專利名稱：一種從卷柏中連續(xù)提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從天然藥物中提取有效成分的方法，尤其涉及一種從卷柏中連續(xù)提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法。
背景技術(shù)：
卷柏Gelaginella tamariscina (Beauv.) Spring)為多年生草本植物,是蕨類卷柏科(klaginellaceae)卷柏屬(klaginella)植物卷柏的全草?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載，卷柏“主五臟邪氣，女子陰中寒熱痛、癥瘕、血閉、絕子”，將其列為上品。歷代醫(yī)家認(rèn)為其性辛平，具有破血散瘀、活血止血之功效，生用治經(jīng)閉、癥瘕，跌打損傷、腹痛、哮喘，炒炭用治吐血，便血，尿血，脫肛。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)卷柏的研究主要集中在抗輻射、抗氧化、降血糖、雌激素、抗菌、抗病毒、抗真菌等方面。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)卷柏進(jìn)行大量藥理活性研究，結(jié)果顯示，卷柏具有較好的降糖活性及雌激素樣作用。進(jìn)一步的成分研究結(jié)果表明，卷柏發(fā)揮降血糖作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是黃酮類成分，并且黃酮類成分也是卷柏的主含成分；卷柏發(fā)揮雌激素樣作用的有效成分為極性較大的物質(zhì)。因此，如何將卷柏中發(fā)揮降血糖作用和雌激素樣作用的活性成分分別提取出來(lái)，是需要認(rèn)真解決的技術(shù)問(wèn)題。目前國(guó)內(nèi)企業(yè)或科研單位對(duì)卷柏有效成分的提取多為針對(duì)單一產(chǎn)品的提取方法， 該方法雖可使目標(biāo)成分得率最大化，卻使卷柏中其他有效成分白白流失，加之提取過(guò)程溶劑用量大，勞動(dòng)強(qiáng)度大，造成資源浪費(fèi)、目標(biāo)產(chǎn)品成本過(guò)高。如何研制出一種從卷柏中連續(xù)提取活性成分的方法，提高卷柏藥材的綜合利用率，節(jié)省生產(chǎn)成本，是需要認(rèn)真解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的就是提供一種從卷柏中連續(xù)提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法，可有效解決多、快、好、省地連續(xù)獲得卷柏降血糖活性成分和雌激素活性成分，有效降低藥物成本、簡(jiǎn)化提取工藝，有利于提高卷柏綜合利用率和節(jié)約卷柏藥材資源的問(wèn)題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是該方法是由下列步驟實(shí)現(xiàn)的(1)將卷柏干燥全草以10倍重量體積(重量體積計(jì)為v/m，即固體以g計(jì)，液體以ml計(jì))的質(zhì)量濃度為95 %的乙醇回流提取2次，每次2h，過(guò)濾、合并濾液，在溫度為 40-50°C，壓力0. 09-0. IMI^a濃縮，干燥，得卷柏醇提物，即本發(fā)明的卷柏降血糖活性成分；(2)步驟(1)中提取后剩余藥渣加入卷柏干燥全草重量體積(v/m)的10倍量的水，煎煮2次，每次池，過(guò)濾、合并水煎液，在溫度為40-50°C，壓力0. 09-0. IMPa濃縮，干燥， 得藥渣水提物；
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(3)藥渣水提物加水后，經(jīng)水浴加熱至完全溶解，加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，使乙醇終濃度為30%，攪拌，4°C靜置12-24h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第一次上清液和沉淀1 ；(4)第一次上清液加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，使其乙醇終濃度為50%，攪拌， 4°C靜置12-24h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第二次上清液和沉淀2 ；(5)第二次上清液加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，使乙醇終濃度為80%，攪拌，4°C 靜置12-24h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第三次上清液和沉淀3 ；(6)合并沉淀1、沉淀2和沉淀3，干燥，得卷柏藥渣水提醇沉物，備做他用；將第三次上清液在溫度為40-50°C，壓力0. 09-0. IMI^a濃縮，干燥，得卷柏藥渣水提去醇沉物，即本發(fā)明卷柏雌激素活性成分。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)工藝簡(jiǎn)單采用95%乙醇回流提取得到卷柏降血糖活性成分后，直接對(duì)藥渣進(jìn)行水煎和醇沉及除雜處理得到雌激素活性成分，過(guò)程簡(jiǎn)單，操作方便。(2)工藝安全性強(qiáng)本發(fā)明整個(gè)工藝所用溶劑均為蒸餾水和乙醇，無(wú)毒，高效，環(huán)保， 避免使用有毒有機(jī)試劑，提高了生產(chǎn)安全性。(3)生產(chǎn)成本低，適合工業(yè)生產(chǎn)本發(fā)明從一種藥材中連續(xù)提取兩種活性成分，節(jié)省了原藥材、工業(yè)原料以及勞動(dòng)力資源，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本，適用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。(4)交叉成分少95%乙醇和水的極性相差較大，且卷柏經(jīng)95%乙醇回流后，再對(duì)藥渣水煎，從提取材料來(lái)源上保證了提取物成分之間的無(wú)交叉或交叉較少，從而避免了極性相近化合物在不同部位的大量交叉和流失，適合于對(duì)無(wú)法明確極性范圍或極性范圍較大的中藥活性成分的篩選研究。(5)藥效明確本發(fā)明中得到的成分已經(jīng)過(guò)活性驗(yàn)證，結(jié)果顯示其作用顯著，安全有效。


圖1為本發(fā)明工藝流程圖。圖2為本發(fā)明卷柏乙醇提取物對(duì)糖尿病小鼠攝食量的影響圖。圖3為本發(fā)明卷柏乙醇提取物對(duì)糖尿病小鼠飲水量的影響圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例和有關(guān)試驗(yàn)資料對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明在實(shí)施中，具體是由以下步驟實(shí)現(xiàn)的實(shí)施例一首先將卷柏120g用1200ml質(zhì)量濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次池，過(guò)濾、合并濾液，在溫度為40°C，壓力0. 09MPa濃縮，干燥，得卷柏醇提物5. 76g，即本發(fā)明卷柏降血糖活性成分；然后將乙醇提取后的藥渣加水1200ml煎煮2次，每次池，過(guò)濾、合并濾液，在溫度為40°C，壓力0. 09MI^濃縮，干燥，得到卷柏藥渣水提物9. 39g ；卷柏藥渣水提物 9. 39g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95%乙醇，使其含乙醇濃度為30%，攪拌，4°C 靜置1 !過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第一次上清液；第一次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇濃度為50%，攪拌，4°C靜置Ia1過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇濃度為80%，攪拌，4°C靜置12h過(guò)夜，6000r/min離心 lOmin，得第三次上清液；將第三次上清液在溫度為40°C，壓力0. 09MI^濃縮，干燥，得卷柏藥渣水提去醇沉物1. 43g，即本發(fā)明卷柏雌激素活性成分。實(shí)施例二 首先將卷柏MOg用MOOml質(zhì)量濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次池，過(guò)濾、 合并濾液，在溫度為45°C，壓力0. 095MI^濃縮，干燥，得卷柏醇提物11. 56g，即本發(fā)明卷柏降血糖活性成分；然后將乙醇提取后的藥渣加水MOOml煎煮2次，每次2h，過(guò)濾、合并濾液，在溫度為45°C，壓力0. 095MI^濃縮，干燥得到卷柏藥渣水提物19. 44g ；卷柏藥渣水提物 19. 44g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95%乙醇，使其含乙醇濃度為30%，攪拌，4°C 靜置20h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第一次上清液；第一次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇濃度為50%，攪拌，4°C靜置20h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇濃度為80%，攪拌，4°C靜置20h過(guò)夜，6000r/min離心 lOmin，得第三次上清液；然后，將第三次上清液在溫度為45°C，壓力0. 095MI^濃縮，干燥， 得卷柏藥渣水提去醇沉物3. 23g，即本發(fā)明卷柏雌激素活性成分。實(shí)施例三首先將卷柏360g用3600ml質(zhì)量濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次池，過(guò)濾、 合并濾液，在溫度為50°C，壓力0. IMI^a濃縮，干燥，得卷柏醇提物17. 21g，即本發(fā)明卷柏降血糖活性成分；然后將乙醇提取后的藥渣加水3600ml煎煮2次，每次2h，過(guò)濾、合并濾液， 在溫度為50°C，壓力0. IMPa濃縮，干燥得到水提物27. 15g ；藥渣水提物27. 15g置入80°C 水浴，使其完全溶解，再加入95 %乙醇，使其含乙醇濃度為30 %，攪拌，4°C靜置24h過(guò)夜， 6000r/min離心lOmin，得第一次上清液；第一次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇濃度為 50%，攪拌，4°C靜置24h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇濃度為80%，攪拌，4°C靜置24h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第三次上清液；將第三次上清液在溫度為50°C，壓力0. IMI^a濃縮，干燥，得卷柏藥渣水提去醇沉物 4. 31g，即本發(fā)明卷柏雌激素活性成分。上述三次試驗(yàn)的95%的乙醇提取物平均得率為4.8%，水提物平均得率為 7. 82%，卷柏藥渣水提物去醇沉成分的平均得率為15. 9%，上述制備過(guò)程經(jīng)過(guò)多次、多種劑量的制備，其得率均取得了相近似的結(jié)果，證明該制備方法穩(wěn)定可靠，有實(shí)際的應(yīng)用意義。本發(fā)明對(duì)上述提取方法進(jìn)行了活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過(guò)糖尿病小鼠模型對(duì)卷柏95 %乙醇提取物的降血糖作用進(jìn)行了確認(rèn)，通過(guò)小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)和報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對(duì)卷柏藥渣水提物去醇沉成分的雌激素作用進(jìn)行了確認(rèn)。降血糖實(shí)驗(yàn)研究本發(fā)明方法中卷柏95%醇提物具有顯著的降血糖活性，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證取得了滿意的效果，有關(guān)實(shí)驗(yàn)資料如下1. 1實(shí)驗(yàn)方法1. 1. 1糖尿病模型建立18_22g雄性昆明種小鼠80只，隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組，其余小鼠禁食14h后，腹腔注射STZ180mg/kg (采用冰浴PH4. 2檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制成18mg/ml溶液，以0. lml/10g劑量注射)，正常對(duì)照組腹腔注射同劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。7 后，禁食4h，尾靜脈采血，葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖值，血糖值≥16. 7mmol/L視為成模。 1. 1. 2分組及給藥取40只造模成功的小鼠，按血糖均衡原則分為4組，每組10 只。正常對(duì)照組及模型對(duì)照組給予蒸鎦水；陽(yáng)性對(duì)照組給予二甲雙胍500mg/kg ；卷柏95% 低、高劑量組分別給予卷柏95% 92. 5mg/kg、185mg/kg，每天清晨給藥1次，連續(xù)給藥4周。 實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食、飲水。1. 1. 3檢測(cè)指標(biāo)1. 1. 3. 1體重、攝食量、飲水量的測(cè)定記錄腹腔注射STZ 72h及給藥治療2周末各組小鼠體重、平均日攝食量、平均日飲水量。1. 1. 3. 2空腹血糖(FBG)及口服葡萄糖耐量(OGTT)的測(cè)定分別于腹腔注射STZ 72h及給藥治療第2周末禁食4h，給藥池后尾靜脈采血，葡萄糖氧化酶法檢測(cè)FBG。末次給藥前一日進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn)。將各組小鼠禁食4h，給藥池后尾靜脈采血測(cè)定血糖即為OGTT Omin血糖值。然后給予2. Og/kg葡萄糖溶液，分別于30、 60、120min尾靜脈采血，3500r/min離心IOmin分離血清，葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖值。1. 1.4統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，SPSS13. 0進(jìn)行單因素方差分析(One-Way AN0VA)統(tǒng)計(jì)處理。1. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論1. 2. 1卷柏95%醇提物對(duì)糖尿病小鼠體重、攝食量和飲水量的影響多飲、多食、多尿和體重減輕即俗稱的“三多一少”癥狀，它是糖尿病的典型癥狀。 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠體重、攝食量和飲水量，以研究卷柏95%醇提物對(duì)糖尿病癥狀的改善作用。 所有造模組小鼠體重從注射STZ后就持續(xù)顯著性低于正常組小鼠(ρ < 0. 05，ρ < 0. 01)。 隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，正常組小鼠體重穩(wěn)定增加，模型組小鼠體重呈下降趨勢(shì)，各給藥組小鼠給藥后體重穩(wěn)定增加，見(jiàn)表1。正常組小鼠攝食量在給藥期間無(wú)明顯變化，模型組小鼠攝食量上升，95%低劑量組攝食量呈下降趨勢(shì)，其它各給藥組小鼠攝食量也呈上升趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。 所有造模組小鼠飲水量從注射STZ后均高于正常組小鼠。正常組小鼠飲水量在給藥期間無(wú)明顯變化，模型組小鼠飲水量呈上升趨勢(shì)，各給藥組小鼠飲水量也呈下降趨勢(shì)，見(jiàn)圖2。表1卷柏95%乙醇提取物對(duì)糖尿病小鼠體重的影響( ±s, η = 10)
體重/g
權(quán)利要求
1.一種從卷柏中連續(xù)提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法，其特征在于，由下列步驟實(shí)現(xiàn)(1)將卷柏干燥全草以10倍重量體積的質(zhì)量濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次池，過(guò)濾、合并濾液，在溫度為40-50°C，壓力0. 09-0. IMI^a濃縮，干燥，得卷柏降血糖活性成分；(2)步驟(1)中提取后剩余藥渣加入卷柏干燥全草重量體積的10倍量的水，煎煮2次， 每次池，過(guò)濾、合并水煎液，在溫度為40-50°C，壓力0. 09-0. IMI^a濃縮，干燥，得藥渣水提物；(3)藥渣水提物加水后，經(jīng)水浴加熱至完全溶解，加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，使乙醇終濃度為30%，攪拌，4°C靜置12-24h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第一次上清液和沉淀 1 ；(4)第一次上清液加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，使其乙醇終濃度為50 %，攪拌，4°C靜置12-24h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第二次上清液和沉淀2 ；(5)第二次上清液加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，使乙醇終濃度為80 %，攪拌，4°C靜置 12-24h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第三次上清液和沉淀3 ；(6)合并沉淀1、沉淀2和沉淀3，干燥，得卷柏藥渣水提醇沉物，備做他用；將第三次上清液在溫度為40-50°C，壓力0. 09-0. IMI^a濃縮，干燥，得卷柏雌激素活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從卷柏中連續(xù)提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法，其特征在于，首先將卷柏120g用1200ml質(zhì)量濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次2h， 過(guò)濾、合并濾液，在溫度為40°C，壓力0. 09MPa濃縮，干燥，得卷柏95%醇提物5. 76g，即卷柏降血糖活性成分；然后將乙醇提取后的藥渣加水1200ml煎煮2次，每次池，過(guò)濾、合并濾液，在溫度為40°C，壓力0. 09MPa濃縮，干燥，得到卷柏藥渣水提物9. 39g ；卷柏藥渣水提物 9. 39g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95%乙醇，使其含乙醇濃度為30%，攪拌，4°C 靜置1 !過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第一次上清液；第一次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇濃度為50%，攪拌，4°C靜置1 過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇濃度為80%，攪拌，4°C靜置12h過(guò)夜，6000r/min離心 lOmin，得第三次上清液；將第三次上清液在溫度為40°C，壓力0. 09MI^濃縮，干燥，得卷柏藥渣水提去醇沉物1. 43g，即卷柏雌激素活性成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從卷柏中連續(xù)提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法，其特征在于，首先將卷柏MOg用MOOml質(zhì)量濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次2h， 過(guò)濾、合并濾液，在溫度為45°C，壓力0. 095ΜΙ^濃縮，干燥，得卷柏95%醇提物11. 56g，即卷柏降血糖活性成分；然后將乙醇提取后的藥渣加水MOOml煎煮2次，每次池，過(guò)濾、合并濾液，在溫度為45°C，壓力0. 095MPa濃縮，干燥得到卷柏藥渣水提物19. 44g ；卷柏藥渣水提物19. 44g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95 %乙醇，使其含乙醇濃度為30 %，攪拌，4°C靜置20h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第一次上清液；第一次上清液再加入95% 乙醇，使其乙醇濃度為50%，攪拌，4°C靜置20h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇濃度為80%，攪拌，4°C靜置20h過(guò)夜，6000r/min 離心lOmin，得第三次上清液；然后，將第三次上清液在溫度為45°C，壓力0. 095MPa濃縮，干燥，得卷柏藥渣水提去醇沉物3. 23g，即卷柏雌激素活性成分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從卷柏中連續(xù)提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法，其特征在于，首先將卷柏360g用3600ml質(zhì)量濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次池，過(guò)濾、合并濾液，在溫度為50°C，壓力0. IMPa濃縮，干燥，得卷柏95%醇提物17. 21g，即卷柏降血糖活性成分；然后將乙醇提取后的藥渣加水3600ml煎煮2次，每次池，過(guò)濾、合并濾液，在溫度為50°C，壓力0. IMPa濃縮，干燥得到水提物27. 15g ；藥渣水提物27. 15g置入 80°C水浴，使其完全溶解，再加入95 %乙醇，使其含乙醇濃度為30%，攪拌，4°C靜置24h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第一次上清液；第一次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇濃度為50%，攪拌，4°C靜置24h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇濃度為80%，攪拌，4°C靜置24h過(guò)夜，6000r/min離心lOmin，得第三次上清液；將第三次上清液在溫度為50°C，壓力0. IMI^a濃縮，干燥，得卷柏藥渣水提去醇沉物4. 31g，即卷柏雌激素活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及從卷柏中連續(xù)提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法，可有效解決獲得卷柏降血糖活性成分和雌激素活性成分，降低藥物成本、簡(jiǎn)化提取工藝的問(wèn)題，其解決的技術(shù)方案是將卷柏干燥用乙醇回流提取，過(guò)濾，干燥，得卷柏醇提物；將提取后剩余藥渣加入水，煎煮，過(guò)濾，濃縮，干燥，得藥渣水提物，藥渣水提物加水后，加熱至完全溶解，加入乙醇，攪拌，靜置，離心，上清液和沉淀，干燥沉淀，得卷柏藥渣水提醇沉物，備做他用；將上清液濃縮，干燥，得卷柏藥渣水提去醇沉物，本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，安全性強(qiáng)，生產(chǎn)成本低，適合工業(yè)生產(chǎn)，交叉成分少，藥效明確，安全有效。
文檔編號(hào)A61P5/30GK102266359SQ20111021120
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月8日
發(fā)明者馮衛(wèi)生, 張莉, 李冬梅, 王小蘭, 王瑋瑋, 蘇成福, 鄭曉珂 申請(qǐng)人:河南中醫(yī)學(xué)院