国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      夾心外膜蛋白展示載體及應(yīng)用其制備的大腸埃希菌疫苗的制作方法

      文檔序號:865022閱讀:261來源:國知局
      專利名稱:夾心外膜蛋白展示載體及應(yīng)用其制備的大腸埃希菌疫苗的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種夾心外膜蛋白展示載體及應(yīng)用其制備的大腸埃希菌疫苗。
      背景技術(shù)
      腸出血性大腸埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)是一種重要的病原菌,主要包括0157:H7、C^6:H11和0111等數(shù)種血清型。其中,E. coli 0157:H7 導(dǎo)致的感染占EHEC感染的50% 80%。E. coli 0157:H7感染能引起人的出血性結(jié)腸炎 (Hemorrhagic colitis,HC)、闌尾炎、食管狹窄和結(jié)腸穿孔等嚴(yán)重的胃腸道并發(fā)癥。10% E. coli 0157:H7感染病例,特別是兒童和老年人,還可引起致死性的溶血性尿毒綜合征 (Haemolytic uraemic syndrome,HUS)等全身性并發(fā)癥。近年來,E. coli 0157:H7 的暴發(fā)流行在世界各地時(shí)有發(fā)生,尤其在日本、美國、英國等地。我國江蘇、安徽等地1999、2001年也相繼發(fā)生了 E. coli 0157:H7感染的暴發(fā)流行,患者超過兩萬人。統(tǒng)計(jì)顯示,90%的E. coli 0157:H7感染病例是散發(fā),實(shí)際上反映了未被識別的暴發(fā)流行,或在眾多隱性感染者中存在低強(qiáng)度流行。近期發(fā)生的歐洲腸道傳染病疫情危害凸顯,2011年5月1日德國出現(xiàn)第一例病例,一個(gè)多月來,一場罕見的、帶有強(qiáng)毒性的0104:H4型腸出血性大腸桿菌(EHEC)疫情席卷了歐洲很多國家。世界衛(wèi)生組織(WH0)15日發(fā)布的疫情通報(bào)稱,感染人數(shù)達(dá)3343人,感染者中有823人出現(xiàn)了溶血性尿毒綜合征(HUQ癥狀,37人死亡。EHEC感染是一種新發(fā)的危害嚴(yán)重的食物源性腸道傳染病和人畜共患病。目前普遍認(rèn)為受污染家畜及食物是該病的主要傳染源,并且普遍存在毒素與活菌的共同感染。抗生素的使用會(huì)導(dǎo)致更多毒素的分泌而不被推薦臨床治療采用。因此,控制該病暴發(fā)流行的最好措施是疫苗免疫,目的是預(yù)防人的原發(fā)感染和在已感染患者中防止嚴(yán)重并發(fā)癥的出現(xiàn)。0157 H7與新發(fā)現(xiàn)的0104 H4型等EHEC病原菌的一個(gè)重要的特征性毒力因子是志賀毒素(Shiga toxins, Stxs) ο Stxs是導(dǎo)致EHEC感染病人出現(xiàn)HC、HUS的主要原因。臨床與試驗(yàn)研究認(rèn)為,針對E. coli 0157:H7感染,常規(guī)的抗生素治療會(huì)導(dǎo)致菌體裂解、Stxs瀑流釋放,增加發(fā)生HUS的風(fēng)險(xiǎn)13. 4倍。Mxs包括Mxl和兩個(gè)亞型,具有不同的抗原表位,但具有相同的分子結(jié)構(gòu)及受體,毒性機(jī)理也相似。完整毒素均呈現(xiàn)1A:5B結(jié)構(gòu)。A亞單位具有細(xì)胞內(nèi)毒性,能發(fā)揮RNA糖苷酶的活性,特異裂解^S rRNA,從而抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。B亞單位能特異結(jié)合球丙糖酰基鞘氨醇(( 或者球丁糖?;拾贝?Λ4)受體,從而引導(dǎo)A亞單位發(fā)揮作用。有研究認(rèn)為,Stx2毒性要強(qiáng)于Mxl,更相關(guān)于 HUS0鑒于Mxs在誘發(fā)感染性系統(tǒng)并發(fā)癥中的關(guān)鍵作用,Stxs也是預(yù)防感染性HUS的核心靶點(diǎn)之一。目前臨床對于EHEC感染仍缺乏有效的防治辦法,只能給予對癥治療和適當(dāng)?shù)目咕委煛R虼?,設(shè)計(jì)一種新型疫苗,能夠?qū)⒅匾玖ο嚓P(guān)的非膜保護(hù)性抗原進(jìn)行展示或遞送,使多組分抗原共提呈給宿主,就有望提供更為有效和全面的免疫保護(hù)。細(xì)菌菌蛻(bacterial ghost, BG)是一種最新發(fā)展起來的生物傳遞系統(tǒng)。細(xì)菌菌蛻是革蘭陰性細(xì)菌被噬菌體phiX174的裂解基因E裂解后形成的完整細(xì)菌空殼。其形成是通過對裂解基因E的嚴(yán)格表達(dá)調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。BG的形成主要依賴于裂解蛋白E在細(xì)胞膜上的跨膜孔道作用,胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)和核酸成分在滲透壓的作用下經(jīng)跨膜孔道被排出,形成一個(gè)只含有細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的空細(xì)菌體。BG兼顧了組合抗原免疫原性、佐劑效應(yīng)、靶向性載體的作用,既能攜帶外源抗原,又能同時(shí)遞送核酸和其他藥物,特別適合于粘膜免疫及口服免疫及滴鼻免疫,并適宜大規(guī)模生產(chǎn)。同時(shí),由于菌蛻缺乏遺傳物質(zhì),消除了耐藥基因或毒力島基因的水平轉(zhuǎn)移等引起的潛在危害。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的是提供一種夾心外膜蛋白展示載體及應(yīng)用其制備的大腸埃希菌疫
      田ο本發(fā)明提供的融合蛋白,為融合蛋白甲或融合蛋白乙;所述融合蛋白甲自N端至C端依次包括如下片段序列表的序列2自N末端第1 至136位氨基酸殘基組成的片段甲、序列表的序列2自N末端第512位至634位氨基酸殘基組成的片段乙和序列表的序列2第635至7 位氨基酸殘基組成的片段丙;所述融合蛋白乙為在所述融合蛋白甲的所述片段甲和所述片段乙之間插入外源蛋白得到的融合蛋白。所述片段甲和所述片段乙組成OmpA N端片段。所述片段丙即為OmpA C端片段。所述外源蛋白的氨基酸序列可如序列表的序列4(即序列表的序列2自N末端第 139至509位氨基酸殘基)所示(SAmB蛋白)。所述融合蛋白乙優(yōu)選為序列表的序列2所示的蛋白。所述融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述片段甲的編碼基因具體可如序列表的序列1自5’末端第1至408位核苷酸所示(即序列表的序列3中自5’末端第1至408位核苷酸)。所述片段乙的編碼序列具體可如序列表的序列1自5’末端第457至825位核苷酸所示(即序列表的序列3中自5’末端第1534至1902位核苷酸)。所述片段丙的編碼序列具體可如序列表的序列1自5’末端第擬6至1104位核苷酸所示(即序列表的序列3中自5’末端第1903-2181位核苷酸)。所述外源蛋白的編碼基因優(yōu)選為序列表的序列5所示的DNA分子(即序列表的序列3中自5’末端第415至1527位核苷酸)(SAmB基因)。所述融合蛋白乙的編碼基因優(yōu)選為序列表的序列3所示的DNA分子。含有所述基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體具體可為在pGEX載體(如pGEX-KG載體)的多克隆位點(diǎn)插入以上任一所述基因得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體優(yōu)選為將序列表的序列1所示DNA 或序列表的序列3所示DNA插入pGEX-KG載體的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。所述重組菌具體可為如下(a)或(b)(a)含有以上任一所述重組表達(dá)載體的細(xì)菌;(b)含有以上任一所述重組表達(dá)載體并表達(dá)裂解酶的細(xì)菌;所述裂解酶的氨基酸序列如序列表的序列6所示。所述(a)中,所述細(xì)菌優(yōu)選為大腸桿菌,最優(yōu)選為腸出血性大腸桿菌0157:H7(如EDL933 菌株)。所述(b)中,所述表達(dá)裂解酶的細(xì)菌優(yōu)選為含有溫控裂解質(zhì)粒P-LysisE的大腸桿菌,所述大腸桿菌優(yōu)選為腸出血性大腸桿菌0157 :H7 (如EDL933菌株)。以上任一所述的重組菌的菌蛻也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述菌蛻菌體具體可通過如下方法制備得到將所述重組菌培養(yǎng)至0D_為 0.3,然后加入IPTG(在菌液中的初始濃度為ImM) 200rpm培養(yǎng)至OD6tltl約為0.6 ;升溫至 42°C,收集42°C培養(yǎng)1小時(shí)的菌液,5000 Xg離心15min收集沉淀,即為菌蛻。所述融合蛋白、所述基因、所述重組表達(dá)載體或所述重組菌可用于制備細(xì)菌菌蛻。 所述細(xì)菌了可為大腸桿菌(E.coli)。所述大腸桿菌可為腸出血性大腸桿菌0157:H7,所述大腸桿菌具體可為腸出血性大腸桿菌0157:H7 EDL933或腸出血性大腸桿菌88321。本發(fā)明還保護(hù)一種細(xì)菌疫苗,它的活性成分為以上任一所述菌蛻。所述細(xì)菌了可為大腸桿菌(E.coli)。所述大腸桿菌可為腸出血性大腸桿菌0157:H7,所述大腸桿菌具體可為腸出血性大腸桿菌0157:H7 EDL933或腸出血性大腸桿菌88321。本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述菌蛻在制備細(xì)菌疫苗中的應(yīng)用。所述細(xì)菌了可為大腸桿菌(E.coli)。所述大腸桿菌可為腸出血性大腸桿菌0157:H7,所述大腸桿菌具體可為腸出血性大腸桿菌0157:H7 EDL933或腸出血性大腸桿菌88321。相比0157:H7菌蛻,0157:H7嵌合菌蛻由于展示了 Stx毒素抗原,其免疫血清能產(chǎn)生特異的抗Stx2A和StxlB抗體。0157:H7嵌合菌蛻誘導(dǎo)的血清抗體具有中和Stx毒素的功能,因此,其免疫血清能有效抵抗致死劑量的裂解菌攻擊O LD50,保護(hù)率73.3%)。 0157 H7嵌合菌蛻免疫小鼠的腸灌洗液抗intimin特異抗體效價(jià)顯著高于0157 H7菌蛻,說明OSAmB菌蛻表面intimin的免疫原性有所增強(qiáng)。0157 :H7嵌合菌蛻免疫小鼠比0157: H7菌蛻(12% )更好的保護(hù)小鼠(52% )抵抗高致死劑量大腸桿菌0157:H7活菌的灌胃攻擊。一方面可能是更高效價(jià)的intimin抗體更好的阻斷了大腸桿菌0157 :H7病原菌對腸道的黏附,另一方面可能是抗^xs特異抗體能中和灌胃菌裂解產(chǎn)生的^xs毒素,有效的減少了毒素對機(jī)體產(chǎn)生的損傷。進(jìn)一步的病理結(jié)果揭示了腹腔裂解菌攻毒的主要致死作用在于毒素效應(yīng)(腎損傷),而更接近于正常感染途徑的灌胃攻毒除了腎組織外,還產(chǎn)生了嚴(yán)重的黏附擦拭損傷(腸道損傷)。因此,只有采用既能抗病原菌黏附,又能抗毒素攻擊的0157:H7嵌合菌蛻免疫小鼠才能更全面、更有效保護(hù)小鼠抵抗大腸桿菌0157:H7病原菌的感染。本發(fā)明以夾心外膜蛋白A(融合蛋白甲)作為展示載體,將重要的E.coli 0157:H7 非膜毒素保護(hù)性抗原(SAmB蛋白)在E.coli 0157:H7細(xì)菌外膜上錨定表達(dá)。以細(xì)菌菌蛻為傳遞系統(tǒng),E.coli 0157:H7原有膜表面抗原與新的展示抗原就可以一起提呈給免疫細(xì)胞, 在預(yù)防細(xì)菌腸道定植以及抗毒素方面共同發(fā)揮作用,以誘導(dǎo)更全面的免疫保護(hù)。


      圖1為夾心OmpA載體特異DNA片段的電泳圖;1 :PCR產(chǎn)物;M =DNA標(biāo)志物。圖2為插入SAmB基因后的夾心OmpA載體特異DNA片段的電泳圖;M =DNA標(biāo)志物; 1 連接產(chǎn)物。圖3為重組菌的PCR鑒定電泳圖;M. DNA標(biāo)志物;1 溫控裂解質(zhì)粒特異引物對鑒定;2 重組質(zhì)粒pOSAmB特異引物對鑒定。圖4為0157 :H7嵌合菌蛻的免疫反應(yīng)性;A :0157 :H7嵌合菌蛻與抗Stx2A兔血清的免疫反應(yīng)性;B :0157 :H7嵌合菌蛻與抗StxlB雞IgY的免疫反應(yīng)性;1 =OSAmB嵌合菌蛻; 2 :0157 :H7菌蛻;3 :0mpA載體缺失對照菌蛻;4 :Stx2A(A) ^StxlB(B) ;M 低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物。圖5為0157 :H7嵌合菌蛻外膜展示蛋白的鑒定;A :0157 :H7嵌合菌蛻外膜展示蛋白的抗Mx2A兔血清鑒定;B :0157 :H7嵌合菌蛻外膜展示蛋白的抗MxlB雞IgY鑒定;C 0157 :H7嵌合菌蛻外膜展示蛋白的抗intimin兔血清鑒定;OSAmB代表0157 :H7嵌合菌蛻; non-OmpA代表OmpA載體缺失菌蛻;B(is代表0157 :H7菌蛻。圖6為0157 :H7嵌合菌蛻的細(xì)胞毒效應(yīng)(* =P > 0. 05 vs non-OmpA) ;RBGs代表 0157 :H7嵌合菌蛻;non-OmpA代表OmpA載體缺失菌蛻;0157:H7代表病原菌。圖7為0157 :H7嵌合菌蛻免疫小鼠誘導(dǎo)抗菌蛻特異抗體水平監(jiān)測(* =P < 0. 01 vs PBS ;# =P < 0. 01 vs PBS ;** =P < 0. 01 ’## :P < 0. 05) ;A 血清中 IgA特異抗體效價(jià);B 腸灌洗液中IgA特異抗體效價(jià);C 血清中IgG特異抗體效價(jià);D 腸灌洗液中IgG特異抗體效價(jià);RBk代表0157 :H7嵌合菌蛻;non-OmpA代表OmpA載體缺失菌蛻;PBS代表磷酸鹽緩沖液。圖8為0157 :H7嵌合菌蛻免疫小鼠誘導(dǎo)抗Mxl特異抗體水平監(jiān)測(* =P < 0. 01 vs PBS ;# =P > 0. 05 vs PBS ;## =P > 0. 05 vs PBS) ;A 血清中 IgA 特異抗體效價(jià);B 腸灌洗液中IgA特異抗體效價(jià);C 血清中IgG特異抗體效價(jià);D 腸灌洗液中IgG特異抗體效價(jià); RBGs代表0157 :H7嵌合菌蛻;non-OmpA代表OmpA載體缺失菌蛻;PBS代表磷酸鹽緩沖液。圖9為0157 :H7嵌合菌蛻OSAmB免疫小鼠誘導(dǎo)抗特異抗體水平監(jiān)測(* =P
      <0. Olvs PBS ;# :P > 0. 05vs PBS ;## :P > 0. 05 vs PBS) ;A :血清中 IgA 特異抗體效價(jià); B 腸灌洗液中IgA特異抗體效價(jià);C 血清中IgG特異抗體效價(jià);D 腸灌洗液中IgG特異抗體效價(jià);RB(is代表0157 :H7嵌合菌蛻;non-OmpA代表OmpA載體缺失菌蛻;PBS代表磷酸鹽緩沖液。圖10為0157: H7嵌合菌蛻免疫小鼠抵抗病原菌(大腸桿菌0157: H7 EDL933)灌胃途徑攻擊的生存率;A IO9CFU大腸桿菌0157:H7 EDL933 (相當(dāng)于100 LD50) ;B 5 X IO9CFU 大腸桿菌 0157 :H7 EDL933 (相當(dāng)于 500 LD50) ;* :P < 0. 01 vs PBS ;** :P < 0. Olvs non-OmpA ;# :P < 0. 01 vs PBS ;## :P > 0. 05 vs non-OmpA ;RBGs 代表 0157 :H7 嵌合菌蛻; non-OmpA代表OmpA載體缺失菌蛻;PBS代表磷酸鹽緩沖液。圖11為0157:H7嵌合菌蛻免疫小鼠抵抗裂解病原菌(大腸桿菌0157:H7 88321)腹腔途徑攻擊的生存率;A 2 LD50大腸桿菌0157:H7 88321 ;B 5 LD50大腸桿菌 0157:H788321 ;* :P < 0. 01 vs PBS ;** :P < 0. 01 vs non-OmpA. RB(is 代表 0157 :H7 嵌合菌蛻;non-OmpA代表OmpA載體缺失菌蛻;PBS代表磷酸鹽緩沖液。圖12為0157:H7嵌合菌蛻免疫血清體外中和裂解病原菌(大腸桿菌0157:H7 88321)效應(yīng);A :2 LD50 大腸桿菌 0157:H7 88321 ;B 5 LD50 大腸桿菌 0157:H7 88321 ;* :P
      <0. 01 vs PBS ;** :P < 0. 01 vs non-OmpA. RBGs 代表 0157 :H7 嵌合菌蛻;non-OmpA 代表 OmpA載體缺失菌蛻;Bk代表0157 :H7菌蛻;PBS代表磷酸鹽緩沖液。圖13為小鼠病理組織H&E染色;A 正常小鼠;B 大腸桿菌0157:H7 EDL933活菌灌胃攻擊保護(hù)小鼠;C 大腸桿菌0157:H7 88321腹腔攻擊保護(hù)小鼠;D 大腸桿菌0157:H7 EDL933活菌灌胃攻擊死亡小鼠;E 大腸桿菌0157:H7 88321腹腔攻擊死亡小鼠。
      具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明,但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料,如無特殊說明,均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn),均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果取平均值。表1嵌合菌蛻構(gòu)建所用引物(下劃線序列為限制性酶切位點(diǎn))
      權(quán)利要求
      1.融合蛋白,為融合蛋白甲或融合蛋白乙;所述融合蛋白甲自N端至C端依次包括如下片段序列表的序列2自N末端第1至136位氨基酸殘基組成的片段甲、序列表的序列2 自N末端第512位至634位氨基酸殘基組成的片段乙和序列表的序列2第635至7 位氨基酸殘基組成的片段丙;所述融合蛋白乙為在所述融合蛋白甲的所述片段甲和所述片段乙之間插入外源蛋白得到的融合蛋白。
      2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白,其特征在于所述外源蛋白的氨基酸序列如序列表的序列4所示。
      3.權(quán)利要求1或2所述融合蛋白的編碼基因。
      4.如權(quán)利要求3所述的編碼基因,其特征在于所述片段甲的編碼基因如序列表的序列1自5’末端第1至408位核苷酸所示;所述片段乙的編碼序列如序列表的序列1自5’ 末端第457至825位核苷酸所示;所述片段丙的編碼序列如序列表的序列1自5’末端第擬6至1104位核苷酸所示。
      5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
      6.如權(quán)利要求5所述的重組菌,其特征在于所述重組菌為如下(a)或(b)(a)含有所述重組表達(dá)載體的細(xì)菌;(b)含有所述重組表達(dá)載體并表達(dá)裂解酶的細(xì)菌;所述裂解酶的氨基酸序列如序列表的序列6所示。
      7.權(quán)利要求5或6所述的重組菌的菌蛻。
      8.權(quán)利要求1或2所述融合蛋白、權(quán)利要求3或4所述基因、或權(quán)利要求5或6所述重組表達(dá)載體或重組菌在制備細(xì)菌菌蛻中的應(yīng)用。
      9.一種細(xì)菌疫苗,它的活性成分為權(quán)利要求7所述菌蛻;或,權(quán)利要求7所述菌蛻在制備細(xì)菌疫苗中的應(yīng)用。
      10.如權(quán)利要求9所述的細(xì)菌疫苗或所述的應(yīng)用,其特征在于所述細(xì)菌為大腸桿菌。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種夾心外膜蛋白展示載體及應(yīng)用其制備的大腸埃希菌疫苗。本發(fā)明提供了兩種融合蛋白,為融合蛋白甲或融合蛋白乙;所述融合蛋白甲自N端至C端依次包括如下片段序列表的序列2自N末端第1至136位氨基酸殘基組成的片段甲、序列表的序列2自N末端第512位至634位氨基酸殘基組成的片段乙和序列表的序列2第635至726位氨基酸殘基組成的片段丙;所述融合蛋白乙為在所述融合蛋白甲的所述片段甲和所述片段乙之間插入外源蛋白得到的融合蛋白。將本發(fā)明的融合蛋白的編碼基因?qū)爰?xì)菌,可以得到重組菌。該重組菌的菌蛻可以作為細(xì)菌疫苗,該細(xì)菌疫苗不含有細(xì)菌的基因組,但含有所述融合蛋白,安全且效果良好。
      文檔編號A61P31/04GK102286106SQ20111019271
      公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月11日
      發(fā)明者侯曉軍, 李濤, 王慧, 王琴, 蔡昆 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1