專利名稱：一種微小rna在預防和/或治療心臟疾病中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程領域及心臟疾病的預防和治療領域，涉及一種外源性的非編碼小RNAs的新用途，具體涉及一種微小RNA(microRN A, miRNA)在預防和/或治療心臟疾病中的用途。
背景技術：
目前，心血管疾病是人類健康和生命的主要威脅，是人類健康的頭號殺手，全世界范圍內每年有一千七百萬人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌癥死亡率的總和。在我國，隨著人民生活水平日益提高和飲食結構的改變，心血管疾病死亡率呈明顯上升趨勢，已超過癌癥成為第一大致死原因。根據(jù)國家衛(wèi)生部2004年底公布的最新統(tǒng)計結果表明，我國18歲及以上居民高血壓患病率為18.8%，估計全國患病人數(shù)超過I. 6億，由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病以及心力衰竭等凋亡相關心臟疾病的病人達幾千萬。 目前關于心臟疾病發(fā)病機理尚不完全清楚，心臟疾病的預防、診斷和治療尚不能達到讓人滿意的效果，急需開發(fā)新的技術、方法用于心臟病的診斷、預防和治療。miRNA是新近研究發(fā)現(xiàn)的一類內源性非編碼小RNA分子。許多研究表明，miRNA對于維持心臟正常生理功能具有重要作用，心臟中的miRNA異常表達與許多心臟疾病的發(fā)生相關。因此，將miRNA作為心臟疾病治療的靶點，開發(fā)相關藥物具有潛在的臨床應用價值。細胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細胞死亡，是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束生命的過程。它是一個主動的、高度有序的、由基因控制及一系列酶參與的過程，對正常胚胎發(fā)育，維持細胞群體及惡性病變過程中均起重要作用，在保證多細胞生物的健康生存過程中扮演著關鍵的角色。在許多心肌損傷或心臟病理狀態(tài)下，如心肌缺血再灌注損傷、心肌肥大、心力衰竭等，心肌細胞都會發(fā)生凋亡。由于成熟的心肌細胞不能分裂增殖，心肌細胞過度凋亡必然會使心肌細胞數(shù)目減少，這一點可能是一些心臟疾病發(fā)病的機理。鈣調磷酸酶(calcineurin)在心肌梗死及心肌肥厚等心臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，抑制calcineurin的表達或活性在預防、治療這些心臟疾病中具有潛在的應用價值。目前研究發(fā)現(xiàn)許多miRNA通過調控凋亡相關靶蛋白的表達而參與細胞凋亡的發(fā)生，這些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的。開發(fā)以miRNA為策略的心臟疾病的診斷、預防和治療具有極其重要的意義和應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是設計針對鈣調磷酸酶催化亞基mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)互補的微小RNA (miRNA)，將其命名為miRNA-4pp，它具有抑制鈣調磷酸酶表達的作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA-4pp能夠抑制心肌細胞凋亡，并且確定了其在心肌缺血再灌、心肌梗死、冠心病、心肌纖維化等心臟疾病中的關鍵作用，目的是將其應用到這些心臟疾病的預防及治療中。
本發(fā)明的目的是采用以下技術方案來實現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種微小RNA在制備用于預防和/或治療心臟疾病的藥物中的用途，其中所述微小RNA為包含以下SEQ ID NO :1序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5，-UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3，。優(yōu)選地，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、冠心病、心肌肥厚和心肌纖維化。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于預防和/或治療心臟疾病的藥物組合物，其包含治療有效量的微小RNA和藥學上可接受的病毒、載體或輔料，其中所述微小RNA為包含以下SEQ ID NO : I序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5， -UUAAGACUGCCUAAUUCA⑶UU-3，。 優(yōu)選地，所述藥學上可接受的載體或輔料選自殼聚糖、膽固醇、脂質體、納米顆粒等。其中納米顆粒是一種人工制造的、大小不超過100納米的微型顆粒，可能是乳膠體、聚合物、陶瓷顆粒、金屬顆粒和碳顆粒。優(yōu)選地，所述藥物組合物的給藥方式為口服給藥或注射給藥；更優(yōu)選地，所述注射給藥方式選自靜脈注射、肌肉注射、冠狀動脈內注射和心肌注射。再一方面，本發(fā)明提供一種用于預防和/或治療心臟疾病的藥物組合物在制備用于預防和/或治療心臟疾病的藥物中的用途。優(yōu)選地，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、冠心病、心肌肥厚和心肌纖維化。綜上所述，本發(fā)明人通過實驗證明miRNA_4pp在心肌缺血損傷及心肌細胞凋亡中的變化及其心肌保護作用。具體地，本發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-4pp具有抑制心肌細胞凋亡的功能。通過合成miRNA-4pp模擬物,加強miRNA_4pp的表達可以抑制心肌細胞凋亡。小鼠尾靜脈注射miR-4pp可以減輕缺血再灌注損傷所致的心肌細胞凋亡，減小心肌梗死面積，可改善缺血再灌注損傷所致的心功能失調，檢測指標包括左室舒張末壓(LVEDP)，左室壓力上升和下降最大變化速率(±dp/dt max)和LVEF(左室射血分數(shù))。給予miRNA_4pp還能改善缺血再灌注損傷所致的心臟重塑，包括降低心重體重比，邊緣區(qū)的心肌細胞橫截面積(WGA染色)及心肌纖維化(Masson染色)并改善心功能。miRNA_4pp通過抑制心肌細胞凋亡對心臟具有保護作用，miRNA-4pp對許多心臟疾病具有潛在的預防和治療價值。由此可見，本發(fā)明人通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-4pp (5’ -UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3，)通過抑制心肌細胞凋亡對心臟具有保護作用。過表達miRNA-4pp，可以抵抗心肌缺血再灌注損傷，心肌梗死面積減少，心功能顯著改善、心肌纖維化及心臟結構重塑均在一定程度上被抑制。將miRNA-4pp模擬物或與適當?shù)妮d體結合形成藥物，導入心臟或體內，對許多心臟疾病將具有預防及治療作用。發(fā)明人通過合成miRNA-4pp模擬物從小鼠尾靜脈注射給藥，發(fā)現(xiàn)心肌缺血損傷程度明顯被抑制，在動物模型證明了 miRNA-4pp對缺血性心臟病的治療作用。因此，本發(fā)明提供了將miRNA-4pp與適當載體或輔料如殼聚糖、膽固醇、脂質體、納米顆粒等包裝形成藥物，通過口服、靜脈注射、肌肉注射、冠狀動脈內注射或直接心肌注射的方式，用于預防和/或治療心臟疾病、改善心臟功能、阻止心肌纖維化及心肌重構的發(fā)生。


以下，結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖I為過表達miRNA_4pp對缺氧誘導的原代心肌細胞凋亡的影響；其中，圖IA為miRNA-4pp模擬物(圖中以miRNA_4pp表示)轉染原代心肌表達水平檢測，miR-NC為作為陰性對照；圖IB為原代心肌細胞轉染miRNA-4pp模擬物對缺氧誘導的心肌細胞凋亡的影響，miR-NC為作為陰性對照；圖2為過表達miRNA_4pp對心肌缺血損傷的抵抗作用；其中，圖2A為小鼠尾靜脈注射miRNA-4pp模擬物(圖中以miRNA_4pp表示)后檢測心肌組織miRNA_4pp表達水平，其中miR-NC作為陰性對照；圖2B為過表達miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠心肌缺血再灌注后心肌細胞凋亡的比較，以假手術處理的小鼠作為對照；其中圖2C為過表達miRNA-4pp 小鼠及miRNA-NC小鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面積比較，其中的1、2、3、4分別表示每組試驗的心肌梗死的表觀圖。圖3為過表達miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠心肌缺血再灌注后24小時心功能狀況比較；圖3A檢測為LVEDP(左室舒張末壓)的比較結果，圖3B為檢測±dp/dt max(左室壓力上升和下降最大變化速率)的比較結果，圖3C為檢測LVEF (左室射血分數(shù))的比較結果，均以假手術處理的小鼠作為對照。圖4為過表達miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠心肌缺血再灌注后2周心臟重塑、心肌纖維化及心功能比較；其中圖4A為心重體重比比較；圖48為麥胚凝集素(WGA)染色比較心肌細胞橫截面面積；圖4C為Masson染色比較心肌纖維化程度；圖4D為心功能狀況比較，檢測指標包括左室收縮內徑(LVIDs)、左室舒張內徑(LVIDd)、短軸縮短率(FS)，均以假手術處理的小鼠作為對照。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。除非特別說明，以下各實施例中使用的實驗動物C57小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；提取總RNA使用Trizol試劑盒(Invitrogen公司)，逆轉錄反應使用逆轉錄試劑盒(Takara公司)，實時熒光定量PCR技術檢測miRNA-4pp的表達水平的方法參見 Chen, C. , et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loopRT-PCR. Nucleic Acids Res 33，el79，2005。miRNA_4pp 模擬物的序列為 SEQ ID NO :1:5’ -UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3’，由上海吉瑪公司合成。實施例lmiRNA_4DD抑制心肌細胞凋亡的實驗本實施例中以原代培養(yǎng)的心肌細胞為模型，檢測miRNA_4pp是否能夠抑制心肌細胞的凋亡。對于心肌細胞凋亡實驗模型，參照文獻Tan，ff. Q.，Wang, K.，Lv, D. Y. &Li，
P. F. Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy through TransactivatingCatalase. J Biol Chem 283，29730-29739 (2008)中記載的方法培養(yǎng)大鼠乳鼠原代心肌細胞。原代心肌細胞轉染miRNA-4pp模擬物以過表達miRNA_4pp，同時轉染miRNA-NC作為陰性對照。轉染采用脂質體(購自Invitrogen公司)，miRNA-4pp及miRNA-NC終濃度為150nM。轉染24小時后，在低氧培養(yǎng)箱(氧含量小于I %)中培養(yǎng)處理細胞24小時，誘導細胞凋亡。提取RNA，進行逆轉錄反應后，通過實時熒光定量PCR技術檢測miRNA-4pp的表達水平。臺盼蘭染色方法檢測心肌細胞凋亡情況，具體方法如下臺盼藍的使用濃度為O. 4%，用胰蛋白酶將細胞消化成單個分離的細胞，連同上清一起收集細胞，經PBS洗滌，加適量臺盼藍混勻染色，光鏡下任意選取4-5個視野計數(shù)，每組計數(shù)總細胞數(shù)約200個，計算被染成藍色的細胞占所有細胞的比例，就可估算細胞的凋亡率。結果顯示，原代心肌細胞轉染miRNA_4pp后，miRNA_4pp表達水平顯著上升，見圖IA0過表達miRNA-4pp可以顯著抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡，結果見圖1B。 實施例2miRNA-4DD過表達抑制心肌缺血損傷實驗驗證本實施例驗證了 miRNA_4pp過表達是否能夠抑制心肌缺血損傷。I.小鼠經尾靜脈注射miRNA_4pp模擬物可顯著抑制心肌缺血再灌注損傷以C57小鼠為實驗對象，按照如下方法注射miRNA-4pp模擬物或miRNA-NC 小鼠尾靜脈20mg/kg注射miR_4pp模擬物或陰性對照miRNA-NC。模擬物注射3天后，進行心臟缺血再灌注手術，并以假手術處理的小鼠作為對照，具體操作如下小鼠麻醉后，背位固定于實驗用木板上，并進行心電圖監(jiān)測。頸部正中切開氣管并插管，連動物人工呼吸機，于第四肋間開胸，小心提起心包并剪開，充分暴露心臟、血管。在肺動脈圓錐和左心耳之間，以左冠狀靜脈主干為標志，于左心耳根部下方2_處進針，進針深度O. 5mm ;以6/0帶針縫合線穿過心肌表層，在肺動脈圓椎旁出針；待心電圖恢復穩(wěn)定IOmin后，予以結扎左冠狀動脈前降支(LAD)。以I、aVL導聯(lián)ST段弓背向上抬高大于O. Imv并持續(xù)O. 5小時以上作為結扎成功的標志。缺血45min之后，松開結扎線開始再灌注。以ST段下降為標志。清除胸腔內積血并用去針頭注射器抽吸氣體關閉胸腔。再灌注3小時，進行TUNEL檢測心肌細胞凋亡。再灌注24小時，用Evans blue/TTC雙染測定心肌梗死面積。具體方法如下心肌缺血再灌注模型建立24小時后，重新結扎左前降支，注射2 %伊文斯藍(Evans blue),取出心臟,用生理鹽水洗去血液后,稱取全心重和心室重量,沿著垂直于左室長軸的方向將左心室橫切成5片切片，置于37°C。I %氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸緩沖液中染色15min，數(shù)碼相機記錄每片心肌的情況，剪去各心肌片被染色的非梗塞區(qū)，把未染色梗塞區(qū)的心肌稱重，除以全心重或心室重分別得到梗塞范圍占全心重或占心室重的百分率，此即心肌梗塞面積。心梗面積按如下方法計算左心室面積(left ventricle, LV)為藍色、紅色和白色面積之和；危險區(qū)總面積(area at risk, AAR)為紅色和白色面積之和；梗死區(qū)面積(infarct area, INF)為白色面積。危險區(qū)面積(AAR/LV, % )=(危險區(qū)總面積/左心室面積)X 100% ;心梗面積(INF/AAR，% )=(梗死區(qū)面積/危險區(qū)總面積)X 100%。實時定量PCR檢測了心肌組織中miRNA_4pp表達水平，結果顯示，注射miR_4pp模擬物的小鼠缺血/再灌注(I/R)組心肌組織比miRNA-NC小鼠I/R組凋亡細胞數(shù)目明顯減少(圖3B)，心肌梗死面積明顯減少(圖3C)，有統(tǒng)計學差異(P < O. 01)。實施例3miRNA_4pp過表達小鼠在心肌缺血再灌注中具有改善心功能的作用。參照實施例2的方法,對miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠實行缺血再灌注手術，并以假手術處理的小鼠作為對照，缺血45分鐘再灌注24小時，采用Millar導管閉胸式經頸動脈插管法(SPR-839, Millar Instrument, Houston, Texas)對 miRNA_4pp 小鼠(η=8)和miRNA-NC小鼠(η = 8)進行心功能監(jiān)測,檢測方法參見Yan Feng, et al. Innateimmune adaptor MyD88mediates neutrophil recruitment and myocardial injury afterischemia-reperfusion in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol.2008September ；295(3) :H1311-H1318。檢測指標包括左室舒張末壓(LVEDP)，左室壓力上升和下降最大變化速率(土 dp/dt max)和左室射血分數(shù)(LVEF)。結果顯示，與對照小鼠I/R相比，miR-4pp過表達小鼠I/R的LVEDP顯著降低，±dp/dt max與LVEF均明顯升高,說明miRNA_4pp過表達具有改善心功能的作用(圖3)。·實施例4miRNA-4DD過表達改善心功能，阻止心臟結構重塑、心肌纖維化的實驗驗證參照實施例2的方法，對miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠進行心肌缺血再灌注手術，并以假手術處理的小鼠作為對照。缺血再灌注兩周取心臟進行WGA及Masson染色，分別用來觀察小鼠心肌細胞橫截面積大小及纖維化程度。具體方法參見Lin, Z. , et al. miR-23a functionsdownstream of NFATc3 to regulate cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U SA106，12103-12108 (2009)和 Dolber，P. C.，Bauman，R. P.，Rembert, J. C. &Greenf ield,J. C.，Jr. Regional changes in myocyte structure in model of canine right atrialhypertrophy. Am J Physiol267，H1279-1287 (1994) 結果如圖4所示，表明與miRNA-NC小鼠I/R組相比，miR-4pp過表達小鼠I/R組的心重/體重比(圖4A)、橫截面積(圖4B)與膠原面積(圖4C)都顯著下降，說明miRNA-4pp可以阻止心臟結構重塑、心肌纖維化。同時miRNA-4pp小鼠心功能也得到顯著改善(圖4D)。
權利要求
1.一種微小RNA在制備用于預防和/或治療心臟疾病的藥物中的用途，其中所述微小RNA為包含以下SEQ ID NO : I序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5， -UUAAGACUGCCUAAUUCA⑶UU-3，。
2.根據(jù)要求I所述的用途，其特征在于，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、冠心病、心肌肥厚和心肌纖維化。
3.一種用于預防和/或治療心臟疾病的藥物組合物，其包含治療有效量的微小RNA和藥學上可接受的病毒、載體或輔料，其中所述微小RNA為包含以下SEQ ID NO :1序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5， -UUAAGACUGCCUAAUUCA⑶UU-3，。
4.根據(jù)權利要求3所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學上可接受的載體或輔料選自殼聚糖、膽固醇、脂質體、納米顆粒。
5.根據(jù)權利要求3或4中任一項所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物以口服或注射的方式給藥；優(yōu)選地，所述注射給藥方式選自靜脈注射、肌肉注射、冠狀動脈內注射和心肌注射。
6.根據(jù)權利要求3至5中任一項所述的藥物組合物在制備用于預防、治療心臟疾病的藥物中的用途。
7.根據(jù)權利要求6所述的用途，其特征在于，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、冠心病、心肌肥厚和心肌纖維化。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微小RNA在預防和/或治療心臟疾病中的用途。本發(fā)明提供的微小RNA為包含以下SEQ ID NO1序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5’-UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3’。該微小RNA可以作為一種新型的藥物組合物用于心臟疾病的預防和/或治療。
文檔編號A61P9/04GK102895671SQ20111021699
公開日2013年1月30日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權日2011年7月29日
發(fā)明者李培峰, 王建勛, 焦建琴, 李倩, 龍波 申請人:中國科學院動物研究所