專利名稱：布氏桿菌病活疫苗的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物疫苗的制備方法，尤其涉及布氏桿菌病疫苗的制備方法及由該方法制備得到的疫苗，本發(fā)明屬于布氏桿菌病疫苗的生產(chǎn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
布氏桿菌病(全稱布魯士桿菌病(brucellosis)是由布氏桿菌引起的人畜共患的急、慢性傳染病。臨床特點(diǎn)是緩慢起病，長(zhǎng)期發(fā)熱、多汗、虛弱、全身痛和關(guān)節(jié)痛，急性期癥狀多在3 6月內(nèi)消退。布氏桿菌共分為牛、羊、豬、沙林鼠、綿羊和犬布氏桿菌六種。在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的主要為前三種。布氏桿菌為細(xì)小的短桿狀或球桿狀，不產(chǎn)生芽胞，革蘭氏染色陰性的桿菌。布氏桿菌對(duì)熱敏感，70°C 10分鐘即可死亡；陽(yáng)光直射1小時(shí)死亡；在腐敗病料中迅速失去活力；一般常用消毒藥都能很快將其殺死。潛伏期短者兩周，長(zhǎng)者可達(dá)半年。母牛流產(chǎn)是本病的主要癥狀，流產(chǎn)多發(fā)生于懷孕5-7個(gè)月，產(chǎn)出死胎或軟弱胎兒。母牛流產(chǎn)后常伴有胎衣不下或子宮內(nèi)膜炎，陰道內(nèi)繼續(xù)排出紅褐色惡臭液體，可持續(xù)2-3周，患病公牛常發(fā)生睪丸炎或附睪炎。人也可感染該病，表現(xiàn)為長(zhǎng)期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛及肝、脾腫大等癥狀.該病嚴(yán)重?fù)p害人和動(dòng)物的健康，OIE將其列為B類動(dòng)物疫病，中國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病.布氏桿菌病對(duì)畜牧業(yè)和人類健康均構(gòu)成嚴(yán)重威脅，疫苗免疫是預(yù)防和控制布氏桿菌病的主要措施。由于布氏桿菌胞內(nèi)寄生的特點(diǎn)，只有利福平等少數(shù)的幾種抗生素對(duì)其治療有效，但這些抗生素的副作用很大，不能長(zhǎng)期服用，因此一旦發(fā)病并轉(zhuǎn)為慢性則無(wú)法根治，并能反復(fù)發(fā)作。因此，接種疫苗是預(yù)防布氏桿菌病的最有效的手段。布氏桿菌活疫苗A19株是防制布氏桿菌病非常有效的弱毒疫苗株，該疫苗適用于牛和羊，且牛每頭份免疫劑量為600億-800億?，F(xiàn)有的布氏桿菌A19株活疫苗的生產(chǎn)規(guī)程方法如下一級(jí)菌種制備凍干菌種開(kāi)封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白目示瓊脂平板或其他適宜培養(yǎng)基上，在36-37°C培養(yǎng)2-3日。選取合格菌落10個(gè)以上，移植于胰蛋白目示瓊脂斜面培養(yǎng)基，36-37°C培養(yǎng)48-72小時(shí)，作為一級(jí)種子。在2_8°C保存，使用期應(yīng)不超過(guò)1 個(gè)月。二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種接種于胰蛋白際瓊脂扁平或其他適宜培養(yǎng)基，置 36-37°C培養(yǎng)48-72小時(shí)，肉眼檢查純凈后，每個(gè)扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于 1萬(wàn)-2萬(wàn)ml的適宜液體培養(yǎng)基，置36-37°C培養(yǎng)48-72小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)后置2_8°C保存，使用期應(yīng)不超過(guò)30天。菌液培養(yǎng)按培養(yǎng)基量加入適量的消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基量的-2%接種二級(jí)菌種，在36-37°C逐漸增大通氣量，培養(yǎng)36小時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程中可根據(jù)需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量為培養(yǎng)基總量的_2%。按現(xiàn)有的規(guī)程進(jìn)行布氏桿菌活疫苗(A19株)生產(chǎn)所培養(yǎng)得到菌液的活菌數(shù)為 800-1000億/ml，需要對(duì)該菌液進(jìn)行濃縮處理，存在產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等問(wèn)題，有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有的布氏桿菌活疫苗的生產(chǎn)方法中所存在的產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等問(wèn)題，提供一種新的布氏桿菌活疫苗的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法所培養(yǎng)得到菌液的菌數(shù)可達(dá)1500-1800億/ml，具有存在產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種布氏桿菌病活疫苗的制備方法，包括一級(jí)菌種制備、二級(jí)菌種制備和菌液培養(yǎng)；其中在菌液培養(yǎng)階段，液體培養(yǎng)基接種二級(jí)菌種后首先按照逐漸增大通氣量的方式通入空氣進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至30h時(shí)開(kāi)始通入純氧直至培養(yǎng)結(jié)束。本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，不同的通入純氧的方式在培養(yǎng)液的菌數(shù)上有著非常顯著的差別，為了最大限度的提高培養(yǎng)液的菌數(shù)，本發(fā)明比較和篩選了不同的通入純氧的方式，最終發(fā)現(xiàn)，采用以下方式通入純氧，培養(yǎng)液中的菌數(shù)產(chǎn)量最高，可達(dá)到1700-1800億/ml 培養(yǎng)至 30h時(shí)按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加2m3，使培養(yǎng)液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培養(yǎng)結(jié)束。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，在菌液培養(yǎng)階段，通入空氣的方式對(duì)于培養(yǎng)液的菌數(shù)也有一定的影響。本發(fā)明通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在菌液培養(yǎng)階段按照以下方式逐步通入空氣可以有效的提高培養(yǎng)液菌數(shù)液體培養(yǎng)基接種二級(jí)菌種后首先按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開(kāi)始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養(yǎng)20h后將空氣的通氣量進(jìn)一步增大增至18m3/h。此外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，在菌液培養(yǎng)階段，50%葡萄糖溶液的加入方式對(duì)于培養(yǎng)液菌數(shù)也有一定的影響按現(xiàn)有的規(guī)程，50%葡萄糖溶液的加入方法為培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量為培養(yǎng)基總質(zhì)量的1 % -2%。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果在接種時(shí)就按最終含量為將50%葡萄糖溶液一次性加入能夠有效的提高培養(yǎng)液的細(xì)菌數(shù)量。本發(fā)明方法在菌液培養(yǎng)階段中選擇最適宜該細(xì)菌大量繁殖的時(shí)段通入純氧，使培養(yǎng)菌數(shù)得到大幅度提高，培養(yǎng)液中菌數(shù)可達(dá)1500-1900億/ml，在應(yīng)用時(shí)無(wú)需對(duì)該菌液進(jìn)行濃縮處理，具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。


圖1本發(fā)明制備方法的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1一級(jí)菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所) 開(kāi)封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)3日。選取合格菌落10個(gè)以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)72小時(shí)，作為一級(jí)種子，在2-8°C保存；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C 培養(yǎng)72小時(shí)，肉眼檢查純凈后，每個(gè)扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1萬(wàn)ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)72小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)后得到二級(jí)菌種，置2-8°C保存； 每IOOOml馬丁肉湯培養(yǎng)基的成分為牛肉湯500ml豬胃消化液500ml氯化鈉2.5gPH6. 4-6. 7滅菌116 °C 30-40 分鐘菌液培養(yǎng)按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的質(zhì)量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基質(zhì)量的2%接種二級(jí)菌種后通入空氣并逐漸增大空氣的通入量；培養(yǎng)至30h時(shí)按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加2m3，使培養(yǎng)液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培養(yǎng)結(jié)束。經(jīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)液中菌數(shù)為1600億/ml。實(shí)施例2一級(jí)菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所) 開(kāi)封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng) 3日。選取合格菌落10個(gè)以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)72小時(shí)，作為一級(jí)種子，在2-8°C保存；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C 培養(yǎng)72小時(shí)，肉眼檢查純凈后，每個(gè)扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1萬(wàn)ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)72小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)后得到二級(jí)菌種，置2-8°C保存；菌液培養(yǎng)按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的質(zhì)量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基質(zhì)量的2%接種二級(jí)菌種后就按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開(kāi)始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養(yǎng)20h后將空氣的通氣量進(jìn)一步增大增至18m3/h ；培養(yǎng)至30h時(shí)按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加2m3，使培養(yǎng)液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培養(yǎng)結(jié)束。經(jīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)液中菌數(shù)為1850億/ml。實(shí)施例3一級(jí)菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所) 開(kāi)封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng) 3日。選取合格菌落10個(gè)以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)72小時(shí)，作為一級(jí)種子，在2-8°C保存；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C 培養(yǎng)72小時(shí)，肉眼檢查純凈后，每個(gè)扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于2萬(wàn)ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)72小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)后得到二級(jí)菌種，置2-8°C保存；菌液培養(yǎng)按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的質(zhì)量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基質(zhì)量的2%接種二級(jí)菌種后就按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開(kāi)始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養(yǎng)20h后將空氣的通氣量進(jìn)一步增大增至18m3/h ；培養(yǎng)至30h時(shí)按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加2m3，使培養(yǎng)液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培養(yǎng)結(jié)束。經(jīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)液中菌數(shù)為1790億/ml。實(shí)施例4一級(jí)菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所) 開(kāi)封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在36°C培養(yǎng) 2日。選取合格菌落10個(gè)以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，36°C培養(yǎng)48小時(shí)，作為一級(jí)種子，在2-8°C保存；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置36°C 培養(yǎng)48小時(shí)，肉眼檢查純凈后，每個(gè)扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1萬(wàn)ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，置36°C培養(yǎng)48小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)后得到二級(jí)菌種，置2-8°C保存；菌液培養(yǎng)按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的質(zhì)量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為2wt%將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基質(zhì)量的-2%接種二級(jí)菌種后就按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開(kāi)始將空氣的通氣量增至16m3/ h，培養(yǎng)20h后將空氣的通氣量進(jìn)一步增大增至18m3/h ；培養(yǎng)至30h時(shí)按照8m3/h的通入量通入純氧，直至3 培養(yǎng)結(jié)束。經(jīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)液中菌數(shù)為1500億/ml。實(shí)施例5一級(jí)菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所) 開(kāi)封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在36°C培養(yǎng) 2日。選取合格菌落10個(gè)以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，36°C培養(yǎng)60小時(shí)，作為一級(jí)種子，在2-8°C保存；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置36°C 培養(yǎng)60小時(shí)，肉眼檢查純凈后，每個(gè)扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1. 5萬(wàn)ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，置36°C培養(yǎng)60小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)后得到二級(jí)菌種，置2-8°C保存；菌液培養(yǎng)按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的質(zhì)量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基質(zhì)量的接種二級(jí)菌種后就按照8m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開(kāi)始將空氣的通氣量增至12m3/h，培養(yǎng) 20h后將空氣的通氣量進(jìn)一步增大增至16m3/h ；培養(yǎng)至30h時(shí)按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加2m3，使培養(yǎng)液溶氧量DO值保持在95 %~98%,直至3 培養(yǎng)結(jié)束。經(jīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)液中菌數(shù)為1720億/ml。實(shí)施例6—級(jí)菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所) 開(kāi)封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng) 3日。選取合格菌落10個(gè)以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，作為一級(jí)種子，在2_8°C保存；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C 培養(yǎng)48小時(shí)，肉眼檢查純凈后，每個(gè)扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于2萬(wàn)ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)72小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)后得到二級(jí)菌種，置2-8°C保存；菌液培養(yǎng)按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的質(zhì)量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為2wt%將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基質(zhì)量的-2%接種二級(jí)菌種后就按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開(kāi)始將空氣的通氣量增至16m3/ h，培養(yǎng)20h后將空氣的通氣量進(jìn)一步增大增至18m3/h ；培養(yǎng)至30h時(shí)按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每將通氣量增加2m3，使培養(yǎng)液溶氧量DO值保持在95% -98%，直至3 培養(yǎng)結(jié)束。經(jīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)液中菌數(shù)為1800億/ml。實(shí)施例7一級(jí)菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所) 開(kāi)封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在36°C培養(yǎng) 3日。選取合格菌落10個(gè)以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，36°C培養(yǎng)72小時(shí)，作為一級(jí)種子，在2-8°C保存；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C 培養(yǎng)72小時(shí)，肉眼檢查純凈后，每個(gè)扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1萬(wàn)ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)72小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)后得到二級(jí)菌種，置2-8°C保存；菌液培養(yǎng)按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的質(zhì)量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為2wt%將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基質(zhì)量的-2%接種二級(jí)菌種后就按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開(kāi)始將空氣的通氣量增至16m3/ h，培養(yǎng)20h后將空氣的通氣量進(jìn)一步增大增至18m3/h ；培養(yǎng)至30h時(shí)按照6m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加lm3，使培養(yǎng)液溶氧量DO值保持在94%，直至3 培養(yǎng)結(jié)束。經(jīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)液中菌數(shù)為1650億/ml。實(shí)施例8一級(jí)菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所) 開(kāi)封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng) 2日。選取合格菌落10個(gè)以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，作為一級(jí)種子，在2-8°C保存；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C 培養(yǎng)72小時(shí)，肉眼檢查純凈后，每個(gè)扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1萬(wàn)ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)72小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)后得到二級(jí)菌種，置2-8°C保存；菌液培養(yǎng)按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的質(zhì)量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為2wt%將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基質(zhì)量的-2%接種二級(jí)菌種后就按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第他開(kāi)始將空氣的通氣量增至12m3/h， 培養(yǎng)1 后將空氣的通氣量進(jìn)一步增大增至16m3/h ；培養(yǎng)至30h時(shí)按照6m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加lm3，使培養(yǎng)液溶氧量DO值保持在97%直至3 培養(yǎng)結(jié)束。 經(jīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)液中菌數(shù)為1620億/ml。對(duì)比實(shí)施例1一級(jí)菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所) 開(kāi)封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng) 3日。選取合格菌落10個(gè)以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)72小時(shí)，作為一級(jí)種子，在2_8°C保存；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C 培養(yǎng)72小時(shí)，肉眼檢查純凈后，每個(gè)扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于2萬(wàn)ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)72小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)后得到二級(jí)菌種，置2-8°C保存；菌液培養(yǎng)按培養(yǎng)基量加入適量的消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基量的-2%接種二級(jí)菌種，在36-37°C逐漸增大通氣量，培養(yǎng)36小時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程中可根據(jù)需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量為培養(yǎng)基總量的_2%。經(jīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)液中菌數(shù)為820億/ml。對(duì)比實(shí)施例2一級(jí)菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所) 開(kāi)封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在36°C培養(yǎng) 2日。選取合格菌落10個(gè)以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，36°C培養(yǎng)48小時(shí)，作為一級(jí)種子，在2-8°C保存；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置36°C 培養(yǎng)48小時(shí)，肉眼檢查純凈后，每個(gè)扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1萬(wàn)ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，置36°C培養(yǎng)48小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)后得到二級(jí)菌種，置2-8°C保存；菌液培養(yǎng)按培養(yǎng)基量加入適量的消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基量的-2%接種二級(jí)菌種，接種后36-37°C培養(yǎng)，按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開(kāi)始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養(yǎng)20h后將空氣的通氣量進(jìn)一步增大增至18m3/h直至3 培養(yǎng)結(jié)束。 經(jīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)液中菌數(shù)為980億/ml。對(duì)比實(shí)施例3一級(jí)菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所) 開(kāi)封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng) 2日。選取合格菌落10個(gè)以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，作為一級(jí)種子，在2-8°C保存；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C 培養(yǎng)48小時(shí)，肉眼檢查純凈后，每個(gè)扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于2萬(wàn)ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)48小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)后得到二級(jí)菌種，置2-8°C保存；菌液培養(yǎng)按培養(yǎng)基量加入適量的消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基量的-2%接種二級(jí)菌種，接種后36-37°C培養(yǎng)，按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開(kāi)始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養(yǎng)20h后將空氣的通氣量進(jìn)一步增大增至18m3/h直至3 培養(yǎng)結(jié)束。 經(jīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)液中菌數(shù)為900億/ml。對(duì)比實(shí)施例4—級(jí)菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所) 開(kāi)封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng) 2日。選取合格菌落10個(gè)以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)60小時(shí)，作為一級(jí)種子，在2-8°C保存；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C 培養(yǎng)60小時(shí)，肉眼檢查純凈后，每個(gè)扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1. 5萬(wàn)ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)60小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)后得到二級(jí)菌種，置2-8°C保存；
菌液培養(yǎng)按培養(yǎng)基量加入適量的消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基量的-2%接種二級(jí)菌種，接種后36-37 培養(yǎng)，按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開(kāi)始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養(yǎng)20h后將空氣的通氣量進(jìn)一步增大增至18m3/h直至3 培養(yǎng)結(jié)束。 經(jīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)液中菌數(shù)為850億/ml。
權(quán)利要求
1.一種布氏桿菌病活疫苗的制備方法，包括一級(jí)菌種制備、二級(jí)菌種制備和菌液培養(yǎng)； 其特征在于在菌液培養(yǎng)階段，液體培養(yǎng)基接種二級(jí)菌種后按照逐漸增大通氣量的方式通入空氣進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)至30h時(shí)開(kāi)始通入純氧直至培養(yǎng)結(jié)束。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于培養(yǎng)至30h時(shí)按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加2m3，使培養(yǎng)液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培養(yǎng)結(jié)束。
3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于液體培養(yǎng)基接種二級(jí)菌種后首先按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開(kāi)始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養(yǎng)20h后將空氣的通氣量進(jìn)一步增大增至18m3/h。
4.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于按質(zhì)量百分比計(jì)，所述的液體培養(yǎng)基中含有2%的葡萄糖。
5.由權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)制備方法所制備得到的布氏桿菌活疫苗。
6.權(quán)利要求5所述的布氏桿菌活疫苗在制備預(yù)防布氏桿菌病試劑中的用途。
7.權(quán)利要求5所述的布氏桿菌活疫苗在制備治療布氏桿菌病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了布氏桿菌病活疫苗的制備方法及其產(chǎn)品。該方法包括一級(jí)菌種制備、二級(jí)菌種制備和菌液培養(yǎng)；其中，在菌液培養(yǎng)階段，液體培養(yǎng)基接種二級(jí)菌種后按照逐漸增大通氣量的方式通入空氣進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)至30h時(shí)開(kāi)始通入純氧直至36h培養(yǎng)結(jié)束。本發(fā)明方法在菌液培養(yǎng)階段中選擇最適宜該細(xì)菌大量繁殖的時(shí)段通入純氧，使培養(yǎng)菌數(shù)得到大幅度提高，培養(yǎng)液中菌數(shù)可達(dá)1500-1900億/ml，在應(yīng)用時(shí)無(wú)需對(duì)該菌液進(jìn)行濃縮處理，具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/10GK102258774SQ20111018095
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者付麗杰, 尹堯, 張繼東, 柴華, 王 華, 袁明霞, 鄭鐵鑫 申請(qǐng)人:哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司