專利名稱：一種制備用于體內(nèi)遞送藥理活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒的方法，屬于藥理活性物質(zhì)的體內(nèi)遞送及其臨床應(yīng)用領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明是一種藥理活性物質(zhì)包裹進(jìn)入轉(zhuǎn)鐵蛋白，從而形成納米粒。
背景技術(shù)：
靜脈注射給藥能夠快速直接地作用于機(jī)體。為了降低靜脈注射給藥的副作用，有效的方法之一就是將藥理活性物質(zhì)包入微米或納米級的粒子中。一方面，靜脈注射的粒子可以緩釋藥理活性物質(zhì)并延長藥理活性物質(zhì)的半衰期；另一方面，靶向材料可以將粒子中的藥理活性物質(zhì)靶向地釋放。在現(xiàn)有技術(shù)涉及的蛋白粒子的制備方法中，如Abraxane 的制備方法(美國專利 No. 6，749，868，美國專利No. 5，560，933)，將蛋白溶液與有機(jī)溶劑均勻混合形成乳化液，高壓勻漿，形成以紫杉醇為核心的轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒。除了這種制備方法比較復(fù)雜之外，還需要用高壓及相應(yīng)的高溫來去除有機(jī)溶劑，從而獲得納米粒。二氯甲烷，乙腈等有機(jī)溶劑具有毒性，需要控制其殘留量。此外，這些方法包載藥理活性物質(zhì)的能力是有限的。同時，由于制備過程中的高壓和剪切力，蛋白和多肽還可能失去生物活性。蛋白粒子還被眾多文獻(xiàn)報道作為藥理活性物質(zhì)和診斷試劑的載體。其中，轉(zhuǎn)鐵蛋白微球可以用熱交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)的方法來制備。熱交聯(lián)微球是在100 150°C下從乳化混合物(如轉(zhuǎn)鐵蛋白、需包載的藥理活性物質(zhì)和適當(dāng)?shù)挠拖?中制備。然后微球用適當(dāng)?shù)娜軇┫礈觳⒈４?。Leucuta等報道了熱交聯(lián)微球的制備方法[International Journal of Pharmaceutics Vol. 41 :213-217 (1988)]；化學(xué)交聯(lián)微球的制備，如文獻(xiàn)[Science Vol. 213 :233-235 (1981)]所報道，用戊二醛交聯(lián)蛋白，然后洗滌并保存?，F(xiàn)有技術(shù)中蛋白納米粒的制備方法很難保持蛋白的生物活性。同時，白蛋白作為納米粒的衣材，其本身不具有靶向性，不能將藥物靶向的遞送到腫瘤組織。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的在于提供一種制備用于體內(nèi)遞送藥理活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒的方法，以解決某些藥理活性物質(zhì)由于其疏水的性質(zhì)而導(dǎo)致無法體內(nèi)遞送，以及形成藥物的靶向遞送問題。為了實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種制備用于體內(nèi)遞送藥理活性物質(zhì)的蛋白納米粒的方法，包括以下步驟(a) 第一種溶劑溶解轉(zhuǎn)鐵蛋白；(b)在二硫蘇糖醇的條件下將藥理活性物質(zhì)加入步驟(a)中所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液中，把藥理活性物質(zhì)包入蛋白，形成蛋白納米粒。本發(fā)明技術(shù)方案中所述的蛋白納米粒平均粒徑為5 2000nm，優(yōu)化的為25 500nm，最優(yōu)的為50 300nm。
本發(fā)明技術(shù)方案中所述的蛋白納米?？砂d占蛋白納米?？傊亓?40%的藥理活性物質(zhì)。本發(fā)明技術(shù)方案所述的藥理活性物質(zhì)是疏水性藥理活性物質(zhì)，如抗腫瘤藥物，心血管藥物，抗炎藥物，降糖藥物，中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物，免疫抑制藥物，以及抗病毒藥物。其中，所述的疏水性藥理活性物質(zhì)是紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、 卡莫司汀、阿霉素、苯芥膽留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黃酸、冬凌草甲素、鬼臼毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非諾貝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚美辛、吡羅昔康、格列本脲、 地西泮、利哌利酮、齊拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韋、利托那韋、Telaprevir (CAS號 4(^957-28-2)、洛匹那韋、或它們的組合。本發(fā)明技術(shù)方案所述的藥理活性物質(zhì)是親水性藥理活性物質(zhì)。其中，所述的親水性藥理活性物質(zhì)是環(huán)磷酰胺、博萊霉素、道諾霉素、表柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶或其類似物、鉬或其類似物、長春堿或其類似物、高三尖杉酯堿或其衍生物、放線菌素-D、絲裂霉素-C、依托泊苷、或它們的組合。本發(fā)明技術(shù)方案所述的步驟(a)的第一種溶劑是水或者生理鹽水。下面是對本發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步描述除上述總的技術(shù)方案以外，本發(fā)明進(jìn)一步提出了一種制備用于體內(nèi)遞送疏水性藥理活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)鐵納米粒制備方法，所述方法包含以下幾個步驟(a)用第一種溶劑溶解所述蛋白獲得蛋白溶液；(b)在二硫蘇糖醇存在的條件下，將疏水性藥理活性物質(zhì)加入步驟(a)中所述的蛋白溶液，把藥理活性物質(zhì)包入蛋白。形成的納米粒平均粒徑為5 500nm， 可包載占粒子總重量約1 40%的疏水性藥理活性物質(zhì)。這里的疏水性藥理活性物質(zhì)可以包括但不局限于紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、卡莫司汀、阿霉素、苯芥膽留醇、哌泊舒凡、 他莫昔芬、洛莫司汀、藤黃酸、冬凌草甲素、鬼日毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非諾貝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚美辛、吡羅昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齊拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韋、利托那韋、Telaprevir、洛匹那韋，以及它們的組合。其中，所述的納米粒子的平均直徑優(yōu)選為25nm 500nm ；最優(yōu)為50nm 300nm。對本發(fā)明所述技術(shù)方案的說明本發(fā)明所述的“納米?！保傅氖切〉膯挝?，而在轉(zhuǎn)運和性質(zhì)方面特指為一個整體。 本發(fā)明所制備的蛋白納米粒平均粒徑分布于5nm到2000nm之間。一個更好的區(qū)間是25nm 到500nm，再一個更好的區(qū)間是50nm到300nm。而且，本發(fā)明所制備的納米粒能夠結(jié)合高達(dá) 40%的藥理活性物質(zhì)。本發(fā)明中所述的將藥理活性物質(zhì)包入蛋白，指的是藥理活性物質(zhì)可以進(jìn)入蛋白中心區(qū)域。一般來說，藥理活性物質(zhì)包括在給病人服用時，能夠產(chǎn)生藥理反應(yīng)的任何的物質(zhì)。 本發(fā)明中的藥理活性物質(zhì)包括疏水和親水的化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚疏水性藥理活性物質(zhì)的水溶性不好，親水性藥理活性物質(zhì)能夠優(yōu)化的溶解在水中。疏水性的藥理活性物質(zhì)包括如下的化合物，但是不僅僅限于此抗腫瘤藥物，心血管藥物，抗炎藥物，降糖藥物， 中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物，免疫抑制藥物，以及抗病毒藥物。本發(fā)明涉及的疏水性藥理活性物質(zhì)可以包括，但是不僅僅局限于此紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、卡莫司汀、阿霉素、苯芥膽留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黃酸、 冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非諾貝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚美辛、吡羅昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齊拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韋、利托那韋、 Telaprevir、洛匹那韋，以及它們的組合。更優(yōu)化的說，具有藥理活性的疏水性物質(zhì)包括抗腫瘤藥理活性物質(zhì)如紫杉醇，多西紫杉醇，伊立替康，卡氯芥，阿霉素，膽留醇對苯乙酸氮芥，哌泊舒凡，他莫昔芬，環(huán)己亞硝脲，藤黃酸，冬凌草素甲，鬼白毒素以及它們的衍生物，以及它們的組合。在一個更優(yōu)化的范圍中，疏水性藥理活性物質(zhì)包括紫杉醇和多西紫杉醇。上述的藥理活性物質(zhì)包括晶體形式和無定形形式，其晶體形式包括帶有結(jié)晶水和不帶有結(jié)晶水的形式。本發(fā)明所涉及的藥理活性物質(zhì)還包括親水性物質(zhì)。親水性物質(zhì)可以包括如下化合物，但是不僅僅局限于此環(huán)磷酰胺、博萊霉素、道諾霉素、表柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶及其類似物、鉬及其類似物、長春堿及其類似物、 高三尖杉酯堿及其衍生物、放線菌素-D，絲裂霉素-C，依托泊苷以及它們的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明中使用的藥理活性物質(zhì)的量會根據(jù)蛋白的量的變化而變化，同時根據(jù)納米粒的量的變化而變化。同時，有經(jīng)驗的人能夠意識到本發(fā)明中使用的藥理活性物質(zhì)，可以是純的物質(zhì)，或者是混合物，這些都沒有背離本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的有益效果在于首先，經(jīng)本發(fā)明提供的方法形成的納米粒子可以達(dá)到90%的包封率，超過現(xiàn)有技術(shù)，形成了一種高效低耗的方法；其次，本發(fā)明所提供的方法能夠獲得最高達(dá)40%的載藥量，即納米粒中含有40%的藥理活性物質(zhì)。由于有更高的載藥量，在治療時，可以獲得更小的用藥體積，更短的用藥時間，對病人更方便。較高的載藥量降低了遞送藥理活性物質(zhì)時蛋白的使用量，提高了產(chǎn)品的成本效率；最后，現(xiàn)有技術(shù)提供的較低載藥能力不能滿足高劑量給藥，因為高劑量的給藥需要很大的給藥體積。然而，本實驗發(fā)明的具有高載藥能力的納米粒不會受給藥體積的限制。通過本發(fā)明制備的納米粒的另一個有益效果是，納米粒能夠特異性的遞送藥理活性物質(zhì)。通過本發(fā)明制備的納米粒子能夠靶向一些身體器官和系統(tǒng)。比如，當(dāng)用轉(zhuǎn)鐵蛋白作為載體時，通過改變納米粒子的大小，靶向肝臟，肺，脾臟或者淋巴系統(tǒng)等。當(dāng)用轉(zhuǎn)鐵蛋白作為載體的時候，它們的受體在細(xì)胞表面高表達(dá)，通過載體和腫瘤細(xì)胞表面的親和性，可以特異性的將藥理活性物質(zhì)輸送到腫瘤組織。因此可以說，本發(fā)明提供了一種高效低耗的方法來輸送藥理活性物質(zhì)到身體的不同部位。


圖1紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒子掃描電鏡圖片圖2紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白投射電鏡照片圖3紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒粒子粒徑分布4紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒XRD圖
具體實施例方式以下均是基于本發(fā)明的代表性實施例，但下述實施例不會在任何方面限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實施例1.紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒的制備IOOmg轉(zhuǎn)鐵溶于IOmL的含0. 05M 二硫蘇糖醇的磷酸鹽緩沖液，加入1. 6mL10mg/ mL的紫杉醇(乙醇溶解)溶液到沉淀中，混合2分鐘，加入IOmL的0. 08M的磷酸鹽緩沖液攪拌，溶解混合物。得到的懸液透明，載藥粒子的平均粒徑為80 200nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer) 0用反相C18柱測定紫杉醇的包封率，流動相為乙腈水 (60 40)，檢測波長227nm。HPLC分析表明本實驗的紫杉醇包封率達(dá)到90%以上。實施例2.多西紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒的制備IOOmg轉(zhuǎn)鐵蛋白溶于IOmL的含0. 05M 二硫蘇糖醇的磷酸鹽緩沖液，加入 3. 8mL20mg/mL的多西紫杉醇(乙醇溶解)溶液到沉淀中，混合2分鐘，加入IOmL的0. 08M 的磷酸鹽緩沖液攪拌，溶解混合物。得到的懸液透明，載藥粒子的平均粒徑為80 200nm， (BIC 90plus Particle Size Analyzer) 0用反相C18柱測定紫杉醇的包封率，流動相為乙腈水(60 40)，檢測波長227nm。HPLC分析表明本實驗的紫杉醇包封率達(dá)到90%以上。實施例3.阿霉素-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒的制備IOOmg轉(zhuǎn)鐵蛋白溶于IOmL的含0. 05M 二硫蘇糖醇的磷酸鹽緩沖液，加入 3. 8mL20mg/mL的阿霉素(乙醇溶解)溶液到沉淀中，混合2分鐘，加入IOmL的0. 08M的磷酸鹽緩沖液攪拌，溶解混合物。得到的懸液透明，載藥粒子的平均粒徑為80 200nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer) 0用反相C18柱測定紫杉醇的包封率，流動相為乙腈 水(60 40)，檢測波長227nm。HPLC分析表明本實驗的紫杉醇包封率達(dá)到90%以上。實施例4.紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒的動態(tài)光散射(dynamic light scaterring, DLS)分析對按照本發(fā)明的方法制備的紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒進(jìn)行粒徑分析，所用儀器為 BIC 90plus Particle Size Analyzer。結(jié)果如圖3所示，平均粒徑為119nm，且粒徑分布在較窄的范圍內(nèi)。實施例5.紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒的透射電鏡(Transmission Electron Microscopy, TEM)表征按照本發(fā)明制備載藥量為10. 59%的紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒進(jìn)行透射電鏡的分析。所用儀器為EM 2100型200KV高分辨率透射電鏡(日本)。結(jié)果如圖2所示，顯示納米粒子呈球形。實施例6.紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒的掃描電鏡表征按照本發(fā)明制備載藥量為10. 59%的紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒進(jìn)行掃描電鏡的分析。結(jié)果如圖1所示，顯示納米粒子呈球形，粒子在IOOnm左右，表面光滑。實施例7.紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒的X射線粉末衍射(x-ray powder diffraction, XRD)表征紫杉醇在水溶液中超過1 μ g/mL時就會結(jié)晶。因此，無定形態(tài)的紫杉醇非常有利于注射。為了檢測本發(fā)明中紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒中紫杉醇的固體形態(tài)，我們使用了 X 射線粉末衍射來進(jìn)行表征。共制備了四個樣品a)紫杉醇；b)轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒；c)紫杉醇轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒(載藥量為12.9% ) ；d)紫杉醇和轉(zhuǎn)鐵蛋白的物理混合物(12.9% )。每個樣品的 Zeta 角測定范圍從 5 度到 50 度(ARL，X，TRA，Applied Research Laboratories, Switzerland)。
結(jié)果如圖4所示圖a)顯示了紫杉醇晶體的特征峰；在2 θ角為15度到45度范圍內(nèi)，圖b)顯示出了轉(zhuǎn)鐵蛋白的暈型峰；圖c)表明在2Θ角為15度到45度范圍內(nèi)，也顯示了轉(zhuǎn)鐵蛋白的暈型峰，說明在納米粒中紫杉醇是以無定形的狀態(tài)存在；在與納米粒相同比例(12.9%)的紫杉醇和轉(zhuǎn)鐵蛋白的物理混合物中，圖d)顯示了晶體狀態(tài)的紫杉醇和無定形狀態(tài)的轉(zhuǎn)鐵蛋白的存在。因此，我們可以得到結(jié)論本發(fā)明制備的紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米中紫杉醇以無定形狀態(tài)存在。
權(quán)利要求
1.一種制備用于體內(nèi)遞送藥理活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒的方法，包括以下步驟(a)溶解轉(zhuǎn)鐵蛋白獲得轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液；(b)在二硫蘇糖醇存在的條件下，將藥理活性物質(zhì)加入步驟(a)中所述的蛋白溶液中， 形成蛋白納米粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白納米粒的平均粒徑為25nm 500nmo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的藥理活性物質(zhì)在納米粒中所占的重量比是 40%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的藥理活性物質(zhì)是紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、卡莫司汀、阿霉素、苯芥膽留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、 藤黃酸、冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非諾貝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚美辛、吡羅昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齊拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韋、利托那韋、Telaprevir、洛匹那韋、環(huán)磷酰胺、博萊霉素、道諾霉素、表柔比星、甲氨蝶呤、5_氟尿嘧啶或其類似物、鉬或其類似物、長春堿或其類似物、高三尖杉酯堿或其衍生物、放線菌素-D、絲裂霉素-C、依托泊苷、或它們的組合。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的藥理活性物質(zhì)是紫杉醇、多西紫杉醇、 阿霉素或它們的組合。
6.一種包含有紫杉醇的轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒，用于體內(nèi)藥物遞送；其特征在于所述的納米粒的制備步驟通過以下方法(a)溶解轉(zhuǎn)鐵蛋白獲得轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液；(b)在二硫蘇糖醇存在的條件下，將紫杉醇加入到步驟(a)所述的蛋白溶液中，將紫杉醇包裹在所述蛋白中所述的納米粒子直徑為50nm 300nm，所述蛋白納米粒含有 40%重量比的紫杉
7. 一種包含有多西紫杉醇的轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒，用于體內(nèi)藥物遞送；其特征在于所述的納米粒的制備步驟通過以下方法(a)溶解轉(zhuǎn)鐵蛋白獲得轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液；(b)在二硫蘇糖醇存在的條件下，將多西紫杉醇加入到步驟(a)所述的蛋白溶液中，將多西紫杉醇包裹在所述蛋白中所述的納米粒子直徑為50nm 300nm，所述蛋白納米粒含有 40%重量比的多西紫杉醇。
全文摘要
本發(fā)明是利用二硫蘇糖醇將藥理活性物質(zhì)包入轉(zhuǎn)鐵蛋白，形成納米粒，用于體內(nèi)遞送。
文檔編號A61K31/337GK102293747SQ20111019573
公開日2011年12月28日 申請日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者吳錦慧, 王永毅, 陳晶 申請人:南京從一醫(yī)藥咨詢有限公司