專利名稱：一種純化、識別胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，其涉及到細(xì)胞分化，具體涉及一種純化、識別胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
胰島細(xì)胞移植方法是治療糖尿病有效手段之一，但來源極為有限。研究如何獲得足夠多的人胰島β細(xì)胞已成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)課題。據(jù)此，發(fā)展識別和純化具胰島素分泌功能的細(xì)胞以及具分化胰島素分泌功能的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的有效方法已成為當(dāng)務(wù)之急。胰腺內(nèi)分泌干細(xì)胞(Pancreatic endocrine stem cells，例如Ngn3表達(dá)陽性的具分化能力的胰胚細(xì)胞)和前體細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后可分化或分泌胰島素的細(xì)胞，并用于治療糖尿病患者(Jiang，et al.，Stem Cells 2007 ；25 1940-53, Eshpeter, et al. ,Cell Prolif 2008 ；41 :843-58)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種純化胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種純化胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟(a)選擇待純化分類的候選細(xì)胞群；(b)用檢測試劑檢測該細(xì)胞群中Insm2表達(dá)陽性的細(xì)胞；(c)分離出Insm2表達(dá)陽性的細(xì)胞，純化，得到胰腺內(nèi)分泌干細(xì)胞。 優(yōu)選地，檢測步驟(b)所用的標(biāo)記檢測的試劑包括抗Msm2抗體或是Msm2的mRNA 的互補(bǔ)核苷酸。本發(fā)明的另一目的是提供一種識別內(nèi)分泌干細(xì)胞或前體細(xì)胞的方法，包括以下步驟(a) 一種Msm2特異檢測試劑接觸待識別的細(xì)胞；(b)檢測Insm2的表達(dá)；(c)發(fā)現(xiàn)Insm2的出現(xiàn)即為識別出所檢出的細(xì)胞為內(nèi)分泌干細(xì)胞或前體細(xì)胞。優(yōu)選地，所述檢測試驗(yàn)為含有抗Msm2抗體或一種與Msm2的mRNA互補(bǔ)的核苷酸。本發(fā)明的另一目的是提供一種識別可調(diào)節(jié)內(nèi)分泌細(xì)胞功能或啟動內(nèi)分泌細(xì)胞增殖化合物的方法。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種識別化合物的方法，該化合物可調(diào)節(jié)內(nèi)分泌細(xì)胞功能或啟動內(nèi)分泌細(xì)胞增殖，該方法包括常規(guī)高通量篩查中的各個步驟如化合物與^sm2陽性細(xì)胞接觸，以及測量該化合物對內(nèi)分泌細(xì)胞功能影響。一種識別Msm2活性調(diào)節(jié)因子的方法，包括與純化的Msm2接觸的一組試驗(yàn)的化合物，選擇與^sm2特異結(jié)合的化合物，和測驗(yàn)所選化合物對內(nèi)分泌細(xì)胞功能的影響。本發(fā)明證實(shí)hsm2是Snai VGfiVInsm1轉(zhuǎn)錄因子家族的新成員，與發(fā)育和疾病有重要關(guān)系。Insm2是胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞前體細(xì)胞的標(biāo)記物。這些細(xì)胞可分化成具糖誘導(dǎo)的分泌胰島素的β細(xì)胞。因此，Insm2可識別和純化胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞和前體細(xì)胞。這些細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后可分化或分泌胰島素的細(xì)胞并用于治療糖尿病患者(Jiang，et al.，Stem Cells 2007 ；25 :1940-53, Eshpeter, et al. ,Cell Prolif 2008;41:843-58)。Insm2 也能用于藥物靶標(biāo)以識別刺激干細(xì)胞和前體細(xì)胞分化或增殖的分子。Insm2還能用于幫助識別內(nèi)分泌干細(xì)胞/前體細(xì)胞的表面標(biāo)記。這樣就可以采流式細(xì)胞儀(FACQ等方法來純化內(nèi)分泌干細(xì)胞或前體細(xì)胞。


圖1是INSM2基因分析。圖2是人的INSM2和小鼠的hsm2在發(fā)育過程中和成年期組織表達(dá)水平的檢測。圖3是hsm2表達(dá)在成年人和小鼠的胰島細(xì)胞中。圖4是hsm2在斑馬魚胚胎發(fā)育期的表達(dá)。圖5是Ngn3和NeuroDl對hsm2的活化作用。圖6是Ngn3和NeuroDl誘導(dǎo)胰腺mPANC細(xì)胞的內(nèi)源性hsm2的表達(dá)。圖7是hsm2在小鼠胚胎發(fā)育過程和成年胰島表達(dá)調(diào)控的模式圖。
具體實(shí)施例方式I.引言本發(fā)明證實(shí)Msm2是內(nèi)分泌干細(xì)胞或前體細(xì)胞的一種標(biāo)記。因此，Insm2可用于純化和識別該類細(xì)胞，而在經(jīng)體外培養(yǎng)后，可回置于病人體內(nèi)。這些細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)增殖或分化成對糖反應(yīng)的分泌胰島素的細(xì)胞。Insm2也能用于藥物試驗(yàn)的靶標(biāo)。這樣的試驗(yàn)可用于識別和選擇能誘導(dǎo)內(nèi)分泌干細(xì)胞或前體細(xì)胞分化和/或增殖的藥物。Insm2還能用于幫助識別內(nèi)分泌干細(xì)胞或前體細(xì)胞的表面標(biāo)記物。這些表面標(biāo)記物可用于流式細(xì)胞儀純化細(xì)胞以及藥物試驗(yàn)的靶標(biāo)。一旦有足夠的具功能的人的β細(xì)胞，即可對糖尿病的治療和研究有重要的影響。 其中一個直接的應(yīng)用就是進(jìn)一步研究β細(xì)胞的生物學(xué)功能。高通量篩選糖尿病藥物也是應(yīng)用范圍之一。也可用于篩選能誘導(dǎo)內(nèi)分泌細(xì)胞分化的小分子或其它化合物。另外，這些細(xì)胞也可用于糖尿病的移植治療。II.定義本發(fā)明所用術(shù)語及其定義符合本領(lǐng)域科學(xué)研究的常規(guī)范疇。舉例如下“胰腺干細(xì)胞”是未分化的細(xì)胞，具有變成廣泛特殊細(xì)胞的潛能(如胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞和β細(xì)胞)。 胰腺干細(xì)胞包括胰胚干細(xì)胞、成年胰腺干細(xì)胞、前體細(xì)胞，和胰腺來源的多潛能前體細(xì)胞 (Calne，et al.，Nat Rev Endocrinol 2010 ；6 :173_7)?！皟?nèi)分泌細(xì)胞”是來源于成年或胚胎內(nèi)分泌腺(在胰腺或胰島)的一種細(xì)胞?！皟?nèi)分泌胰腺細(xì)胞”是指來源于成年或胚胎胰腺，特別是胰島細(xì)胞的細(xì)胞?！芭囵B(yǎng)”內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞是指原代培養(yǎng)以及表達(dá)重組核苷酸的細(xì)胞。培養(yǎng)內(nèi)分泌細(xì)胞也包括已經(jīng)轉(zhuǎn)型的細(xì)胞， 即使用癌基因等(如SV40T抗原，ras，或端粒酶基因等)。其它所用術(shù)語還包括多種“胰島細(xì)胞”，“誘導(dǎo)細(xì)胞分化”，“β細(xì)胞特異基因”，“糖反應(yīng)的分泌胰島素”，“轉(zhuǎn)錄因子”，“調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能”，“I型或II型糖尿病”，“免疫反應(yīng)”，“過表達(dá)”，“報道基因”，"Insm2”，"Insm2多肽”，“啟動子(promoter) ”，“試驗(yàn)化合物”，“候選藥物”，“抑制劑”，“激活劑”，“小的有機(jī)分子”，"RNAi 分子”，"siRNA"等等。III.本發(fā)明的細(xì)胞本發(fā)明提供一種方法，用以誘導(dǎo)細(xì)胞分化(如胰胚干細(xì)胞，胰腺來源的多潛能iPS 細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞)，該方法就是采用Insm2作為標(biāo)記來純化這些細(xì)胞。本發(fā)明所述的細(xì)胞可以是原代細(xì)胞也可能是維持培養(yǎng)的細(xì)胞。建立一種原代細(xì)胞培養(yǎng)的方法和技術(shù)可參見文獻(xiàn)(Chao,et al. , Cell Transplant 2008 ； 17 :657_64, Qi, et al. , J Vis Exp 2009 ；pii 1343)。合適的細(xì)胞包括內(nèi)分泌細(xì)胞和干細(xì)胞(如胰胚干細(xì)胞，成年干細(xì)胞和胰腺來源的多潛能前體細(xì)胞)。合適的內(nèi)分泌細(xì)胞包括胰腺細(xì)胞，胰島細(xì)胞(如β細(xì)胞和S細(xì)胞)。胰島細(xì)胞可來源于成年胰腺組織，發(fā)育期的胰腺組織和胰島樣細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞可來源于任何合適的哺乳動物或發(fā)育期的組織。例如，細(xì)胞可以從嚙齒類動物(小鼠、大鼠、天竺鼠和兔子)和非嚙齒類動物(如狗、貓、豬、羊、馬、牛和山羊)；靈長類動物如猩猩和人等。本發(fā)明在重組遺傳學(xué)方面采用常規(guī)的技術(shù)。常用的方法見Sambrook等的“分子克隆”中的基本內(nèi)容(Sambrook, et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual 1989 ； 2nd ed.)。IV.細(xì)胞培養(yǎng)本發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)方面采用常規(guī)技術(shù)，相應(yīng)的方法參見“動物細(xì)胞培養(yǎng)(1994年， 第三版)。一般來說，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境包括考慮細(xì)胞生長的底物，細(xì)胞密度和細(xì)胞之間的接觸、 氣相、培養(yǎng)基和溫度。細(xì)胞通常在37°C飽和濕度的孵育箱培養(yǎng)。CO2濃度為5%。常用的培養(yǎng)液為DMEM 和RPMI1640等。通常用低糖，并加10%熱滅活的小?；蛱ヅＱ?。培養(yǎng)液的PH為7. 2-7.4。 其它可加抗菌素、氨基酸和肝細(xì)胞生長因子等。細(xì)胞培養(yǎng)72小時后更換培養(yǎng)液。細(xì)胞生長的密度可根據(jù)不同的細(xì)胞類型由經(jīng)驗(yàn)判斷。當(dāng)細(xì)胞密度超過85%后即可傳代。V.治療糖尿病的方法本發(fā)明純化的細(xì)胞可用于治療糖尿病。例如，本方法所生產(chǎn)的分化的內(nèi)分泌細(xì)胞可用于胰島素依賴型的糖尿病(I型)的治療。治療過程中使用細(xì)胞的多少主要由臨床醫(yī)師綜合判斷決定。細(xì)胞毒性，移植反應(yīng)， 疾病的程度及進(jìn)展，以及抗移植細(xì)胞抗體的產(chǎn)生等均有影響。如何使用本發(fā)明生產(chǎn)的細(xì)胞， 可根據(jù)能否維持血糖水平，不同量的細(xì)胞的副作用，以及患者的體重及整體健康狀況來決
定。 所使用的細(xì)胞劑量應(yīng)使患者較長時間獲得治療效益。也可取決于細(xì)胞類型及患者的狀況，以及體重或體表面積等情況。劑量的大小也取決于副作用的出現(xiàn)，性質(zhì)和程度，以及是否伴隨著載體或轉(zhuǎn)型細(xì)胞類型等?？蓡蝿┝恳部啥鄤┝渴褂?。移植細(xì)胞的免疫注射是能否成功進(jìn)行胰島移植的一個主要障礙。任何供體細(xì)胞的移植均會被免疫細(xì)胞識別。但近年免疫排斥反應(yīng)已初步得到控制。使用本發(fā)明的永生化的細(xì)胞系的優(yōu)勢是基因工程后的移植細(xì)胞有可靠的質(zhì)量，可避免或抑制宿主的免疫反應(yīng)。藥物可接受的載體部分決定于所采用的特殊成分(如細(xì)胞或小分子)以及如何使用這些成分的特殊方法。相應(yīng)地，本發(fā)明可用的藥物成分形式可有較廣泛的選擇。使用形式可以是靜脈注射、肌肉注射、皮內(nèi)、腹腔或經(jīng)皮注射。VI.檢測Insm2陽性細(xì)胞檢測Insm2陽性細(xì)胞可采用常用的針對Insm2蛋白質(zhì)或RNA的方法，如特異性抗 Insm2抗體作組織化學(xué)染色或與Insm2核苷酸的互補(bǔ)鏈結(jié)合再與化學(xué)標(biāo)記物如熒光標(biāo)記， 同位素標(biāo)記等連接。VII.內(nèi)分泌細(xì)胞功能調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)本章舉例說明如何應(yīng)用Insm2表達(dá)細(xì)胞及識別其他調(diào)節(jié)內(nèi)分泌細(xì)胞功能的因子。A 試驗(yàn)試驗(yàn)是指采用本發(fā)明所用細(xì)胞來檢測與內(nèi)分泌細(xì)胞功能調(diào)節(jié)有關(guān)(抑制或激活) 有關(guān)因子的表達(dá)。如GK, SUR-LMafA,胰島素，granuphilin，chromagranin A等，這些調(diào)節(jié)因子對治療與糖代謝有關(guān)的疾患，糖尿病或低血糖有重要作用。功能異常的治療包括對各型糖尿病，胰島素瘤所致的高胰島素血癥，或因藥物或過量使用胰島素所致的低血糖，或因胰島素或胰島素受體的抗體所致的免疫疾病等。通過測試標(biāo)記物(InSm2)表達(dá)(RNA或蛋白質(zhì))可檢測出調(diào)節(jié)的功能。物理或化學(xué)變化的檢出也可以制定化合物對內(nèi)分泌細(xì)胞功能的影響。用未加化合物處理的樣本作對照，可檢測出化合物處理的細(xì)胞的抑制或激活的調(diào)節(jié)作用。舉例來說，試驗(yàn)之前可選轉(zhuǎn)染連接了某啟動子的報道基因，報道基因的表達(dá)表明所實(shí)驗(yàn)的化合物是β細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)因子。合適的報道基因包括熒光素酶(Luciferase)， 熒光蛋白(GFP)等。合適的啟動子包括胰島素啟動子，PDX-I啟動子，Insm2啟動子和 NeuroD/bete2 啟動子等。B調(diào)節(jié)物成為內(nèi)分泌細(xì)胞功能調(diào)節(jié)物可以是任何小分子化合物，或大分子，如蛋白質(zhì)，糖， 核苷酸或脂類。理論上任何化合物均可在本發(fā)明試驗(yàn)系統(tǒng)中檢測是否為調(diào)節(jié)物或底物。當(dāng)然，大部分化合物使用時為溶液或溶于有機(jī)物(特別是DMSO為基礎(chǔ)的)溶液。本試驗(yàn)方法是設(shè)計用于篩選的化合物庫。通常是自動化檢測。—個理想的實(shí)例是結(jié)合化合物和多肽來進(jìn)行高通量篩選，以找到有上述活性的化合物。這些化合物可作進(jìn)一步傳統(tǒng)的試驗(yàn)及實(shí)際治療。VIII.評估insm2系統(tǒng)的進(jìn)一步說明Ngn3是表達(dá)在內(nèi)分泌受體細(xì)胞中的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。采用來源于內(nèi)分泌胰腺的細(xì)胞系(cell line)，已發(fā)現(xiàn)Ngn3下游的幾個重要的轉(zhuǎn)錄因子(Murtaugh，et al., Development 2007 ；134 :427_38)。Insml就是其中之一，其對胚胎胰島的發(fā)育起關(guān)鍵作用 (Gierl，et al.，Genes Dev 2006 ；20 :2465_78)。從理論上來說，β細(xì)胞的產(chǎn)生可因新生細(xì)胞而出現(xiàn)(即從干細(xì)胞分化而來)，也可由已有的β細(xì)胞復(fù)制而來。人胰腺非內(nèi)分泌上皮細(xì)胞也具有向內(nèi)分泌細(xì)胞分化的能力。Insm2主要表達(dá)在內(nèi)分泌細(xì)胞如胰島細(xì)胞中。Insm2也表達(dá)在一些特殊的神經(jīng)細(xì)胞中，如大腦皮層的神經(jīng)細(xì)胞。本發(fā)明還有一點(diǎn)重要的發(fā)現(xiàn)，即Insm2是BHLH轉(zhuǎn)錄因子Ngn3 和NeuroDl的下游靶標(biāo)分子。Ngn3表達(dá)的增加或減少也直接導(dǎo)致Insm2表達(dá)的增加和減少。
以下實(shí)例表明Msn^在胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生和發(fā)育過程起重要作用。Insm2可標(biāo)示能變成新的胰腺內(nèi)分泌組織的細(xì)胞。以下實(shí)例由圖所示但不限于這些例子。實(shí)施例1人hsm2與hsml的氨基酸序列高度同源，屬于Snail/Gf il/Insml家族含C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的新成員。人的hSm2從人胰島細(xì)胞瘤cDNA基因文庫中用 PCR 方法(引物順序5 ‘ -CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3 ‘ ；reverse, 5' -ACAGCTGAACACCTTGTCGCACTC-3‘)分離出(GenBank acc. no.，NM_032594)，編碼 566 個氨基酸殘基(Protein Database acc. no.，NP_115983)，該蛋白質(zhì)的分子量為60kDa、等電點(diǎn)為9. 46(圖1)。hsm2與hsml有51%的同一性和56%相似性。從線蟲C. elegans到人類都存在直系同源&hSmlAnSm2，提示它是一個在進(jìn)化中相對保守的基因家族。(A)應(yīng)用NCBI提供的BLAST程序比較人INSM2與小鼠^1細(xì)2的氨基酸序列的高度同源性。(*)表示同一氨基酸，(“)表示缺少最佳對應(yīng)序列。N-端(氨基酸序列1160)包含如下幾個結(jié)構(gòu)域Snag結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列1-7)；兩個富含脯氨酸的區(qū)域(氨基酸序列35-55和氨基酸序列102-115)；核定位信號(氨基酸序列199-225)。C-端包含5個鋅指結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列261-566)。INSM1/INSM2家族蛋白特征性序列(氨基酸序列302-316)有下劃線。(B) 圖示比較INSM2和INSMl的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。Snag結(jié)構(gòu)域(綠色圓圈)；2個脯氨酸富含區(qū)(空白格子)；NLS核定位信號序列(綠色圓圈)。正方形格子代表每一個鋅指結(jié)構(gòu)域。紅色表示第一個鋅指結(jié)構(gòu)域的最后一個組氨酸被精氨酸代替。兩種蛋白質(zhì)的標(biāo)記性序列在第二個鋅指結(jié)構(gòu)域的末端(箭頭表示)。實(shí)施例2Insm2信使核糖核酸或INSM2蛋白質(zhì)表達(dá)在胚胎及成年胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞采用小鼠全長hsm2 cDNA作探針，Northern印跡試驗(yàn)顯示hsm2表達(dá)在小鼠胚胎時期，在胰腺發(fā)育階段的Ell. 5-E13. 5天，Insm2的表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖2)。采用針對INSM2 氨基酸(5-SRQVLLLQMPLRPGC-3)特異性兔抗體，^festern印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Insm2蛋白質(zhì)表達(dá)在成年胰腺，分子量約為60KDa (圖幻。采用hsm2特異性抗體的免疫組織化學(xué)染色，顯示INSM2蛋白質(zhì)表達(dá)在胰島內(nèi)分泌細(xì)胞，但在胰腺外分泌組織中未見其表達(dá)(圖幻。INSM2 蛋白質(zhì)也表達(dá)在腎上腺皮質(zhì)及髓質(zhì)的內(nèi)分泌細(xì)胞及許多腦神經(jīng)細(xì)胞如腦皮質(zhì)神經(jīng)元，海馬回和小腦神經(jīng)細(xì)胞。斑馬魚的原位雜交試驗(yàn)也證實(shí)hsm2 mRNA表達(dá)在發(fā)育的胰腺和神經(jīng)組織(圖4)。圖2中，(A)小鼠Insm2的信使核糖核酸(mRNA)在E6. 5-E18. 5天小鼠胚胎期的表達(dá)。Insm2信使核糖核酸的表達(dá)在Ell. 5-E13. 5期間有短期增強(qiáng)。以18S和28S信使核糖核酸標(biāo)示每條電泳泳道的mRNA是等量的。GAPDH作為模板對照。(B) INSM2信使核糖核酸在多種成年人組織的表達(dá)水平，其中在胰腺和心臟表達(dá)較高。Insm2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小標(biāo)示在每幅圖像的右側(cè)。(C)用兔抗INSM2抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析，可見在小鼠胰腺和腦組織hsm2蛋白質(zhì)的單條帶，約為60kDa(千道爾頓)。圖3中，(A)應(yīng)用INSM2抗體通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)INSM2 (綠色)在絕大多數(shù) (或者全部)小鼠的胰島細(xì)胞中表達(dá)。(B)與此相似，胰島素抗體顯示大多數(shù)的胰島細(xì)胞為胰島素陽性的β細(xì)胞(紅色)。A和B融合圖(C)表明Insm2和胰島素均表達(dá)在β細(xì)胞中(黃色)。(D)如箭頭所示，在人胰島β細(xì)胞及α細(xì)胞中檢測到INSM2(紅色)。(E)胰高血糖素抗體顯示α細(xì)胞(綠色)。(F)D和E的融合圖表明INSM2與胰高血糖素均表達(dá)在α細(xì)胞中(黃色)。標(biāo)尺為ΙΟΟμπι。圖4中(A)應(yīng)用斑馬魚全長hsm2 cDNA作為探針，對胚胎整體切片作原位雜交。 檢測發(fā)現(xiàn)hsm2信使核糖核酸表達(dá)在斑馬魚的胚胎胰腺。早在14體節(jié)期hsm2就開始表達(dá) (受精后14小時)，并且在20體節(jié)期(受精后19小時)表現(xiàn)明顯(雙箭頭所示)，右側(cè)方框有5倍的放大圖。另外，Insm2在神經(jīng)系統(tǒng)也有明顯表達(dá)(E)，且在頭端有較強(qiáng)表達(dá)(箭頭所示)。a,前端；ρ,后端。實(shí)施例3Insm2基因是Ngn3和NeuroDl下游的新靶標(biāo)Notch信號的失活引起Ngn3的激活是內(nèi)分泌胰腺發(fā)育開始的關(guān)鍵一步。最近的文獻(xiàn)表明 hsml 基因是 Ngn3 下游的靶標(biāo)(Mellitzer，et al. ,Embo J 2006 ;25 1344-52)，同時也是 NeuroDl 的靶標(biāo)(Breslin，et al.，J Biol Chem 2003 ；278 :38991-7)。因?yàn)?Insm2 是化81111的同源基因，故化81112也可能是Ngn3和NeuroDl下游的新靶標(biāo)。另外，基因芯片分析Ngn3基因剔除小鼠胰胚(E18. 5天)組織表明，Insml和hsm2基因的表達(dá)均顯著降低(平均下降6. 3倍以上)(Juhl，et al. ,Diabetes 2008 ；57 =2755-61)；參見文獻(xiàn)附錄的數(shù)據(jù)庫資料)。Insml基因剔除小鼠胰島細(xì)胞發(fā)育障礙及胰島素或胰高血糖素的產(chǎn)生障礙等證據(jù)，也提示其同源基因hsm2也可能參與胰島細(xì)胞的發(fā)育及內(nèi)分泌激素生成的信號傳導(dǎo)通路。為了判別Ngn3和NeuroDl是否調(diào)控小鼠hsm2基因的表達(dá)，Hela細(xì)胞被同時轉(zhuǎn)染hsm2啟動子和CMV-Ngn3和/或CMV-NeuroDl質(zhì)粒DNA。結(jié)果證明Ngn3和NeuroDl均可以激動hsm2熒光素酶報道基因的活性(圖5)。用腺病毒-Ngn3或腺病毒-NeuroDl表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染胰腺非內(nèi)分泌細(xì)胞而使之轉(zhuǎn)型分化后，通過實(shí)時PCR證明小鼠hsm2信使核糖核酸表達(dá)的增加(圖6)。圖5中(A)上圖攜帶小鼠Msn^啟動子熒光素酶報道基因的E-box及其近端 2. 5-kb的簡圖。下圖不同長度的小鼠hsm2啟動子熒光素酶構(gòu)建體的熒光素酶報道基因分析。應(yīng)用每個質(zhì)粒DNA (0. 5 μ g)和CMV-Ngn3或CMV-NeuroDl (有或無)進(jìn)行HeLa細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染(48小時)。(B)上圖0. 6-kb的hsm2啟動子熒光素酶報道基因兩個相鄰E_box 的簡圖。下圖Ngn3/E47-或NeuroDl/E47-介導(dǎo)的報道基因活性測定結(jié)果，0. 5μ g質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞48小時單純質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染(第一縱行)、與E47、Ngn3、NeuroDl、Ngn3/ E47和NeuroDl/E47共轉(zhuǎn)染(第2_6縱行)。(C)左側(cè)圖示野生型或突變型構(gòu)建體(包含 Insm2啟動子相鄰兩個E_box和TATA-熒光素酶報道基因)。右側(cè)圖示CMV-Ngn3/E47或 CMV-NeuroDl/E47試劑與0. 5 μ g報道基因質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染結(jié)果。(A-C)熒光素酶活性的測定方法參見產(chǎn)品說明(ftOmega，Madison, WI, USA)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用運(yùn)載體或構(gòu)建體的基本活性的倍數(shù)表示(均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染三份并重復(fù)三次。(D)Ngn3和NeuroDl偶聯(lián)于 Insm2啟動子。應(yīng)用MIN6小鼠胰島瘤細(xì)胞分離的染色質(zhì)與Ngn3抗體，NeuroDl抗體或IgG 進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)(ChIP)。連續(xù)稀釋DNA作為PCR分析的陽性對照。引物序列的描述見材料和方法。應(yīng)用Ngn3抗體或NeuroDl抗體進(jìn)行hsm2基因啟動子的免疫共沉淀分析，但與免疫前IgG無免疫反應(yīng)。陽性對照hsml與Ngn3或NeuroDl抗體進(jìn)行共沉淀，但與陰性對照BRCAl無免疫反應(yīng)。圖像代表三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。每一個圖像的右側(cè)標(biāo)有PCR產(chǎn)物的大小。圖6是Ngn3和NeuroDl誘導(dǎo)小鼠胰腺mPANC細(xì)胞的內(nèi)源性Insm2信使核糖核酸的表達(dá)。Ngn3或NeuroDl刺激后mPANC細(xì)胞的Insm2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物增加。RT-PCR結(jié)果顯示， 腺病毒_Ngn3或腺病毒-NeuroDl轉(zhuǎn)導(dǎo)胰腺mPANC細(xì)胞Insm2的表達(dá)增加(第3行圖)，但是，在腺病毒_載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞或親本mPANC細(xì)胞未檢測到。腺病毒-Ngn3轉(zhuǎn)導(dǎo)mPANC細(xì)胞中NeuroDl表達(dá)上調(diào)(第2行圖，帶1)。GAPDH作為樣本對照。圖中數(shù)據(jù)來自三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)施例4表達(dá)Insm2是Ngn3和NeuroDl的直接靶標(biāo)的基因證據(jù)因?yàn)樾∈驣nsm2啟動子順序含有10個假定的E-盒子，Ngn3和NeuroDl有可能直接調(diào)控Insm2的表達(dá)(圖5)。同時轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞不同長度的Insm2啟動子區(qū)域(0. 4-2. 5_kb) 以及CMV-Ngn3和/或CMV-NeuroDl質(zhì)粒DNA，過表達(dá)的結(jié)果顯示0. 6_kb的近端啟動子區(qū)域是Insm2與Ngn3或NeuroDl結(jié)合的最佳區(qū)間。突變試驗(yàn)進(jìn)一步證明，Insm2近端該區(qū)域內(nèi)的El和E2盒子均可與Ngn3和NeuroDl結(jié)合。另外，采取染色質(zhì)沉淀試驗(yàn)(ChIP)也證明了 Ngn3和/或NeuroDl與Insm2的直接結(jié)合(圖5)?？傊?，Ngn3或NeuroDl與Insml和Insm2啟動子的結(jié)合，均是通過與后二者啟動子近端區(qū)域的E盒子特異性的結(jié)合而成。結(jié)合以上數(shù)據(jù)表明，在早期胰腺發(fā)育過程中Ngn3 的表達(dá)，激活了下游Insm2的表達(dá)，并通過NeuroDl維持Insm2的表達(dá)在成年胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞(圖7)。圖7是Insm2在小鼠胚胎發(fā)育過程和成年胰島表達(dá)調(diào)控的模式圖。Ngn3的表達(dá)啟動了定向內(nèi)胚層內(nèi)分泌胰腺的發(fā)育(Murtaugh, et al.，Development2007 ；134 :427_38)。 本圖顯示Ngn3在胚胎發(fā)育第11. 5天至13. 5天，激活I(lǐng)nsm2在胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的顯著表達(dá) (紅色)。同時Ngn3也激活NeuroDl的表達(dá)并通過NeuroDl維持了 Insm2在成年胰島細(xì)胞的持續(xù)表達(dá)(綠色)。Insm2的表達(dá)受到Ngn3和NeuroDl的雙重調(diào)控，Insm2表達(dá)的高峰以黑體字標(biāo)示。實(shí)施例5本實(shí)施例的純化胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟(a)選擇待純化分類的候選細(xì)胞群；(b)用檢測試劑檢測上述細(xì)胞群中Insm2表達(dá)陽性的細(xì)胞；所述的檢測試劑包括有抗Insm2抗體或Insm2的mRNA的互補(bǔ)核苷酸；(c)分離出Insm2表達(dá)陽性的細(xì)胞，純化，得到胰腺內(nèi)分泌干細(xì)胞。檢測Insm2陽性細(xì)胞可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的針對Insm2蛋白質(zhì)或RNA的方法，如特異性抗Insm2抗體作組織化學(xué)染色或與Insm2核苷酸的互補(bǔ)鏈結(jié)合再與化學(xué)標(biāo)記物如熒光標(biāo)記，同位素標(biāo)記等連接。本實(shí)施例所述識別內(nèi)分泌干細(xì)胞或前體細(xì)胞的方法，包括以下步驟(a)用Insm2特異檢測試劑接觸待識別的細(xì)胞；所述檢測試劑含有抗Insm2抗體或一種與Insm2的mRNA互補(bǔ)的核苷酸；(b)檢測Insm2的表達(dá)(c)發(fā)現(xiàn)Insm2的出現(xiàn)即為識別出所檢出的細(xì)胞為內(nèi)分泌干細(xì)胞或前體細(xì)胞。
上述純化胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法和識別內(nèi)分泌干細(xì)胞或前體細(xì)胞的方法中的檢測試劑和檢測手段可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)目前現(xiàn)有的技術(shù)而實(shí)現(xiàn)，也可以參考前述實(shí)施例的方法。本實(shí)施例所述識別小分子化合物(例如高通量篩查庫中的某些小分子化合物)的方法，該小分子化合物可調(diào)節(jié)內(nèi)分泌細(xì)胞功能或啟動內(nèi)分泌細(xì)胞增殖，該方法包括常規(guī)高通量篩查中的各個步驟如與Insm2陽性細(xì)胞接觸的化合物，以及測量該化合物對內(nèi)分泌細(xì)胞功能影響。這些化合物的也可通過候選的小分子化合物等檢測試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)。

本實(shí)施例所述識別Insm2活性調(diào)節(jié)因子的方法，該方法包括與純化的Insm2接觸的一組試驗(yàn)的化合物，選擇與Insm2特異結(jié)合的小分子化合物，和測驗(yàn)所選的化合物對內(nèi)分泌細(xì)胞功能的影響。本實(shí)施例所述在個體中產(chǎn)生內(nèi)分泌細(xì)胞的方法，該方法包括對該個體使用有效劑量的化合物或調(diào)控Insm2的表達(dá)。該化合物可選擇性地調(diào)控Insm2的表達(dá)。以上是針對本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說明，但該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。
權(quán)利要求
1.一種純化胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)選擇待純化分類的候選細(xì)胞群；(b)用檢測試劑檢測上述細(xì)胞群中Msm2表達(dá)陽性的細(xì)胞；(c)分離出Insm2表達(dá)陽性的細(xì)胞，純化，得到胰腺內(nèi)分泌干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述純化胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法，步驟(b)所述的檢測試劑包括有抗Msm2抗體或Msm2的mRNA的互補(bǔ)核苷酸。
3.一種識別內(nèi)分泌干細(xì)胞或前體細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)用Msm2特異檢測試劑接觸待識別的細(xì)胞；(b)檢測Insm2的表達(dá)；(c)發(fā)現(xiàn)Msm2的出現(xiàn)即為識別出所檢出的細(xì)胞為內(nèi)分泌干細(xì)胞或前體細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述識別內(nèi)分泌干細(xì)胞或前體細(xì)胞的方法，其特征在于，所述檢測試劑含有抗^sm2抗體或一種與Msm2的mRNA互補(bǔ)的核苷酸。
5.一種識別小分子化合物的方法，該小分子化合物可調(diào)節(jié)內(nèi)分泌細(xì)胞功能或啟動內(nèi)分泌細(xì)胞增殖，其特征在于，該方法包括小分子化合物與Msm2陽性細(xì)胞接觸，以及測量該化合物對Msm2陽性細(xì)胞功能影響。
6.一種識別hs叫活性調(diào)節(jié)因子的方法，其特征在于，該方法包括與純化的^ism2接觸的一組試驗(yàn)的化合物，選擇與^sm2特異結(jié)合的小分子化合物，和檢測所選的化合物對內(nèi)分泌細(xì)胞功能的影響。
7.一種在個體中產(chǎn)生內(nèi)分泌細(xì)胞的方法，其特征在于，該方法包括對該個體使用有效劑量的化合物或調(diào)控Msm2的表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，該化合物可選擇性地調(diào)控nsm2的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種純化胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟組成選擇待純化分類的候選細(xì)胞群，用檢測試劑檢測上述細(xì)胞群中Insm2表達(dá)陽性的細(xì)胞；分離出Insm2表達(dá)陽性的細(xì)胞，純化，得到胰腺內(nèi)分泌干細(xì)胞。本發(fā)明還公開了利用檢測Insm2來識別內(nèi)分泌干細(xì)胞或前體細(xì)胞。
文檔編號A61K45/00GK102321572SQ20111021500
公開日2012年1月18日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月29日
發(fā)明者蔡濤, 陳翔 申請人:余躍紅, 蔡濤