總干物質(zhì)的10% -20%之間。脆性誘導劑又被稱為定型劑，它可降低形成包衣的膜的彈性，可選脆性誘導劑有滑石、二氧化硅氣凝膠、硬脂酸鎂。進一步設(shè)置是所述膠囊為明膠或淀粉衍生物制備。進一步設(shè)置是所述的所述口服含片疫苗含有抗原藥用載體，該抗原藥用載體包括但不限于糖類、多羥基化合物、氨基酸、氫氧化鋁或磷酸鋁、氫氧化鎂或磷酸鎂、羥基磷灰石、滑石粉、氧化鈦、氫氧化鐵或磷酸鐵、硬脂酸鎂、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素、明膠、植物胨、蒼耳烷膠、角叉菜膠、阿拉伯膠、環(huán)狀糊精。
進一步設(shè)置是所述口服含片含有免疫刺激劑，該免疫刺激劑包括但不限于B鏈的霍亂毒素，E. coli腸毒素，3-脫氧?；瘑瘟柞；|(zhì)A、卡介菌多糖核酸、細菌細胞壁骨架。進一步設(shè)置是所述口服含片含有粘結(jié)劑，該粘結(jié)劑為葡聚糖。進一步設(shè)置是所述口服含片含有使口服疫苗在儲存期間穩(wěn)定地形成玻璃狀物的化合物，該化合物為多羥基化合物。本發(fā)明的另一個技術(shù)方案是一種流感口服緩釋疫苗的制備方法，包括有以下步驟(1)、流感免疫原液制備，制備流感全病毒滅活液、流感病毒裂解液、亞單位疫苗原液；O)、疫苗核心制備將步驟⑴流感免疫原液中的一種或其組合經(jīng)檢定后加入佐劑，然后添加凍干穩(wěn)定劑將疫苗原液進行稀釋至血凝素含量30 μ g-40ug/劑或 0. 3ml-0. 4ml/劑，采用無菌裝填操作，按0. 5ml_0. 6ml的劑量轉(zhuǎn)移至塑料的水泡樣洞孔中， 將組合物凍干后，用熱封方法將水泡樣洞孔密封；(3)、將步驟( 制備的疫苗核心進行包衣，將包衣材料以及包衣材料佐劑與水混合，制備包衣混懸液，直至得到干物質(zhì)含量為20% -22%的混懸液，在包衣鍋或流體床中， 將疫苗核心用上述混懸液包衣，直至得到所需重量片劑。(4)、將步驟( 制備的包衣后的疫苗核心和步驟( 制備的疫苗核心混裝于膠囊中。本發(fā)明的核心為一種包含了流感免疫抗原的能迅速溶解于口腔或能在呼吸道或消化道緩釋的流感口服緩釋疫苗。該疫苗與現(xiàn)有的注射用流感疫苗制劑相比，有以下優(yōu)勢(1)采用口服含片或口服緩釋制劑形式的流感疫苗，能在粘膜表面接種流感免疫原，模擬自然感染途徑，誘導宿主對感染的典型應(yīng)答，可達到理想的免疫效果。(2) 口服含片使用方便，可比注射劑覆蓋更廣泛人群。(3) 口服含片特別適合老人和嬰兒，因為粘膜免疫并不受與年齡相關(guān)的機能障礙的影響，而嬰兒粘膜免疫系統(tǒng)的發(fā)育要早于全身免疫；(4) 口服流感疫苗的抗原提純的要求相對不高，無需在極其嚴格的條件下生產(chǎn)，成本較低，可相對減少因所需的抗原量增多而需要的費用。(5) 口服疫苗使用方便，無需專業(yè)人員進行接種，便于保存運輸。下面通過具體實施方式
對本發(fā)明內(nèi)容作進一步描述。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明所涉及的口服流感疫苗含片包括現(xiàn)有的流感全病毒滅活疫苗、裂解疫苗、 亞單位疫苗三種，其制備流程如下(1)疫苗種子庫的制備和其它各種劑型的流感疫苗一樣，要建立原代、主代、工作代三級種子庫，三級種子庫須經(jīng)檢定血凝滴度、病毒滴度、無菌試驗，支原體、鑒別試驗、 外源因子(禽腺病毒、白血病毒檢測)等項目。(2)病毒液的制備工作種子接種雞胚，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液、澄清過濾處理后滅
5活，制成全病毒液，經(jīng)須經(jīng)檢定血凝滴度、無菌試驗，滅活試驗、鑒別試驗等項目。之后再進行裂解或亞單位疫苗原液制備。(3)片劑的制備經(jīng)檢定的疫苗原液加保護劑賦形劑凍干，按片劑制造工藝及崩解技術(shù)，壓片成形后經(jīng)包裝后即為流感口服含片疫苗?？诜M分配比如下流感免疫原(HA):30-40 μ g/ 片保護劑、添加劑和調(diào)味劑蔗糖1_2%，山梨醇1. 5-3%，葡聚糖T40 2_4%，氨基酸 1-2%，碳酸鈣60-80mg，蒼耳烷0.3%或淀粉2%佐劑LT 25 μ g/片或MPL 5 μ g/片本發(fā)明的流感口服含片疫苗，其特點是含有流感疫苗抗原凍干成分，添加適當?shù)奶砑觿┖唾x型劑保護劑后放入口內(nèi)即迅速溶于唾液中，能保證疫苗分散入唾液內(nèi)，通過粘膜細胞刺激免疫應(yīng)答。理想的凍干口服含片疫苗有足夠的強度以能承受生產(chǎn)時的處理和給藥時的操作； 在給藥時，該制劑應(yīng)不受手的潮濕度影響；該制劑應(yīng)很輕，便于將其放入口中時能即刻溶解。應(yīng)根據(jù)具體實際添加各類佐劑。本發(fā)明中采用的甲1、甲3及乙型三種病毒株均為WHO專家推薦毒種，按《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程》規(guī)程建立疫苗種子庫并進行檢定后備生產(chǎn)使用。本實施例所述的流感全病毒滅活疫苗原液生產(chǎn)用毒種為Hmi型IVR-148株、H3N2 型NYMC X-175C株、以及B型B/Florida/4/2006株。選擇健康雞群的9 11日齡無畸形、血管清晰、活動的雞胚。3-41gEID5(1、0.2ml接種，33°C培養(yǎng)48 72h。之后篩選活胚置 2°C _8°C冷卻后收獲尿囊液，合并后加β-丙內(nèi)酯(終濃度1 4000)置2°C-8°C，24-48h 滅活病毒，之后37°C水解池，得疫苗原液。用截留50萬分子量的超濾器濃縮成20倍濃縮疫苗液，之后用8倍體積的0.01mol/LPBS(PH 7.2)進行衡濾。濃縮疫苗液經(jīng)kpharose 4FF 凝膠柱層析或超速區(qū)帶離心純化后，得到純化流感全病毒添加滅活疫苗添加液。本實施例所述流感裂解疫苗原液生產(chǎn)用毒種為Hmi型IVR-148株、H3N2型NYMC X-175C株、以及B型B/Florida/4/2006株。選擇健康雞群的9 11日齡無畸形、血管清晰、活動的雞胚。IOOEID50 3-4Ig EID5Q、0. 2ml接種，33°C培養(yǎng)48 72h。之后篩選活胚置 2V _8°C冷卻后收獲尿囊液，將收獲的尿囊液病毒經(jīng)澄清和透析(去尿酸鹽)，再經(jīng)截留50 萬分子量的超濾器濃縮成20倍濃縮疫苗液后，使用凝膠過濾柱kpharose 4FF或超速區(qū)帶離心純化病毒后，再使用0. 5%的Triton X-100為裂解劑室溫放置2小時使病毒裂解，再經(jīng)10萬分子量的超濾器超濾，采用的超濾緩沖液為8倍體積的0. 01mol/LPBS(PH 7. 2)去除"Triton X-100 ；加入β-丙內(nèi)酯(終濃度1 4000)置2°C _8°C，24_48h滅活病毒，之后 37°C水解池，最后0. 22 μ m孔徑濾器除菌過濾后得裂解疫苗液。本實施例所述流感病毒亞單位抗原的制備，第三種亞單位疫苗的病毒培養(yǎng)方法也與全病毒滅活疫苗相同，在裂解疫苗基礎(chǔ)上，提取病毒亞單位(HA、NA)，主要工藝包括病毒滅活、病毒裂解和有效抗原(亞單位)純化三個過程，這種疫苗原液只含有高度純化的流感病毒表抗原(HA、NA)，完全去除病毒脂質(zhì)體和內(nèi)部抗原。試驗對照設(shè)置流感口服組、普通裂解流感疫苗組和空白對照組三個免疫組，每組使用6周齡潔凈級雌性體重18 20g的BALB/c小鼠8只，首先通過鼻內(nèi)輸入5 μ g/只完整的失活抗原HA以激活其免疫細胞，然后在觀天后，使用含有2ug/只和^g/只HA的口服流感疫苗進行口服免疫，含有同樣HA的普通裂解流感疫苗進行腹腔注射免疫小鼠，收集免疫之前、14、 42和56天之后的血清。對采集到的血清進行檢測，用血凝抑制方法檢測特異性抗體(抗血凝素抗體)，用間接ELISA方法檢測血清中IgG抗體水平。
表1小鼠免疫后的血清HI結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種流感口服緩釋疫苗，其特征在于該疫苗包括疫苗核心以及包覆于疫苗核心外的包衣，所述疫苗核心包含有流感免疫抗原、保護劑以及賦形劑，且疫苗核心及其包覆于疫苗核心外的包衣包含于膠囊內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感口服緩釋疫苗，其特征在于所述的流感免疫抗原為流感全病毒滅活液、流感病毒裂解液、提取的流感病毒亞單位抗原三種中的一種或其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的流感口服緩釋疫苗，其特征在于該疫苗核心包含有抗酸劑， 且抗酸劑為檸檬酸鹽或碳酸鈣。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的流感口服緩釋疫苗，其特征在于所述包衣為水不溶性包衣材料制備，包括但不限于乙基纖維素、水不溶性纖維素衍生物和聚甲基丙烯酸酯，且添加有 2-20%水溶性增塑劑和脆性誘導劑；所述膠囊為明膠或淀粉衍生物制備。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的流感口服緩釋疫苗，其特征在于所述的所述疫苗核心含有抗原藥用載體，該抗原藥用載體包括但不限于糖類、多羥基化合物、氨基酸、氫氧化鋁或磷酸鋁、氫氧化鎂或磷酸鎂、羥基磷灰石、滑石粉、氧化鈦、氫氧化鐵或磷酸鐵、硬脂酸鎂、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素、明膠、植物胨、蒼耳烷膠、角叉菜膠、阿拉伯膠、 β-環(huán)狀糊精。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的流感口服緩釋疫苗，其特征在于所述疫苗核心含有免疫刺激劑和粘結(jié)劑，該免疫刺激劑包括但不限于B鏈的霍亂毒素，Ε. coli腸毒素，3-脫氧?；瘑瘟柞；|(zhì)Α、卡介菌多糖核酸、細菌細胞壁骨架；粘結(jié)劑為葡聚糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的流感口服緩釋疫苗，其特征在于所述疫苗核心含有使其在儲存期間穩(wěn)定地形成玻璃狀物的化合物，該化合物為多羥基化合物。
8.—種流感口服緩釋疫苗的制備方法，其特征在于包括有以下步驟(1)、流感免疫原液制備，制備流感全病毒滅活液、流感病毒裂解液、亞單位疫苗原液；O)、疫苗核心制備將步驟(1)流感免疫原液中的一種或其組合經(jīng)檢定后加入佐劑， 然后添加凍干穩(wěn)定劑將疫苗原液進行稀釋至血凝素含量30 μ g-40ug/劑或0. 3ml-0. 4ml/ 劑，采用無菌裝填操作，按0. 5ml-0. 6ml的劑量轉(zhuǎn)移至塑料的水泡樣洞孔中，將組合物凍干后，用熱封方法將水泡樣洞孔密封；(3)、將步驟( 制備的疫苗核心進行包衣，將包衣材料以及包衣材料佐劑與水混合， 制備包衣混懸液，直至得到干物質(zhì)含量為20% -22%的混懸液，在包衣鍋或流體床中，將疫苗核心用上述混懸液包衣，直至得到所需重量片劑。G)、將步驟C3)制備的包衣后的疫苗核心和步驟( 制備的疫苗核心混裝于膠囊中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種流感口服緩釋疫苗及其制備方法，本發(fā)明是中國專利申請200910103512X的分案申請，包括全病毒滅活疫苗、裂解疫苗、亞單位疫苗的制備方法，涉及一種適合于口服的新型流感口服含片或口服緩釋疫苗制劑及其制備工藝，包括毒種庫的制備，疫苗原液生產(chǎn)與制備，保護劑和賦形劑的添加與凍干，口服含片或口服緩釋制劑的組分及成形工藝等。流感口服疫苗可避免注射引起的疼痛和不適，模仿自然感染途徑，能夠保證大部分粘膜表面區(qū)域接觸疫苗，引起黏膜免疫反應(yīng)，也能引起系統(tǒng)免疫反應(yīng)；無需在極其嚴格的條件下生產(chǎn)，成本較低，可相對減少因所需的抗原量增多而需要的費用；口服疫苗使用方便，無需專業(yè)人員進行接種，便于保存運輸。
文檔編號A61P31/16GK102258500SQ201110170338
公開日2011年11月30日 申請日期2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者張濤, 朱文漓 申請人:成都康華生物制品有限公司