專利名稱：鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程，特別涉及檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的gG基因重組原核表達(dá)檢測(cè)抗原蛋白以及它的制備方法。
背景技術(shù)：
鴨瘟(DuckPlague, DP)，又名鴨病毒性腸炎(Duck Viral Enteritis, DVE)，是由鴨瘟病毒(Duck plague virus, DPV)引起鴨、鵝和天鵝等水禽的一種急性、熱性、敗血性傳染病。鴨瘟的臨床癥狀為精神沉郁、高熱稽留、共濟(jì)失調(diào)、下痢、畏光流淚和部分病鴨頭頸腫大，該病為一種嗜全身性感染的傳染病，以急性敗血癥為主要特征。其病理剖解特征是血管損傷，組織器官出血，消化道出血、炎癥和壞死，消化道粘膜某些特定部位疹狀損害，淋巴器官受損以及實(shí)質(zhì)器官的退行性變化。該病的流行特征是傳播迅速、發(fā)病率和死亡率高，且對(duì)鴨、鵝和白天鵝易感，是水禽養(yǎng)殖業(yè)的一大危害。過(guò)去對(duì)鴨瘟病毒血清抗體的檢測(cè)方法主要是利用全病毒作為抗原進(jìn)行檢測(cè)，但傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法大約需要4 5d，方法繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且純化后的病毒中會(huì)摻雜有許多宿主細(xì)胞成分，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的目的之一在于提供鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的制備方法，該方法適用于大規(guī)模生產(chǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
所述鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的制備方法，具體包括以下步驟 A鴨瘟病毒gG的DNA片段的獲得
以鴨瘟病毒毒株基因組DNA為模板對(duì)gG基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得鴨瘟病毒gG基因片段， 與PMD18-T的連接，得pMD18-gG，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，其上游引物如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，下游引物如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； B重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gG的獲得
限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I分別雙酶切pMD18_gG質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pET32a (+)， 以重組質(zhì)粒為模板為模板，PCR擴(kuò)增，得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gG ； C鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的獲得
將步驟B所得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-gG轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21 (DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白。進(jìn)一步，將步驟C所得鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白進(jìn)行親和層析純化，得純化的鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白。進(jìn)一步，將步驟B所得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a_gG轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21 (DE3)， 在IPTG濃度彡1. Ommol/L,誘導(dǎo)溫度為25°C條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白。
本發(fā)明的目的之二在于提供一種重組表達(dá)蛋白，該蛋白具有鴨瘟病毒免疫原性。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白，所述鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。本發(fā)明的目的之三在于提供鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的兩種應(yīng)用，其為鴨瘟病毒的檢測(cè)和治療提供了新的思路。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案之一為
所述的鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白在制備鴨瘟病毒抗原中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白在制備鴨瘟病毒抗體捕獲劑中的運(yùn)用。本發(fā)明的另一技術(shù)方案為
所述的鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白在制備鴨瘟病毒疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之四在于提供一種鴨瘟病毒抗體的檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需價(jià)格昂貴的儀器。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
運(yùn)用所述的鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的方法，具體包括以下步驟
A鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白稀釋至終濃度為2. 5 μ g/100 μ L，在酶標(biāo)板中包被過(guò)夜，用封閉液封閉，得固相抗原；
B將待檢血清作80倍體積稀釋得稀釋血清，通過(guò)保溫反應(yīng)使所述稀釋血清與步驟A所得固相抗原結(jié)合形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌去除固相載體上雜質(zhì)；
C、將所述酶標(biāo)二抗作2000倍體積稀釋后，與所述固相抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，得抗原一抗體一二抗復(fù)合物；
D、在步驟c所得抗原一抗體一二抗復(fù)合物加入色原底物避光顯色后，加入終止液終止反應(yīng)得顯色樣品液；
E、將步驟d所述顯色液用酶標(biāo)儀測(cè)測(cè)OD45tlnm值，待檢血清的OD45tlnm值>陰性樣品OD45tlnm 值的臨界值(X+3SD)時(shí)判定為陽(yáng)性，反之則為陰性，其中X為陰性樣品OD45tlnm值的均值，SD 為陰性樣品OD45tlnm值的標(biāo)準(zhǔn)方差。本發(fā)明鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白，是利用基因工程技術(shù)，鴨瘟病毒 (DPV)gG基因完整基因片段(自起始密碼子ATG前3個(gè)堿基至終止密碼雜子TAA)進(jìn)行克隆的基礎(chǔ)上，將其與原核表達(dá)載體pET-32a(+)連接，成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌B121(DE3)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)、表達(dá)的基因工程產(chǎn)品。該蛋白的表達(dá)形式是gG/His融合蛋白，表達(dá)的融合蛋白分子量為70kDa，該蛋白設(shè)計(jì)為融合表達(dá)一是考慮便于純化，二是能增加表達(dá)蛋白的免疫原性。經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后的產(chǎn)品經(jīng)Western blot進(jìn)行鑒定后表面具有與天然蛋白相似的免疫反應(yīng)活性。采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的產(chǎn)品可用于
①本鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白可作為檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的間接ELISA方法的檢測(cè)抗原。②可作為預(yù)防鴨瘟病毒感染的基因工程亞單位疫苗。
本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在
①由于鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白并非全病毒，以此應(yīng)用該檢測(cè)抗原進(jìn)行檢測(cè)時(shí)無(wú)散毒危險(xiǎn)。②作為ELISA抗原檢測(cè)鴨瘟病毒抗體，特異性強(qiáng)，無(wú)交叉反應(yīng)。
③性能穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低，適合工廠化生產(chǎn)，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣。


圖1為gG基因的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中M為Marker，其中，I-A中，1為 gG基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得的特異性DNA條帶；I-B中，1為重組質(zhì)粒 pMD18-gG用BamH I和Xho I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得的兩條特異性條帶；I-C中，1為重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gG用Xho I單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得的一條特異性條帶，2為重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gG用BamH I和Xho I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得的兩條特異性條帶。圖2為鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳圖，M為蛋白
M arker ； 2-A中，1為空載體pET_32a (+)用IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE電泳所得結(jié)果，2為空載體pET-32a (+)未用IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE電泳所得結(jié)果，3為重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_gG 用IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE電泳所得結(jié)果，4為重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_gG未用IPTG誘導(dǎo)，經(jīng) SDS-PAGE電泳所得結(jié)果，5為重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gG用IPTG誘導(dǎo)，得到的菌液進(jìn)行超聲波破碎、離心后，所得上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳的結(jié)果，6為重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gG用IPTG 誘導(dǎo)，得到的菌液進(jìn)行超聲波破碎、離心后，所得沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳的結(jié)果；2-B中，1 為25°C誘導(dǎo)12h條件下，對(duì)重組質(zhì)粒pET32a-gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為O mmol/L，2為25°C誘導(dǎo)12h條件下，對(duì)重組質(zhì)粒pET32a_gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為0. 2 mmol/L，3為25°C誘導(dǎo)12h條件下，對(duì)重組質(zhì)粒pET32a_gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為0. 5 mmol/L，4為對(duì)重組質(zhì)粒pET32a_gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)劑IPTG 的終濃度為0. 8 mmol/L, 5為對(duì)重組質(zhì)粒pET32a-gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為 1. O mmol/L，6為對(duì)重組質(zhì)粒pET32a_gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為1. 2 mmol/ L ；2-C中，1為IPTG終濃度1. Ommol/L誘導(dǎo)12h條件下，對(duì)重組質(zhì)粒pET32a_gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)溫度為37°C，2為IPTG終濃度1. Ommol/L誘導(dǎo)12h條件下，對(duì)重組質(zhì)粒pET32a_gG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)溫度為30°C，3為IPTG終濃度1. Ommol/L誘導(dǎo)12h條件下，對(duì)重組質(zhì)粒 pET32a-gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)溫度為25°C ；2-D中，1為IPTG終濃度1. Ommol/L 25°C誘導(dǎo)條件下，對(duì)重組質(zhì)粒pET32a-gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間為Oh，2為IPTG終濃度1. Ommol/ L 25°C誘導(dǎo)條件下，對(duì)重組質(zhì)粒pET32a-gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間為2h，3為IPTG終濃度1. Ommol/L 25°C誘導(dǎo)條件下，對(duì)重組質(zhì)粒pET32a_gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間為3h，4為 IPTG終濃度1. Ommol/L 25°C誘導(dǎo)條件下，對(duì)重組質(zhì)粒pET32a_gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間為4h，5為IPTG終濃度1. Ommol/L 25°C誘導(dǎo)條件下，對(duì)重組質(zhì)粒pET32a_gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間為5h，6為IPTG終濃度1. Ommol/L 25°C誘導(dǎo)條件下，對(duì)重組質(zhì)粒pET32a_gG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間為6h，7為IPTG終濃度1. Ommol/L 25°C誘導(dǎo)條件下，對(duì)重組質(zhì)粒 pET32a-gG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間為12h。圖3為純化后的鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳圖，M為蛋白M arker,其中，1為純化前的gG基因重組原核表達(dá)蛋白，2為經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化后的gG基因重組原核表達(dá)蛋白。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的稀釋方式均以體積為計(jì)量單位進(jìn)行稀釋。實(shí)施例1鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的制備一材料準(zhǔn)備
1菌株、質(zhì)粒和毒株
質(zhì)粒pMD18-T，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a (+)，Novagen公司產(chǎn)品；克隆宿主菌E. coli DH5a、表達(dá)宿主菌E. coli B121(DE3)和DPV CHv強(qiáng)毒株，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心提供。羊抗鴨IgG-HRP (辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鴨IgG)和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)均購(gòu)自美國(guó)KPL公司，羊抗鴨IgG-HRP的為凍干劑，分裝為0. Img/瓶，使用時(shí)按說(shuō)明書(shū)溶解為lmL。2試驗(yàn)動(dòng)物
10日齡鴨胚，其種鴨DPV和抗體均為陰性。3實(shí)驗(yàn)方法
3. 1 DPV gG基因的克隆 3. 1.1引物設(shè)計(jì)
利用Primer Premier5. O軟件，參考gG基因序列(GenBank登錄號(hào)EU071043)，由寶生物生物技術(shù)有限公司合成。引物DPV-gG F如SEQ ID NO: 3所示5，-収atcc収tat収caa caatgatag-3’(劃線部分為 BamH I 位點(diǎn))；引物 DPV-gG R 如 SEQ ID NO: 4 所示5'-ct cgagaaacacaagacacacacgtc-3‘(劃線部分為Xho I位點(diǎn))。合成后，以適量滅菌去離子水溶解，使其終濃度為20 mm0l/L，-2(TC保存?zhèn)溆谩?. 1. 2 DPV基因組DNA的提取
a、正常鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)的制作方法取IOd日齡健康鴨胚，分別用體積分?jǐn)?shù)為 5%碘酒和體積分?jǐn)?shù)為75%酒精消毒蛋殼表面。無(wú)菌操作條件下將胚體取出并用PBS將胚體洗凈，剪去頭、翅、腿和內(nèi)臟，PBS沖洗后將胚體剪成Imm3大小的小塊，加PBS適量，之后置于三角瓶?jī)?nèi)，加細(xì)胞分散劑(體積分?jǐn)?shù)為2. 5%胰蛋白酶)150μ L /胚，于37°C水浴中消化3min。立即將細(xì)胞懸液以4000r/min離心5min，傾棄上清，細(xì)胞沉淀用適量的MEM懸浮后，用6層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清和100IU/mL雙抗后，分裝于 IOOmL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，7mL/瓶，水平靜置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。b、DPV增殖取剛剛長(zhǎng)成致密單層的DEF，棄生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗細(xì)胞表面2次后，加入DPV病毒液2-3mL覆蓋細(xì)胞表面進(jìn)行吸附，37°C吸附Ih后棄病毒液，然后加含3%小牛血清和100IU/mL雙抗的MEM維持營(yíng)養(yǎng)液，之后37°C培養(yǎng)。同時(shí)做未接毒的DEF 對(duì)照。c、DNA提取方法直接從感染的DEF中提取DPV基因組DNA，具體步驟如下(1) 選取用DPV種毒感染后細(xì)胞病變(CPE)達(dá)80%的DEF ；同時(shí)選取細(xì)胞形態(tài)正常的DEF作對(duì)照；(2)傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入500 μ L的細(xì)胞裂解液，同時(shí)加蛋白酶K(10mg/mL)至終濃度為200 μ g/mL,輕輕混勻后，37°C孵育10分鐘；(3)將細(xì)胞懸浮液倒入EP離心管中，并用 500 μ L的飽和酚洗滌殘存于細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的裂解物，倒入離心管中；(4)用飽和酚氯仿及氯仿抽提2次，再用水飽和乙醚處理2次；(5)加1/10倍體積3mol/L NaAC,混勻后，加入2倍體積冷無(wú)水乙醇，_20°C放置30-60分鐘；(6) 13000r/分鐘離心20分鐘，沉淀用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗滌兩次；(7)真空抽干后，溶于適量TE緩沖液中，加入IyL RNA酶，37°C 作用30分鐘，-20°C保存?zhèn)溆谩?
權(quán)利要求
1.鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的制備方法，具體包括以下步驟 A鴨瘟病毒gG的DNA片段的獲得以鴨瘟病毒毒株基因組DNA為模板對(duì)gG基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得鴨瘟病毒gG基因片段， 與PMD18-T的連接，得pMD18-gG，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，其上游引物如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，下游引物如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； B重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gG的獲得限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I分別雙酶切pMD18_gG質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pET32a (+)， 并連接，得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gG ；C鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的獲得將步驟B所得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gG轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21 (DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的制備方法，其特征在于將步驟C所得鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白進(jìn)行親和層析純化，得純化的鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的制備方法，其特征在于將步驟B所得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gG轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21 (DE3)，在IPTG濃度彡1. Ommol/L,誘導(dǎo)溫度為25°C條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)8_12小時(shí)，得鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的制備方法所得的鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白，其特征在于所述鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
5.權(quán)利要求4所述的鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白在制備鴨瘟病毒抗原中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白在制備鴨瘟病毒抗體捕獲劑中的運(yùn)用。
7.權(quán)利要求4所述的鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白在制備鴨瘟病毒疫苗中的應(yīng)用。
8.運(yùn)用權(quán)利要求4所述的鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的方法，其特征在于，具體包括以下步驟A鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白稀釋至終濃度為2. 5 μ g/100 μ L，在酶標(biāo)板中包被過(guò)夜，用封閉液封閉，得固相抗原；B將待檢血清作80倍體積稀釋得稀釋血清，通過(guò)保溫反應(yīng)使所述稀釋血清與步驟A所得固相抗原結(jié)合形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌去除固相載體上雜質(zhì)；C、將所述酶標(biāo)二抗作2000倍體積稀釋后，與所述固相抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，得抗原一抗體一二抗復(fù)合物；D、在步驟c所得抗原一抗體一二抗復(fù)合物加入色原底物避光顯色后，加入終止液終止反應(yīng)得顯色樣品液；E、將步驟d所述顯色液用酶標(biāo)儀測(cè)OD45tlnm值，待檢血清的OD45tlnm值>陰性樣品OD45tlnm 值的臨界值，即X+3SD時(shí)判定為陽(yáng)性，反之則為陰性，其中X為陰性樣品OD45tlnm值的均值，SD 為陰性樣品OD45tlnm值的標(biāo)準(zhǔn)方差。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的gG基因重組原核表達(dá)檢測(cè)抗原蛋白以及它的制備方法與應(yīng)用，該抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其制備方法包括鴨瘟病毒gG的DNA片段的獲得、重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gG的獲得、鴨瘟病毒gG基因重組原核表達(dá)蛋白的獲得三步驟；其可作為制備鴨瘟病毒抗原及亞單位疫苗運(yùn)用。
文檔編號(hào)A61P31/20GK102321636SQ20111017712
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者楊曉圓, 汪銘書(shū), 程安春, 陳孝躍 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工程技術(shù)中心