專利名稱：黃芪甲苷的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中醫(yī)藥領域，具體的說是涉及黃芪甲苷在制備預防和治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
背景技術：
黃芪是一味常用中藥，味甘、性溫，有補氣升陽、脫毒排膿和生肌等功效。研究發(fā)現(xiàn)黃芪中含有的黃芪多糖、皂苷、黃酮等化合物具有較強的生物活性。黃芪甲苷(Astrogaloside-IV，AGS-IV)是從中藥黃芪中提取出來的三萜皂苷類化合物，分子式為C41H68O14,分子量784. 97，結構式如下
OH
ο現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪甲苷具有抗炎、抗衰老、抗病毒、清除自由基、促進胰島素分泌、增強機體免疫力的作用。此外，黃芪甲苷還能改善白細胞變形能力、保護心肌細胞、增強心肌活力，減輕心肌缺血。然而，還未見黃芪甲苷在制備預防和治療阿爾茨海默病藥物方面相關研究報道。阿爾茨海默病，又稱老年癡呆(Alzheimer’ s Disease, AD)，是一種重要的神經退行性病變，是慢性進行性中樞神經系統(tǒng)變性病變所導致的癡呆，是最常見的老年期癡呆。AD 臨床特征表現(xiàn)為漸進性的記憶障礙、行為定向能力障礙、語言功能障礙、視空間功能障礙、 認知功能障礙以及人格變性等，進而影響日常生活能力、工作能力和社交能力。目前，全球大約有18，000, 000人罹患AD。隨著世界各國紛紛步入老齡化社會，AD患病人數也在與日俱增，AD已經成為繼心臟病、腫瘤和中風之后的人類第四大殺手。因此，提供黃芪甲苷在制備預防和治療阿爾茨海默病藥物中的新應用，對阿爾茨海默病的防治具有重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了黃芪甲苷的新應用，即黃芪甲苷在制備預防和治療阿爾茨海默病藥物中的應用。研究發(fā)現(xiàn)AD病理改變主要累及前腦、基底、海馬和大腦皮質等部位，以出現(xiàn)神經細胞外淀粉樣蛋白(extracellualar amyloid protein exposition)沉積或稱老年斑 (senile plaque，SP)、神經細胞內神經纖維纏結(neurofrbrillarytangles，NFT)以及神經元喪失(Neuronal loss)等為主要病理特征，其中淀粉樣蛋白斑塊的主要成分是β _淀粉樣蛋白(β amyloid protein，Αβ)。Αβ蛋白是淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)經由兩次酶切的產物，由于加工剪切過程的不同，A β蛋白主要有40和42兩種肽段長度形式，即A β 40和A β 42，在正常機體中以 Αβ40為主，而Αβ42僅約占Αβ總量的5 15%。APP蛋白翻譯后可經兩種途徑被加工剪切，第一種為非產淀粉樣蛋白途徑(non-amyloidogenic pathway), APP經由α -分泌酶 (α -secretase)剪切產生可溶性 α -APP (soluble APP α，sAPP α )和 C83 片段或 α -CTF s(a-C-terminalfragments)，后者再經Y -分泌酶剪切產生p3片段和AICD。由于α-分泌酶酶切位點位于Αβ蛋白區(qū)域內部，因此該途徑排除了 Αβ蛋白的產生。第二種為產淀粉樣蛋白途徑(amyloidogenic pathway)，APP 蛋白在 β -分泌酶(β -secretase, BACE1)酶切作用下產生可溶性 β -APP (soluble APP β，sAPP β )和 C99 片段或 β -CTFs ( β -C-terminal fragments)，后者由γ-分泌酶(y-secretase)剪切產生A β蛋白和APP胞內結構域(APP intracellular domain，AICD)。Y -分泌酶由于剪切位點不同，會產生40和42個氨基酸長度兩種形式的A β蛋白，即A β 40和A β 42，在AD腦部的淀粉樣蛋白斑塊中以A β 42為主。AD發(fā)病機制復雜，是多因素交互作用的結果。大量研究表明，多種因素參與了 AD 的病理過程，其中Αβ蛋白的過量累積被人視為是AD的核心病變。Αβ蛋白介導神經退行性病變的毒性，包括破壞線粒體功能、引起氧化應激影響突觸信號傳遞、破壞軸突運輸和膜結構等。本發(fā)明通過酶聯(lián)免疫吸附劑測定技術鑒定了所述黃芪甲苷對SH-SY5Y-APP695sw 轉基因細胞分泌Αβ蛋白的影響。結果顯示，黃芪甲苷劑量依賴的方式抑制 SH-SY5Y-APP695sw細胞中Αβ蛋白的分泌，其中20 μ M黃芪甲苷可以使SH_SY5Y_APP695sw 細胞Αβ 40和Αβ 42的分泌量分別減少58. 96士8. 65%和59. 60士9. 37%，表明黃芪甲苷具有抑制SH-SY5Y-APP695sw細胞中Aβ蛋白分泌的作用。本發(fā)明通過Western blot檢測技術鑒定了所述黃芪甲苷對APP蛋白加工剪切作用的影響。結果顯示，黃芪甲苷處理后sAPPii sw的分泌量減少了 58.9% 士6. 02%， SH-SY5Y-C99細胞經黃芪甲苷處理48hr后，Αβ的濃度沒有變化，表明黃芪甲苷具有抑制 β-分泌酶酶切的作用，而對Y-分泌酶的酶切作用沒有影響。黃芪甲苷通過抑制分泌酶酶切作用，干預APP的加工，進而降低A β的生成。因此本發(fā)明提供了黃芪甲苷在制備β -淀粉樣蛋白生成和分泌抑制劑中的應用。本發(fā)明通過Western blot檢測技術酶活檢測試劑盒檢測了所述黃芪甲苷對 β-分泌酶APP蛋白表達和酶活的影響。結果顯示，與對照相比20 μ M黃芪甲苷使成熟 BACEl和非成熟BACEl分別減少77. 22士4. 13%和58. 13士4. 09%。同時黃芪甲苷還以劑量依賴的方式抑制β-分泌酶酶活，20 μ M黃芪甲苷使β-分泌酶酶活降低65. 79 士 1.71%。 結果表明黃芪甲苷可抑制分泌酶的表達和分泌酶酶活性。因此本發(fā)明提供了黃芪甲苷在制備抑制分泌酶生成藥物中的應用。
本發(fā)明通過硫磺素T法測定黃芪甲苷對Αβ蛋白聚集體解聚作用。結果顯示，黃芪甲苷以劑量依賴的方式促進聚集態(tài)Αβ蛋白解聚，35μΜ黃芩苷使聚集態(tài)Αβ蛋白減少 54. 33 士 2.91%，結果表明黃芪甲苷可以促進寡聚化Αβ解聚，降低寡聚化Αβ蛋白毒性作用。因此本發(fā)明提供了黃芪甲苷在制備淀粉樣蛋白解聚劑中的應用。綜上所述，黃芪甲苷具有抑制5^￥5￥^ 6951細胞中4 0蛋白和β-分泌酶的分泌、β-分泌酶酶活性及β-分泌酶的酶切作用，進而抑制Αβ蛋白積累，同時黃芪甲苷可促進寡聚化Αβ降解，從而降低Αβ蛋白的毒性作用，達到預防和治療阿爾茨海默病的目的。因此本發(fā)明提供了黃芪甲苷在制備預防和治療阿爾茨海默病藥物中的應用。本發(fā)明還提供了一種預防或治療阿爾茨海默病的藥物制劑，由有效量的黃芪甲苷和藥學上可接受的輔料組成。本領域技術人員可將所述黃芪甲苷直接或間接加入制備不同劑型時所需的藥學上可接受的各種常用輔料，如崩解劑、潤滑劑、乳化劑、粘合劑等，以常規(guī)藥物制劑方法，制成預防或治療阿爾茨海默病的常用制劑如口服液、注射液、顆粒劑、片劑、 丸劑、散劑、膠囊劑、滴丸劑等。


圖1示實施例1黃芪甲苷對SH-SY5Y-APP695sw轉基因細胞A β 40蛋白分泌量影響的統(tǒng)計結果圖；圖2示實施例1黃芪甲苷對SH-SY5Y-APP695sw轉基因細胞A β 42蛋白分泌量影響的統(tǒng)計結果圖；圖3示實施例2黃芪甲苷對sAPP、sAPP α和sAPP β sw蛋白分泌量影響的Western blot檢測圖；圖4示實施例2黃芪甲苷對sAPP、sAPP α和sAPP β sw蛋白分泌量影響的統(tǒng)計結果圖；圖5示實施例2黃芪甲苷對Αβ 40蛋白分泌量影響的統(tǒng)計結果圖；圖6示實施例2黃芪甲苷對Αβ 42蛋白分泌量影響的統(tǒng)計結果圖；圖7示實施例3黃芪甲苷對SH-SY5Y-APP695sw轉基因細胞中β -分泌酶(BACEl) 蛋白表達影響的Western blot檢測圖；圖8示實施例3黃芪甲苷對SH-SY5Y-APP695sw轉基因細胞中β -分泌酶(BACEl) 蛋白表達影響的統(tǒng)計結果圖；圖9示實施例3黃芪甲苷對SH-SY5Y-APP695sw轉基因細胞中β -分泌酶(BACEl) 酶活影響的統(tǒng)計結果圖；圖10示實施例4黃芪甲苷對寡聚化Aβ蛋白解聚作用影響的統(tǒng)計結果圖。
具體實施例方式本發(fā)明實施例公開了黃芪甲苷在制備預防和治療阿爾茨海默病藥物中的應用。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
為了進一步理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。本發(fā)明中使用的黃芪甲苷購自中國藥品生物制品檢定所，HPLC檢測含量> 98%。實施例1 黃芪甲苷對SH-SY5Y-APP695sw轉基因細胞分泌A β蛋白的影響試驗材料SH-SY5Y-APP695sw轉基因細胞由北京師范大學教育部天然藥物工程研究中心保藏；黃芪甲苷購自中國藥品生物制品檢定所，HPLC檢測含量>98% ；G418購自 Ameresco 公司；細胞培養(yǎng)試劑、A β 40Colorimetric ELISA 試劑盒和 A β 42Colorimetric ELISA試劑盒購自hvitrogen公司。細胞培養(yǎng)SH-SY5Y-APP695sw轉基因細胞用含10 %胎牛血清、100U/mL青霉素、 100mg/L鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基在37°C，5% CO2，相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 在培養(yǎng)基中另加入500 μ g/mL G418以維持外源基因的表達。試驗方法將SH-SY5Y-APP695sw細胞以2. 5 X IO4細胞/mL接種于M孔板，培養(yǎng)至細胞融合率達到80 %，將培養(yǎng)液換成分別含5 μ M、10 μ M、20 μ Μ、35 μ Μ、50 μ M黃芪甲苷的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48hr。收集細胞培養(yǎng)液，用Amicon Ultra-0. 5mL超濾離心管濃縮培養(yǎng)液，ELISA測定Aβ 40和Αβ 42濃度，以不加黃芪甲苷處理的細胞為對照。試驗結果見圖1和圖2由圖1和2可見，黃芪甲苷可以劑量依賴的方式抑制SH-SY5Y-APP695sw細胞中 Aβ蛋白的分泌，其中2(^]\1黃芪甲苷可以使5!1-5￥5￥-六 6958 細胞40 40和40 42的分泌量分別減少 58. 96 士8. 65%和 59. 60 士9. 37%。實施例2黃芪甲苷對APP蛋白剪切作用的影響試驗材料SH-SY5Y-APP695sw和SH_SY5Y_C99轉基因細胞由北京師范大學教育部天然藥物工程研究中心保藏；黃芪甲苷購自中國藥品生物制品檢定所，HPLC檢測含量> 98% ；G418購自Ameresco公司，細胞培養(yǎng)試劑購自hvitrogen公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自賽馳生物技術公司；抗sAPPa單克隆抗體2B3、抗sAPPiisw單克隆抗體6A1和抗APP多克隆抗體購自IBL公司；抗總sAPP單克隆抗體22C11購自Millipore公司；抗 β -actin單克隆抗體C4購自Santa Cruz公司；Amersham ECL plus顯色試劑購自GE公司。細胞培養(yǎng)見實施例1。試驗方法將SH-SY5Y-APP695sw和SH-SY5Y-C99轉基因細胞以2 X IO5細胞/孔接種于6孔板，在含500 μ g/mL G418的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)至融合率為85%，換成含 20 μ M黃芪甲苷的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48hr。收集培養(yǎng)液，用Amicon 蛋白超濾濃縮管濃縮，-80°C保存。以BCA法測定樣品蛋白濃度，以確定上樣量。制備10% SDS-PAGE，濃縮膠濃度5%。100V電泳1. 5hr, 295mA轉膜1. 5hr0 PVDF膜用含5%脫脂奶粉的PBST封閉液封閉1 air。加入用封閉液稀釋的第一抗體4°C孵育過夜。PBST清洗膜4次，5min/次。 加入第二抗體，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠和羊抗兔IgG，室溫反應1. 5 池！·，進行ECL顯色，采用X光片曝光，掃描后圖像用Image J軟件(NIH image, MD)分析。以不加黃芪甲苷處理的細胞為對照。試驗結果圖3 6。如圖3和圖4所示，黃芪甲苷處理前后對sAPPa和sAPP水平沒有明顯變化， 但sAPP β sw的分泌量減少了 58.9% 士 6. 02%，表明黃芪甲苷不影響α-分泌酶，而抑制 β -分泌酶的酶切作用。如圖5和6所示SH-SY5Y-C99細胞經5 μ Μ、10 μ Μ、20 μ Μ.35 μ Μ、50 μ M的黃芪甲苷處理48hr后，A β的濃度沒有變化，表明黃芪甲苷對分泌酶的酶切作用沒有影響。由此可見，黃芪甲苷可抑制β-分泌酶干預APP的加工，進而降低A β的生成。實施例3.黃芪甲苷對SH-SY5Y-APP695sw轉基因細胞中β -分泌酶(BACEl)蛋白表達和酶活的影響試驗材料SH-SY5Y-APP695sw轉基因細胞由北京師范大學教育部天然藥物工程研究中心保藏；黃芪甲苷購自中國藥品生物制品檢定所，HPLC檢測含量> 98% ；抗BACEl 多克隆抗體購自Merck公司、抗β -actin單克隆抗體C4購自Santa Cruz公司；Amersham ECL plus顯色試劑購自GE公司；β -分泌酶酶活測定試劑盒購自Biovision公司；酶標儀 (Thermo Labsystems Multiskan MK3 型)。試驗方法β -分泌酶(BACEl)蛋白表達測定將SH-SY5Y_APP695sw細胞以2X IO5細胞/孔接種于6孔板，在含500 μ g/mL G418的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)至融合率為85%，換成含 20 μ M黃芪甲苷的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48hr，提取細胞蛋白，以BCA法測定樣品蛋白濃度，以確定上樣量。制備10% SDS-PAGE,以實施例2方法進行flfestern blot檢測。β-分泌酶(BACEl)酶活測定SH-SY5Y_APP695sw細胞以2Χ IO5細胞/孔接種于6 孔板，在含500 μ g/mL G418的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)至融合率為85%，換成含20 μ M黃芪甲苷的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48hr，提取細胞蛋白，采用β-secretase Activity Assay Kit (Biovision Research)，測定細胞中β -分泌酶酶活，具體操作參照試劑盒說明書進行。 結果見圖7 9。由圖7和圖8可見，Western blot檢測顯示，與對照相比20 μ M黃芪甲苷使成熟 BACEl和非成熟BACEl分別減少77. 22士4. 13%和58. 13士4. 09%。由圖9可見，酶活測定結果顯示，黃芪甲苷以劑量依賴的方式抑制分泌酶酶活，20μΜ黃芪甲苷使β-分泌酶酶活降低65. 79士 1.71%。結果表明黃芪甲苷可抑制β-分泌酶的表達和β-分泌酶酶活性，從而抑制β -分泌酶生成。實施例4黃芪甲苷對寡聚化A β蛋白解聚作用的影響試驗材料黃芪甲苷購自中國藥品生物制品檢定所，HPLC檢測含量> 98% ；硫磺素T禾口 A β 42購自Sigma公司。試驗方法采用硫磺素T法測定黃芪甲苷對A β蛋白聚集體解聚作用。A β 聚集Img 的固體 A β 42 溶于 anL PBS (pH = 7. 4)中，得 0. 5mg/mL 的 A β 溶液，再向Aβ溶液中加入EDTA溶液至終濃度為1福，371，3001~1^，孵育72虹，將4 0溶液稀釋5倍，_80°C冰箱中保存待用。硫磺素T配制將硫磺素T固體溶于PBS (pH = 7. 4)中，配成300 μ M的硫磺素T 溶液，4°C保存?zhèn)溆?。藥物作用取黃芪甲苷溶液2uL于Ep管中，再加入20uLAi3稀釋液，充分混勻后， 37°C，300rmp，孵育30min。同時，在另一個Ep管中單獨加2uLPBS和20uLA β稀釋液作為空白對照。硫磺素T處理取適量配好的300uM的硫磺素T，用PBS (pH = 7. 4)稀釋到3uM。 取1500uL的3uM的四氫噻吩(Tht)于新的Ep管中，分別加入15uL藥物共孵育和未共孵育的Αβ樣品，充分混勻。熒光檢測將上述混合液室溫下孵育30min，取325uL樣品于比色皿中，將比色皿擦拭干凈，用熒光分光光度計(RF-5301PC，日本島津公司)測量，激發(fā)波長442. Onm，發(fā)射波長450. Onm，測量范圍是起始460. OOOnm，終止700. OOOnm。結果見圖10。由圖10可見，黃芪甲苷以劑量依賴的方式促進聚集態(tài)A β蛋白解聚，35 μ M黃芩苷使聚集態(tài)Αβ蛋白減少Μ. 33士2. 91%，結果表明黃芪甲苷可以通過促進寡聚化Αβ解聚， 降低寡聚化Αβ蛋白毒性作用。綜上所述，黃芪甲苷具有抑制5^￥5￥^ 6951細胞中4 0蛋白和β-分泌酶的分泌、β-分泌酶酶活性及β-分泌酶的酶切作用，進而抑制Αβ蛋白積累，同時黃芪甲苷可促進寡聚化Αβ降解，從而降低Αβ蛋白的毒性作用，達到預防和治療阿爾茨海默病的目的。以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。
權利要求
1.黃芪甲苷在制備預防和治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
2.黃芪甲苷在制備淀粉樣蛋白生成和分泌抑制劑中的應用。
3.黃芪甲苷在制備抑制分泌酶生成藥物中的應用。
4.黃芪甲苷在制備淀粉樣蛋白解聚劑中的應用。
5.一種預防或治療阿爾茨海默病的藥物制劑，其特征在于，由有效量的黃芪甲苷和藥學上可接受的輔料組成。
6.根據權利要求5所述藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑為口服液、顆粒劑、片劑、 丸劑、散劑、膠囊劑或滴丸劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及中醫(yī)藥領域，公開了黃芪甲苷在制備預防和治療阿爾茨海默病藥物中的應用。試驗表明，黃芪甲苷具有抑制SH-SY5Y-APP695sw細胞中Aβ蛋白和β-分泌酶的分泌、β-分泌酶酶活性及β-分泌酶的酶切作用，進而抑制Aβ蛋白積累。同時試驗表明，黃芪甲苷可促進寡聚化Aβ降解，從而降低Aβ蛋白的毒性作用，達到預防和治療阿爾茨海默病的目的，因此本發(fā)明提供了黃芪甲苷在制備預防和治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
文檔編號A61P25/28GK102389438SQ20111018369
公開日2012年3月28日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權日2011年6月30日
發(fā)明者張文生, 馬濤 申請人:北京師大科技園科技發(fā)展有限責任公司, 北京師范大學