專利名稱：一種與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合的七肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用噬菌體表面展示技術(shù)，篩選出能與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合的多肽，具體地說，是應(yīng)用隨機七肽噬菌體展示文庫篩選與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合的噬菌體，得到能促進脫礦牙釉質(zhì)表面再礦化的七肽序列。
背景技術(shù)：
齲病是人類最常見口腔疾病之一，其進展最終會導(dǎo)致牙體硬組織缺損并嚴(yán)重影響人們的日常生活。牙齒暴露于口腔中的唾液中，正常人體牙齒處于脫礦與再礦化的動態(tài)礦化平衡之中，二者相互依存，相互拮抗。當(dāng)促進脫礦的因素加重時，即以脫礦為主，牙體中的羥基磷灰石開始溶解。從病因?qū)W以及病理學(xué)的角度出發(fā)，齲病可以理解為致病細(xì)菌(變性鏈球菌等)酸性代謝產(chǎn)物干擾下，牙體礦物質(zhì)脫礦與再礦化的失衡(以脫礦為主)。近年，隨著保存齒科學(xué)的興起，人們針對齲病的策略開始強調(diào)齲病早期診斷和再礦化治療(齲病早期治療)。這樣可以最大程度的減少牙體組織的缺損。眾所周知，有機物在礦物的形成中起著生物調(diào)控作用，該過程稱為生物礦化。牙體硬組織的生物形成就是生物礦化的一個典型例子。有機物對礦物的調(diào)控具體表現(xiàn)為對礦物晶體的成核，晶體生長和礦物的形態(tài)的調(diào)控。國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)證實，有機分子對羥基磷灰石等晶體的成核和晶體結(jié)構(gòu)起著引導(dǎo)作用。如，牙釉質(zhì)中的釉原蛋白，被證實可以促進牙釉質(zhì)表面再礦化。但是這些有機大分子，分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具體應(yīng)用時環(huán)境條件要求苛刻，同時蛋白的生產(chǎn)提純費用昂貴。因此找出能夠與無機物晶體特異性結(jié)合并能調(diào)控其礦化過程的小分子多肽具有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用前景。噬菌體表面展示技術(shù)可以篩選出能夠與無機物特異性結(jié)合并且調(diào)控?zé)o機物礦化過程的小分子多肽(7-12個氨基酸序列)。學(xué)者們已經(jīng)篩選出包括羥基磷灰石在內(nèi)的許多無機物特異性結(jié)合的多肽。但由于這些篩選過程中由于忽略了作為篩選基底的晶體的各向異性特征，這些多肽的調(diào)控作用缺乏特異性。本研究利用隨機七肽噬菌體展示文庫，篩選能與牙釉質(zhì)表面特異性結(jié)合的七肽，在國內(nèi)外尚未報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是應(yīng)用噬菌體表面展示技術(shù)，篩選出一種能與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合的七肽。當(dāng)齲病發(fā)生牙釉質(zhì)脫礦，羥基磷灰石晶體大量暴露，與牙釉質(zhì)表面晶體特異性結(jié)合的多肽相應(yīng)增加，該多肽若融合某些可檢測分子(熒光蛋白)可作為脫礦開始的診斷工具(即齲病的早期診斷)。本發(fā)明的另一目的是利用該多肽對脫礦牙釉質(zhì)表面再礦化過程的作用，將該多肽用于齲壞牙體再礦化修復(fù)。該發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)本發(fā)明應(yīng)用隨機七肽噬菌體展示文庫對牙釉質(zhì)表面進行了 4輪篩選，獲得能與牙釉質(zhì)表面特異性結(jié)合的重組噬菌體，從得到的重組噬菌體分離制備單克隆噬菌體，提取單克隆噬菌體單鏈基因組DNA，共獲得了 32個七肽，通過Output/Input比值比較不同單克隆噬菌體的結(jié)合能力，獲得了能與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合，結(jié)合力最高的七肽，其氨基酸序列如下Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。實驗表明該七肽對脫礦牙釉質(zhì)表面再礦化具有促進作用，可用于齲壞牙體再礦化修復(fù)。本發(fā)明的優(yōu)點是1、本發(fā)明制備的與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合的七肽，能與牙釉質(zhì)表面特異性結(jié)合，尤其是酸蝕后的牙釉質(zhì)表面，該七肽可應(yīng)用于齲病的診斷。2、本發(fā)明制備的七肽具有促進酸蝕牙釉質(zhì)表面再礦的作用，可用于齲壞牙體再礦化修復(fù)。


圖1 是四輪篩選所獲得的洗脫噬菌體的滴度。圖2 是單克隆噬菌體E-I至E-32對牙釉質(zhì)表面的結(jié)合力。圖3 是與牙釉質(zhì)表面特異性結(jié)合能力最強的七肽EHBP的氨基酸序列結(jié)構(gòu)式。圖4 是EHBP與不同牙釉質(zhì)表面(未酸蝕，酸蝕，縱剖面)結(jié)合時的熒光強度比較。 其中圖4(A)未酸蝕牙釉質(zhì)表面未結(jié)合七肽EHBP時的熒光圖；圖4(B)未酸蝕牙釉質(zhì)表面結(jié)合七肽EHBP的熒光圖；圖4(C)酸蝕牙釉質(zhì)表面未結(jié)合七肽EHBP的熒光圖；圖4(D)酸蝕牙釉質(zhì)表面結(jié)合七肽EHBP的熒光圖；圖4(E)牙釉質(zhì)縱剖面未結(jié)合七肽EHBP的熒光圖；圖4(F)牙釉質(zhì)縱剖面結(jié)合七肽EHBP的熒光圖。圖5 是不同七肽對酸蝕牙釉質(zhì)表面的再礦化的促進作用比較(電鏡圖)。其中圖 5(A)酸蝕牙釉質(zhì)表面未加入任何多肽再礦化16h;圖5 (B)酸蝕牙釉質(zhì)表面未加入任何多肽再礦化Mh ；圖5 (C)酸蝕牙釉質(zhì)表面加入隨機多肽RP后再礦化16h ；圖5 (D)酸蝕牙釉質(zhì)表面加入隨機多肽RP后再礦化24h ；圖5(E):酸蝕牙釉質(zhì)表面加入低結(jié)合力多肽ELBP后再礦化16h ；圖5(F)酸蝕牙釉質(zhì)表面加入低結(jié)合力多肽ELBP后再礦化Mh ；圖5(G)酸蝕牙釉質(zhì)表面加入高結(jié)合力多肽EHBP后再礦化16h ；圖5(H)酸蝕牙釉質(zhì)表面加入高結(jié)合力多肽EHBP后再礦化Mh。
具體實施例方式以下結(jié)合說明書附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不是限制本發(fā)明。實施例1 與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合的重組噬菌體的篩選1.第一輪篩選與洗脫1)取正畸原因拔除前磨牙，去除牙齒表面附著軟組織，將前磨牙放入蒸餾水中超聲清洗30分鐘，經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒后備用。2)將消毒后的前磨牙放入封阻緩沖液(0. IM NaHCO3 [pH 8. 6]，5mg/ml BSA, 0. 02% NaN3),4°C過夜封阻。3)第二天，將經(jīng)過過夜封阻的前磨牙取出，放入滅菌水，4°C繼續(xù)封阻1小時。4)將牙齒懸吊于 M 孔板的一個孔中，用 500uL TBST (TBS+0. 1% [v/v] Tween-20) 緩沖液快速沖洗牙齒6次。注意每次沖洗吸取TBST緩沖液后，再次加入TBST緩沖液要快，避免牙齒干燥。5)經(jīng)過6次TBST緩沖液沖洗后，去除緩沖液，立即加入IOuL噬菌體原庫(10"pfu) (噬菌體試劑盒購自New England Biolabs公司)和490uL TBST緩沖液的混合溶液。注意控制牙齒懸吊高度，以保證液體僅浸泡牙釉質(zhì)表面，不超過牙冠部分。室溫下置于搖床溫和搖動結(jié)合40分鐘。6)吸掉噬菌體原庫和TBST混合溶液，用500uL TBST緩沖液快速沖洗牙齒10次。 具體注意事項同步驟4)。7)吸掉 TBST 緩沖液，加 IOOOuL 洗脫緩沖液(0. 2M Glycine-HCl [pH 2. 2]，lmg/ml BSA)洗脫結(jié)合的噬菌體，室溫下置于搖床溫和搖動10分鐘。立即將洗脫噬菌體液轉(zhuǎn)移至另一干凈微量離心管，然后再用150uL Tris-HCl (ΙΜ,ρΗ 9. 1)中和上述洗脫噬菌體液。4°C保存直到用于噬菌體滴度測定或擴增用于下一輪篩選。2.擴增，第二，三，四輪篩選與洗脫1)準(zhǔn)備5mL LB-Tet培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基并加入5uL四環(huán)素貯液[四環(huán)素20mg/mL 溶解于乙醇])放入15mL離心管。槍頭挑取ER2378菌落一個，放入培養(yǎng)基，置于37°C恒溫?fù)u床，230rpm，過夜培養(yǎng)。2)第二天，將ER2738細(xì)菌過夜培養(yǎng)物1 100稀釋于20mLLB培養(yǎng)基中(用250mL 三角燒瓶盛裝)，37°C恒溫?fù)u床，230rpm,預(yù)培養(yǎng)1小時。3)加入200uL未擴增洗脫噬菌體液，37°C恒溫?fù)u床，250rpm,培養(yǎng)4. 5小時.4)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物至50mL高速離心管，4°C，10，OOOrpm,離心10分鐘。上清液轉(zhuǎn)移至新離心管，相同條件下再次離心。5)將上清的上部80%轉(zhuǎn)移至新離心管，加入1/6體積的PEG/NaCl溶液，4°C過夜沉淀。6)第三天，4°C，10，OOOrpm，離心15分鐘。倒掉上清液，再短暫離心，吸去殘留上清液。7)沉淀物重懸于ImL TBS中，懸液轉(zhuǎn)入微量離心管中，4°C，10，OOOrpm離心5分鐘
使殘余細(xì)胞沉淀。8)上清轉(zhuǎn)入另一新鮮微量離心管，用1/6體積的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育60 分鐘。4°C，10，OOOrpm離心10分鐘，棄上清，再短暫離心，用微量移液器吸去殘余上清。9)沉淀物重懸于200uL TBS中。離心1分鐘，沉淀任何殘余的不溶物。上清轉(zhuǎn)入新鮮管中。此即為擴增后的洗脫噬菌體液。4°C保存用于測定滴度和下一輪的篩選。10)按照第一輪的方法進行第二，三，四輪篩選實驗，但是TBST緩沖液的Tween濃度增至 0.5% (ν/ν)。3.噬菌體滴度的測定1)槍頭挑取ER2378菌落一個，放入含5mL LB-Tet培養(yǎng)基的15mL離心管。置于 37 °C恒溫?fù)u床，230rpm,培養(yǎng)至對數(shù)中期(0D 0. 5)。2)微波爐融化上層瓊脂，分成3mL等份于滅菌試管中，每個噬菌體稀釋度一管。保存于45°C備用。3) 37°C預(yù)溫LB/IPTG/Xgal平板，每個噬菌體稀釋度取一個平板備用。4)在LB培養(yǎng)基中準(zhǔn)備10倍系列稀釋的噬菌體。稀釋度如下
對于擴增噬菌體液，IO9至IO11稀釋度；對于洗脫噬菌體液，IO3至IO6稀釋度。5)菌體培養(yǎng)物分成200uL等份于微量離心管中，每個噬菌體稀釋度一管。6)每管加入IOuL不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫溫育5分鐘。7)將感染細(xì)胞加入45°C預(yù)溫的上層瓊脂培養(yǎng)管中，每次一管，快速混勻，立即傾注于37°C預(yù)溫的LB/IPTG/Xgal平板上。適當(dāng)傾斜平板將上層瓊脂均勻鋪開。8)平板冷卻5分鐘，倒置平板，37°C培養(yǎng)過夜。9)計數(shù)平板上噬菌斑的數(shù)目，根據(jù)稀釋度計算噬菌體的濃度。結(jié)果經(jīng)過四輪篩選，第一輪至第三輪從牙釉質(zhì)表面基底洗脫下來的噬菌體總量升高，第四輪開始，洗脫噬菌體滴度未升高(圖1)，說明噬菌體與牙釉質(zhì)表面的結(jié)合已到最大程度。實施例2 單克隆噬菌體的分離制備1)根據(jù)實施例1所述，在第三輪和第四輪篩選中噬菌體與牙釉質(zhì)結(jié)合已達(dá)最大程度。因此，從第三，四輪篩選所得噬菌體中分別挑取約15個單克隆。2)將ER2738過夜培養(yǎng)物按1 100稀釋接種于LB培養(yǎng)基，分5mL到離心管中。3)用滅菌牙簽或者槍頭每次挑取一個藍(lán)色噬菌斑，轉(zhuǎn)移至上述的5mL離心管中。 注意，要從噬菌斑總量不滿100個的平板中挑取，以保證每個被挑的噬菌斑僅含一個DNA序列。4) 37°C恒溫?fù)u床，230rpm，培養(yǎng)4-5小時。5)將培養(yǎng)物 4°C，10, OOOrpm,離心 10 分鐘。6)將上清的上部80%轉(zhuǎn)移至新離心管，加入1/6體積的PEG/NaCl溶液，4°C沉淀至少1小時。7)4°C，10，OOOrpm，離心15分鐘。倒掉上清液，再短暫離心，吸去殘留上清液。8)沉淀物重懸于ImL TBS中。4°C，10, OOOrpm,離心5分鐘，沉淀任何殘余的不溶物。9)上清轉(zhuǎn)入新鮮離心管中，此即挑取的單克隆噬菌體。4°C保存SOOuL用于測序， 余部分1 1與甘油混合后置于-20°C長期保存。結(jié)果從原庫隨機挑取的隨機單克隆噬菌體E-1，從第三輪挑取單克隆噬菌體15 個(E-2至E-16)，從第四輪挑取單克隆噬菌體16個(E-17至E-32)。實施例3 噬菌體單鏈基因組DNA的提取和七肽氨基酸序列的獲得1)取實施例2所得800uL擴增后的單克隆噬菌體液，加入300uL PEG/NaCl溶液， 顛倒混勻，室溫放置30分鐘。2) 10，OOOrpm離心10分鐘，棄上清液，短暫離心，小心吸去殘留上清。3)上步所得沉淀物重懸于IOOuL碘化物緩沖液中，再加入250uL無水乙醇，室溫孵育10分鐘。4) 10，OOOrpm離心10分鐘，棄上清。用70%乙醇洗沉淀。5) 10, OOOrpm離心10分鐘，棄上清，干燥。6)沉淀重懸于 30uL TEdOmM Tris-HCl [pH 8. 0], ImM EDTA)中，此即該單克隆噬菌體的單鏈基因組DNA。
7)以 _96gIII 測序引物(5，-H。CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3，)對上述單鏈DNA 測序。用Align軟件翻譯，得到七肽氨基酸序列。結(jié)果從原庫隨機挑取的隨機七肽以及第三輪(15個)和第四輪(16個)篩選到的七肽的氨基酸序列如表1所示。表1 單克隆噬菌體E-I至E-32表達(dá)的七肽的氨基酸序列。
權(quán)利要求
1.一種與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合的七肽，其氨基酸序列如下 Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合的七肽，其特征在于所述的七肽的制備步驟如下1)應(yīng)用隨機七肽噬菌體展示文庫對牙釉質(zhì)表面進行四輪篩選，獲得能與牙釉質(zhì)表面特異性結(jié)合的重組噬菌體；2)從步驟1)得到的重組噬菌體分離制備單克隆噬菌體；3)提取單克隆噬菌體單鏈基因組DNA，獲得七肽氨基酸序列；4)測定單克隆噬菌體對牙釉質(zhì)表面結(jié)合能力，篩選出對牙釉質(zhì)表面特異性結(jié)合力最強的七肽氨基酸序列，其氨基酸序列如下Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合的七肽，其特征在于所述的與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合的七肽在齲病的診斷以及齲壞牙體再礦化修復(fù)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合的七肽序列及其應(yīng)用。本發(fā)明應(yīng)用噬菌體表面展示技術(shù)，篩選出一種能與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合的七肽，其氨基酸序列如下Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。該七肽具有與與牙釉質(zhì)表面軸向特異性結(jié)合的特性，并且能夠促進脫礦牙釉質(zhì)表面的再礦化過程。該發(fā)明提供的七肽對齲病的診斷以及齲壞牙體再礦化修復(fù)具有很高的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K49/00GK102286073SQ20111017564
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者周彬, 龔士強 申請人:華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院