專利名稱：一種含杯狀細(xì)胞的重組眼結(jié)膜上皮膜片的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于眼表結(jié)膜上皮制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種含杯狀細(xì)胞的重組眼結(jié)膜上皮膜片的制備方法。
背景技術(shù)：
結(jié)膜杯狀細(xì)胞是單細(xì)胞黏液腺，位于結(jié)膜上皮層，其主要功能是分泌黏蛋白，其所分泌的黏蛋白是淚膜最內(nèi)層的主要成分，對維持眼表功能起重要作用。但是，若杯狀細(xì)胞受到破壞，淚液成分即出現(xiàn)異常，引起角結(jié)膜干燥癥，輕者感覺不適，重者導(dǎo)致失明。因此，在結(jié)膜大范圍損傷后，即使采用口唇粘膜、羊膜移植等種種方法克服瞼球粘連問題，也會(huì)因?yàn)椴荒芑謴?fù)正常的杯狀細(xì)胞密度和功能，不能建立后期角膜移植術(shù)恢復(fù)視力的基礎(chǔ)。因此，制備含杯狀細(xì)胞的重組結(jié)膜上皮膜片，用以重建結(jié)膜結(jié)構(gòu)和功能，恢復(fù)作為淚液中黏蛋白主要來源的杯狀細(xì)胞，已成為眼表重建手術(shù)一個(gè)新的發(fā)展方向，其臨床應(yīng)用將為眼表疾病的治療開辟廣闊前景，具有深遠(yuǎn)意義。但目前對含杯狀細(xì)胞的重組眼結(jié)膜上皮膜片的構(gòu)建中還存在許多難題亟待解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含杯狀細(xì)胞的重組眼結(jié)膜上皮膜片的制備方法，即在結(jié)膜上皮膜片構(gòu)建的后期，采用Y _分泌酶抑制劑誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞分化，增加重組眼結(jié)膜上皮膜片中杯狀細(xì)胞的密度，促進(jìn)其成熟分化，得到含正常功能和密度杯狀細(xì)胞的重組結(jié)膜上皮膜片，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的含杯狀細(xì)胞的重組眼結(jié)膜上皮膜片的制備方法，其特征在于，是用 Y-分泌酶抑制劑來誘導(dǎo)重組眼結(jié)膜上皮膜片中杯狀細(xì)胞的分化。本發(fā)明的制備方法，包括有1)眼結(jié)膜上皮膜片的培養(yǎng)制備和2)杯狀細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟步驟，其特征在于，上述2)杯狀細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟步驟是在結(jié)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為100 400nm/L的γ -分泌酶抑制劑來誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞的分化。上述的步驟1)眼結(jié)膜上皮膜片的培養(yǎng)制備，其步驟如下首先將制備好的羊膜嵌套式培養(yǎng)模具放入已鋪有飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板中，然后再將處理好的結(jié)膜上皮組織接種于培養(yǎng)板中，再添加結(jié)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。所述的飼養(yǎng)層制備方法如下用絲裂霉素C處理小鼠胚胎成纖維細(xì)胞后，再消化接種到細(xì)胞培養(yǎng)用的6孔板中制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層。步驟2)杯狀細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟，其步驟如下將結(jié)膜上皮組織接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)至結(jié)膜上皮細(xì)胞融合度達(dá)到80 90 %后，在結(jié)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為100 400nm/L的Y -分泌酶抑制劑，誘導(dǎo)分化結(jié)膜上皮細(xì)胞1 7天，制得含杯狀細(xì)胞的眼重組結(jié)膜上皮膜片。在結(jié)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為200nm/L的γ -分泌酶抑制劑，結(jié)膜杯狀細(xì)胞明顯增殖，具有最好的誘導(dǎo)效果。
本發(fā)明的制備方法以自體結(jié)膜或異體結(jié)膜為原材料，培養(yǎng)制備含杯狀細(xì)胞的重組結(jié)膜上皮膜片，用于移植治療因?yàn)楸瓲罴?xì)胞缺乏或功能障礙為特征的眼表疾病。本發(fā)明以 Y -分泌酶抑制劑誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞分化，與以往的結(jié)膜上皮膜片制備方法相比，本發(fā)明的培養(yǎng)方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1)含飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)，早期促進(jìn)結(jié)膜上皮細(xì)胞的增殖，形成的結(jié)膜上皮復(fù)層更加均勻；2)以羊膜嵌套式培養(yǎng)模具為培養(yǎng)支架，羊膜培養(yǎng)面很平坦，分化的杯狀細(xì)胞存在于結(jié)膜上皮間，具有功能，臨床應(yīng)用方便且羊膜不易破裂；3) Y-分泌酶抑制劑誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞分化，可增加重組結(jié)膜上皮膜片中杯狀細(xì)胞的密度和分泌黏蛋白的能力，更符合臨床需求。


圖1 本發(fā)明的膜嵌套式培養(yǎng)模具的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2 本發(fā)明的原代培養(yǎng)兔結(jié)膜上皮細(xì)胞陰性對照組處理照片。圖3 本發(fā)明的原代培養(yǎng)兔結(jié)膜上皮細(xì)胞200nm/L的γ -分泌酶抑制劑組處理照片。圖4:本發(fā)明的原代培養(yǎng)人結(jié)膜上皮細(xì)胞陰性對照組AB/PAS染色照片，紅色著色為杯狀細(xì)胞。圖5 本發(fā)明的原代培養(yǎng)人結(jié)膜上皮細(xì)胞200nm/L的γ -分泌酶抑制劑組AB/PAS 染色照片，紅色著色為杯狀細(xì)胞。其中1、嵌入式培養(yǎng)小室2、套筒3、羊膜片。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以自體結(jié)膜或異體結(jié)膜組織為原材料，用Y _分泌酶抑制劑誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞分化來制備以羊膜為載體的結(jié)膜杯狀細(xì)胞膜片，制備的含杯狀細(xì)胞的眼重組結(jié)膜上皮膜片具有人結(jié)膜杯狀細(xì)胞的特性，可用于結(jié)膜杯狀細(xì)胞缺乏或功能障礙征疾病的移植治療中。本發(fā)明的制備方法包括有1)眼結(jié)膜上皮膜片的培養(yǎng)制備和2)杯狀細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟步驟，其特征在于，上述2)杯狀細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟步驟是在結(jié)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為100 400nm/L的γ -分泌酶抑制劑。本發(fā)明的1)眼結(jié)膜上皮膜片的培養(yǎng)可以采用已有的方法來進(jìn)行，優(yōu)選方法參照于中國發(fā)明專利羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片的制備方法(201110036633. 4)所描述的方法，具體步驟如下a、羊膜嵌套式培養(yǎng)模具的制備如圖1，按照常規(guī)方法制備5. OcmX 5. Ocm尺寸的去上皮無菌羊膜片3，將該羊膜片 3上皮面朝上平鋪于6孔培養(yǎng)板中；將上述得到的羊膜片3上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒2的端面上，用嵌入式培養(yǎng)小室1扣在套筒2的羊膜片3上，即制成羊膜嵌套式培養(yǎng)模具。其中所用套筒2外徑24mm，高16mm。b、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備用0.01mg/ml絲裂霉素C溶液處理貼壁的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，37°C孵育2小時(shí)； 用IOml PBS磷酸鹽緩沖液仔細(xì)清洗細(xì)胞后；加Iml 0. 25%胰酶/0. 02% EDTA，37°C孵育3-5分鐘；加9ml含血清的DMEM培養(yǎng)液中止消化，吹打細(xì)胞；離心收集細(xì)胞，棄上清，用IOml 含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2. 5 X IO4細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度接種細(xì)胞到6孔培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜使其貼壁，即制備成小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3飼養(yǎng)層。C、結(jié)膜組織小塊的制備將眼庫來源的新鮮結(jié)膜組織環(huán)放入盛有含lOOu/ml青霉素和鏈霉素的PBS液中浸泡，沖洗3次，每次3分鐘。移入含100u/ml青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，實(shí)體顯微鏡下仔細(xì)剪除結(jié)膜下組織及血管組織，將結(jié)膜上皮組織修剪成大小Imm3的組織塊。d、將上述步驟一制備的羊膜嵌套式培養(yǎng)模具放置入鋪有上述步驟二制備的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的6孔板中，再將上述步驟三制備的結(jié)膜組織塊接種于羊膜嵌套式培養(yǎng)模具羊膜面上，每個(gè)培養(yǎng)孔接種5-8塊結(jié)膜組織塊，加入少量結(jié)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，所述的結(jié)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液為添加有10% FBS、20ng/mlEGF、5 μ g/ml胰島素、0. 1 μ g/ml霍亂毒素、100 μ g/ml青鏈霉素的DMEM/HamF12培養(yǎng)基，放置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞從組織塊向外爬出，培養(yǎng)一周左右結(jié)膜上皮細(xì)胞生長至50 60%融合，10天左右結(jié)膜上皮細(xì)胞生長至80 90%融合。本發(fā)明的方法步驟2)杯狀細(xì)胞誘導(dǎo)步驟利用針對Notch通路的靶向治療劑 Y-分泌酶抑制劑誘導(dǎo)分化結(jié)膜上皮細(xì)胞，在原代培養(yǎng)的結(jié)膜上皮細(xì)胞中加入終濃度100、 200、400nm/L γ -分泌酶抑制劑，加入不含Y -分泌酶抑制劑的培養(yǎng)液做陰性對照，于加藥后第3天，RAB/PAS染色，觀察不同濃度組杯狀細(xì)胞密度的差異；通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)方法檢測Y-分泌酶抑制劑對杯狀細(xì)胞MUC5AC、CK7基因表達(dá)的影響。結(jié)果在體外培養(yǎng)的兔結(jié)膜上皮細(xì)胞中存在杯狀細(xì)胞，且MUC5AC、CK7mRNA表達(dá)量明顯高于陰性對照組，其中200nm處理組MUC5AC、CK7mRNA表達(dá)量明顯高于100、400nm組。因此，本發(fā)明確定Y-分泌酶的最佳誘導(dǎo)濃度為200nm/L。下面對本發(fā)明的制備方法進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例1體外誘導(dǎo)含杯狀細(xì)胞的眼重組結(jié)膜上皮膜片一、羊膜嵌套式培養(yǎng)模具的制備羊膜嵌套式培養(yǎng)模具的制備如圖1，按照常規(guī)方法制備5. OcmX 5. Ocm尺寸的去上皮無菌羊膜片3，將該羊膜片 3上皮面朝上平鋪于6孔培養(yǎng)板中；將上述得到的羊膜片3上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒2的端面上，用嵌入式培養(yǎng)小室1扣在套筒2的羊膜片3上，即制成羊膜嵌套式培養(yǎng)模具。其中所用套筒2外徑24mm，高16mm。二、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備用0.01mg/ml絲裂霉素C溶液處理貼壁的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，37°C孵育2小時(shí)； 用10ml PBS磷酸鹽緩沖液仔細(xì)清洗細(xì)胞后；加Iml 0. 25%胰酶/0. 02% EDTA，37°C孵育 3-5分鐘；加9ml含血清的DMEM培養(yǎng)液中止消化，吹打細(xì)胞；離心收集細(xì)胞，棄上清，用IOml 含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2. 5 X IO4細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度接種細(xì)胞到6孔培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜使其貼壁，即制備成小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3飼養(yǎng)層。三、人結(jié)膜組織小塊的制備將眼庫保存的新鮮人結(jié)膜組織放入盛有含lOOu/ml青霉素和鏈霉素的PBS液泡， 沖洗3次，每次3分鐘。移入含100u/ml青霉素和鏈霉素DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，實(shí)體顯微鏡下仔細(xì)剪除結(jié)膜下組織及血管組織，將結(jié)膜上皮組織剪成大小Imm3的組織塊。四、人結(jié)膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化首先將制備好羊膜嵌套式培養(yǎng)模具放置入鋪有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的6 孔板中，再將人結(jié)膜組織塊接種于羊膜表面，每個(gè)培養(yǎng)孔接種5-8塊結(jié)膜組織塊，放置于 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞從組織塊向外爬出，培養(yǎng)至結(jié)膜上皮細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔80-90 %時(shí)進(jìn)行杯狀細(xì)胞分化誘導(dǎo)，利用針對Notch通路的靶向治療劑Y -分泌酶抑制劑誘導(dǎo)分化結(jié)膜上皮細(xì)胞，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Y “分泌酶抑制劑最佳濃度200nm/L，培養(yǎng)時(shí)間大約為兩周左右。組織化學(xué)染色結(jié)果表明羊膜載體重組的結(jié)膜上皮為2-3層的復(fù)層結(jié)膜上皮，可見杯狀細(xì)胞；而陰性對照組中杯狀細(xì)胞的數(shù)量很少。實(shí)施例2體外誘導(dǎo)含杯狀細(xì)胞的兔眼重組結(jié)膜上皮膜片二、羊膜嵌套式培養(yǎng)模具的制備羊膜嵌套式培養(yǎng)模具的制備如圖1，按照常規(guī)方法制備5. OcmX 5. Ocm尺寸的去上皮無菌羊膜片3，將該羊膜片 3上皮面朝上平鋪于6孔培養(yǎng)板中；將上述得到的羊膜片3上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒2的端面上，用嵌入式培養(yǎng)小室1扣在套筒2的羊膜片3上，即制成羊膜嵌套式培養(yǎng)模具。其中所用套筒2外徑24mm，高16mm。二、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備用0.01mg/ml絲裂霉素C溶液處理貼壁的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，37°C孵育2小時(shí)； 用IOml PBS磷酸鹽緩沖液仔細(xì)清洗細(xì)胞后；加Iml 0. 25%胰酶/0. 02% EDTA，37°C孵育 3-5分鐘；加9ml含血清的DMEM培養(yǎng)液中止消化，吹打細(xì)胞；離心收集細(xì)胞，棄上清，用IOml 含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2. 5 X IO4細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度接種細(xì)胞到6孔培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜使其貼壁，即制備成小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3飼養(yǎng)層。三、兔結(jié)膜組織小塊的制備將眼庫保存的新鮮兔結(jié)膜組織放入盛有含lOOu/ml青霉素和鏈霉素的PBS液泡， 沖洗3次，每次3分鐘。移入含100u/ml青霉素和鏈霉素DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，實(shí)體顯微鏡下仔細(xì)剪除結(jié)膜下組織及血管組織，將結(jié)膜上皮組織剪成大小Imm3的組織塊。四、兔結(jié)膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化首先將制備好羊膜嵌套式培養(yǎng)模具放置入鋪有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的6 孔板中，再將兔結(jié)膜組織塊接種于羊膜表面，每個(gè)培養(yǎng)孔接種5-8塊結(jié)膜組織塊，放置于 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞從組織塊向外爬出，培養(yǎng)至結(jié)膜上皮細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔80-90 %時(shí)進(jìn)行杯狀細(xì)胞分化誘導(dǎo)，利用針對Notch通路的靶向治療劑Y -分泌酶抑制劑誘導(dǎo)分化結(jié)膜上皮細(xì)胞，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Y “分泌酶抑制劑最佳濃度200nm/L，培養(yǎng)時(shí)間大約為兩周左右。行組織化學(xué)染色，可見羊膜為載體重組的結(jié)膜上皮為2-3層的復(fù)層結(jié)膜上皮，可見杯狀細(xì)胞(圖3)；而陰性對照組中杯狀細(xì)胞的數(shù)量很少(圖2)。實(shí)施例3 : Y —分泌酶抑制劑滴眼液體內(nèi)誘導(dǎo)鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞分化一、γ —分泌酶抑制劑滴眼液制備將γ —分泌酶抑制劑使用人工淚液稀釋到(終濃度分別為100nm、200nm、400nm/
L)滴眼液，即得到Y(jié)-分泌酶抑制劑滴眼液。上述人工淚液可以用替若復(fù)方氯化鈉滴眼液來替代。
二、γ -分泌酶抑制劑滴眼液體內(nèi)誘導(dǎo)鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞分化每眼每次點(diǎn)滴眼液5 μ 1，每天點(diǎn)眼3次，點(diǎn)眼誘導(dǎo)3天。具體分組如下對照組采用替若復(fù)方氯化鈉滴眼液點(diǎn)眼。誘導(dǎo)組采用Υ -分泌酶抑制劑滴眼液點(diǎn)眼。誘導(dǎo)3天后，觀察誘導(dǎo)效果，行結(jié)膜組織PAS染色，具體以不同、-分泌酶抑制劑滴眼液濃度進(jìn)行對比。其中以200nm/L γ -分泌酶抑制劑滴眼液組PAS染色，陽性反應(yīng)最多(胞漿呈紅色顆粒者)。對實(shí)施例1制備的含杯狀細(xì)胞的重組結(jié)膜上皮膜片的檢測一、組織化學(xué)染色重組結(jié)膜上皮膜片100%甲醇固定15分鐘，行PAS雙染后，紅色顆粒者為陽性反應(yīng)，表明培養(yǎng)的細(xì)胞中含有中性(呈紅色)糖蛋白，是杯狀細(xì)胞(圖4、圖5)。二、免疫熒光檢測通過杯狀細(xì)胞特異性表達(dá)CK7和特異性分泌的粘蛋白MUC5AC，應(yīng)用免疫熒光的方法對結(jié)膜杯狀細(xì)胞進(jìn)行鑒定。原代培養(yǎng)的人結(jié)膜上皮細(xì)胞，冰甲醇固定10分鐘，山羊血清封閉20分鐘，以鼠單抗CK7抗體和鼠單抗MUC5AC抗體孵育1小時(shí)，滴加DAPI染核，激光共聚焦顯微鏡觀察，呈陽性反應(yīng)者為杯狀細(xì)胞。將實(shí)施例2制備的含杯狀細(xì)胞的重組兔結(jié)膜上皮膜片移植治療兔堿燒傷瞼球粘連一、首先建立兔堿燒傷動(dòng)物模型模型動(dòng)物選用新西蘭大白兔，全身麻醉后，用鹽酸丙美卡因滴眼液點(diǎn)眼，將浸透IN NaOH濾紙片直接貼覆于兔角膜表面，進(jìn)行堿燒傷30秒，隨后立即用大于30ml生理鹽水沖洗來停止燒傷。二、重組兔結(jié)膜上皮膜片移植治療移植治療再堿燒傷20-30天后，兔角膜新生血管長入，逐漸瞼球粘連。將實(shí)施例2制備的含杯狀細(xì)胞的重組兔結(jié)膜上皮膜片進(jìn)行移植手術(shù)，結(jié)膜囊成形成功。三、術(shù)后觀察移植手術(shù)后兔眼無感染，結(jié)膜囊活動(dòng)度好，結(jié)膜杯狀細(xì)胞染色陽性，證明實(shí)施例2 制備的含杯狀細(xì)胞的重組兔結(jié)膜上皮膜片具有很好的應(yīng)用效果。
權(quán)利要求
1.一種含杯狀細(xì)胞的重組眼結(jié)膜上皮膜片的制備方法，其特征在于，是用Y-分泌酶抑制劑來誘導(dǎo)重組眼結(jié)膜上皮膜片中杯狀細(xì)胞的分化。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，包括有1)眼結(jié)膜上皮膜片的培養(yǎng)制備和2)杯狀細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟步驟，其特征在于，上述2)杯狀細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟步驟是在結(jié)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為100 400nm/L的γ -分泌酶抑制劑來誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞的分化。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的Y-分泌酶抑制劑終濃度優(yōu)選為 200nm/Lo
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的步驟1)眼結(jié)膜上皮膜片的培養(yǎng)制備，其具體操作如下首先將制備好的羊膜嵌套式培養(yǎng)模具放入已鋪有飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板中，然后再將處理好的結(jié)膜上皮組織接種于培養(yǎng)板中后，再添加結(jié)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的飼養(yǎng)層為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層。
6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的步驟2)杯狀細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟步驟，其具體操作如下將結(jié)膜上皮組織接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)至結(jié)膜上皮細(xì)胞融合度達(dá)到 80 90%后，在結(jié)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為100 400nm/L的分泌酶抑制劑， 誘導(dǎo)分化結(jié)膜上皮細(xì)胞1 7天后，制得含杯狀細(xì)胞的眼重組結(jié)膜上皮膜片。
7.如權(quán)利要求4或權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述的結(jié)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液為添加有10% 85、20叫/!11壓6 、5 48/1111胰島素、0. 1 μ g/ml霍亂毒素、100 μ g/ml青鏈霉素的DMEM/HamF12培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含杯狀細(xì)胞的重組結(jié)膜上皮膜片的制備方法，是用γ-分泌酶抑制劑來誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞的分化。本發(fā)明的制備方法以自體結(jié)膜或異體結(jié)膜為原材料，培養(yǎng)制備含杯狀細(xì)胞的重組結(jié)膜上皮膜片。與以往的結(jié)膜上皮膜片制備方法相比，本發(fā)明的培養(yǎng)方法能在早期促進(jìn)結(jié)膜上皮細(xì)胞的增殖，形成的結(jié)膜上皮復(fù)層更加均勻；以羊膜嵌套式培養(yǎng)模具為培養(yǎng)支架，羊膜培養(yǎng)面很平坦，分化的杯狀細(xì)胞存在于結(jié)膜上皮間，具有功能，臨床應(yīng)用方便且羊膜不易破裂；并且可增加重組結(jié)膜上皮膜片中杯狀細(xì)胞的密度和分泌黏蛋白的能力，更符合臨床需求。
文檔編號(hào)A61L27/38GK102266587SQ20111020415
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者周慶軍, 楊玲玲, 王瑤, 田樂, 謝立信 申請人:山東省眼科研究所