專利名稱：miRNAs作為調(diào)節(jié)胰島素敏感性的靶標(biāo)的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和藥學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及若干個(gè)microRNAs,特別是miR-181a作為 調(diào)節(jié)胰島素敏感性的靶標(biāo)的新用途。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種常見的危害人類健康的慢性代謝疾病。根據(jù)糖尿病的發(fā)病機(jī)制，可將糖尿病分為I型糖尿病和2型糖尿病。I型糖尿病主要由于自身免疫性失常而導(dǎo)致胰腺中胰島β細(xì)胞受損,進(jìn)而引起胰島分泌不足。2型糖尿病是糖尿病的主要形式，發(fā)病率占糖尿病的90%以上，其特點(diǎn)是胰島素刺激的靶組織出現(xiàn)胰島素抵抗癥狀。胰島素的主要功能為降低血糖水平，促進(jìn)骨骼肌和脂肪對(duì)葡萄糖的吸收，同時(shí)抑制肝臟中的糖異生。當(dāng)機(jī)體不能夠?qū)φ舛鹊囊葝u素產(chǎn)生適當(dāng)?shù)捻憫?yīng)時(shí)即產(chǎn)生所謂的胰島素抵抗。胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致胰島素分泌代償性增加，長(zhǎng)此以往會(huì)逐漸導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能的衰竭。肝臟作為胰島素作用的主要靶器官，在維持空腹?fàn)顟B(tài)下內(nèi)源性葡萄糖的生成、輸出以及進(jìn)食后葡萄糖的吸收、利用和儲(chǔ)存等方面發(fā)揮著重要作用。肝臟胰島素抵抗主要指胰島素抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成、肝糖異生和糖原降解的能力下降，這在很大程度上可導(dǎo)致空腹血糖的升高并持續(xù)刺激胰島細(xì)胞分泌胰島素。肝臟特異性敲除胰島素受體底物Irsl或lrs2的小鼠分別在進(jìn)食后或在禁食階段表現(xiàn)出顯著的胰島素抵抗，證明肝臟胰島素抵抗在高血糖、糖耐量異常和糖尿病中發(fā)揮著重要作用。胰島素抵抗的發(fā)生成因復(fù)雜，受環(huán)境、遺傳等多種因素影響，目前改善胰島素抵抗依然是當(dāng)前治療2型糖尿病的主要方法之
OSIRTl是一種保守的NAD+依賴性去乙?；?，屬于哺乳動(dòng)物Sirtuin家族成員之一，可使多種底物去乙?；惺箯V泛的生物學(xué)作用。目前對(duì)SIRTl的功能研究發(fā)現(xiàn)，它具有延長(zhǎng)酵母、線蟲和果蠅等多種生物壽命的功能。SIRTl在哺乳動(dòng)物的肝臟、脂肪、肌肉、腎臟等多種器官和組織中廣泛表達(dá)，并參與調(diào)節(jié)血糖平衡和胰島素分泌等重要的生理過程。目前越來越多研究表明SIRTl對(duì)胰島素敏感性和2型糖尿病的具有改善作用，很可能成為治療2型糖尿病的潛在分子靶標(biāo)。在骨骼肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肝臟細(xì)胞中，SIRTl均顯示出對(duì)胰島素信號(hào)通路的正向調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)基因過表達(dá)SIRTl的2型糖尿病模型db/db小鼠和高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠均表現(xiàn)出糖耐量和胰島素敏感性的改善?？诜o予高脂飲食誘導(dǎo)的老年小鼠，劑量為22. 4mg/kg/天的SIRTl激動(dòng)劑白藜蘆醇，能夠改善其胰島素敏感性，并使其體重發(fā)生略微的下降。白藜蘆醇和其他的一些SIRTl的小分子激動(dòng)劑，例如SRT1720等，同樣顯示出可預(yù)防飲食誘導(dǎo)的肥胖和減輕胰島素抵抗的特性。因此，SIRTI在胰島素抵抗相關(guān)疾病如2型糖尿病、肥胖癥等代謝疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要的作用，日后對(duì)于SIRTl調(diào)控因子的研究將為改善胰島素抵抗和治療2型糖尿病提供新的思路。在肝臟中，SIRTl被認(rèn)為參與調(diào)控葡萄糖體內(nèi)平衡。SIRTl可以去乙?；^氧化物酶增殖體受體Y輔活化因子I α (peroxisome proliferator-activatedreceptor y coactivator-lalpha, PGC-1 a )。PGC-1 a是核受體過氧化物酶增殖體受體Y (peroxisome proliferator-activated receptor y , PPAR γ )的一種轉(zhuǎn)錄輔活化因子，可在基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控肝臟中葡萄糖代謝。SIRTl通過去乙?；疨GC-Ia使糖異生基因表達(dá)增加，同時(shí)抑制糖酵解基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肝糖輸出，調(diào)控肝臟的葡萄糖代謝。在胰島素抵抗的肝細(xì)胞H 印G2中，SIRTl蛋白水平降低，并且下調(diào)或抑制SIRTl可降低HepG2細(xì)胞中胰島素受體磷酸化水平及糖原合成能力對(duì)胰島素的響應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素抵抗。在發(fā)生胰島素抵抗的小鼠肝臟中用腺病毒過表達(dá)SIRTl可以緩解脂肪肝和胰島素抵抗(Li，Y.，et al. ,Hepatic overexpression of SIRT Iin mice attenuates endoplasmic reticulumstress and insulin resistance in the liver. FASEB J,2011)o目前，一類參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼小RNA-microRNAs引起了越來越多生物學(xué)家的興趣，成為現(xiàn)今生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。從microRNAs的表達(dá)和生物學(xué)產(chǎn)生兩個(gè)方面可以從如下幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行定義①成熟的miRNA是約有22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，通過RNA印跡(Northern blot)可檢測(cè)到的內(nèi)源非編碼RNA 成熟的microRNAs來源于具有特定二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體(pre-miRNA) 成熟的microRNAs由Dicer酶不對(duì)稱加工形成,在Dicer酶缺陷型個(gè)體中，會(huì)檢測(cè)到pre-miRNA的累積；④成熟microRNAs的序列和pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)在不同物種間存在保守性。已經(jīng)被鑒定的microRNAs可以通過一些網(wǎng)站進(jìn)行檢索，例如 Sanger 研究所的 microRNA 網(wǎng)站http://microrna. sanger. ac.uk/。MicroRNAs廣泛存在于真核生物中，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、代謝和凋亡等一系列生理進(jìn)程，調(diào)節(jié)生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝，并與多種疾病相關(guān)。MicroRNAs進(jìn)入RISC形成miRNP，在動(dòng)物細(xì)胞中microRNAs通常與靶基因3’ UTR以完全或不完全配對(duì)的形式相結(jié)合，從而引導(dǎo)miRNP到達(dá)目標(biāo)mRNA。MiRNP與目標(biāo)mRNA的相互作用可以直接抑制靶基因翻譯的起始，也可以加速目標(biāo)mRNA的去腺苷化，從而抑制翻譯的起始或?qū)е履繕?biāo)mRNA穩(wěn)定性降低發(fā)生降解，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。目前的研究表明microRNAs在代謝相關(guān)組織，如腦，肝臟，肌肉，脂肪和胰島等組織中具有重要的生物學(xué)功能。但是，現(xiàn)有已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的microRNAs種類繁多，可能發(fā)揮著各種各樣不同的功能，正面的或者負(fù)面的功能都有。因此，很有必要深入研究這些microRNAs，對(duì)其功能進(jìn)行深入了解，以期找到新的、有用的藥物靶點(diǎn)，為疾病的臨床治療尋找新的突破□。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供若干個(gè)microRNAs，特別是miR_181a作為調(diào)節(jié)胰島素敏感性的靶標(biāo)的新用途。在本發(fā)明的第一方面，提供一種miR-181a抑制劑的用途，用于制備提高胰島素敏感性的組合物。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的組合物還用于抑制胰島素抵抗，改善糖代謝，預(yù)防或治療糖代謝失調(diào)相關(guān)疾病(如2型糖尿病)。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于上調(diào)SIRTl蛋白的表達(dá)；上調(diào)胰島素刺激的InsR，Akt或Gsk3 β磷酸化水平；和/或
上調(diào)胰島素刺激的糖原合成酶活性或糖原合成。在另一優(yōu)選例中，所述的mi R-181 a抑制劑是抑制或阻止mi R-181 a (更特別地，為miR-181a的序列(SEQ ID NO 1)中第1-8位)與其靶向基因位點(diǎn)(較佳地，為SIRTl的3’ UTR的UGAAUGUU序列位點(diǎn))結(jié)合的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的miR_181a抑制劑包括(但不限于)miR_181a的反義核酸，miR-181a的鎖核酸反義核酸；肽核酸；siRNA (沉默miR_181a前體)；或攜帶或表達(dá)miR-181a的反義核酸，miR-181a的鎖核酸反義核酸，肽核酸；siRNA的構(gòu)建物。在另一優(yōu)選例中，所述的miR_181a抑制劑是SEQ ID NO :5所示的反義核苷酸，或2' -O-甲基化修飾的SEQ ID NO :5所示的反義核苷酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種miR_181a抑制劑，其是SEQ ID NO :5所示的反義 核苷酸，或2' -O-甲基化修飾的SEQ ID NO :5所示的反義核苷酸。在本發(fā)明的另一方面，提供miR-181a的用途，用于作為篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的靶標(biāo)。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的miR_181a用于篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(I)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miR_181a的體系；和(2)檢測(cè)所述體系中miR_181a的表達(dá)情況；其中，若所述候選物質(zhì)可降低miR-181a的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(I)包括在測(cè)試組中，將候選物質(zhì)加入到表達(dá)miR_181a的體系中；和/或步驟⑵包括檢測(cè)測(cè)試組的體系中miR-181a的表達(dá)，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)miR-181a的體系；如果測(cè)試組中miR-181a的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選顯著低于，如低20%以上，較佳的低50%以上；更佳的低80%以上)對(duì)照組，就表明該候選物是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的候選物質(zhì)包括(但不限于)針對(duì)miR-181a設(shè)計(jì)的干擾分子、核酸抑制物、結(jié)合分子(如抗體或配體)、小分子化合物。在另一優(yōu)選例中，步驟(I)中，所述的體系還表達(dá)SIRTl蛋白；步驟(2)中，還包括檢測(cè)所述體系中SIRTl基因的轉(zhuǎn)錄或蛋白的表達(dá)(優(yōu)選蛋白表達(dá))情況，若轉(zhuǎn)錄或表達(dá)發(fā)生上調(diào)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)；或者，檢測(cè)所述體系中miR-181a與SIRTl基因的相互作用(結(jié)合或互補(bǔ))，若相互作用減弱(優(yōu)選顯著減弱，如弱20%以上，較佳的弱50%以上；更佳的弱80%以上)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，步驟(I)中，所述的體系還表達(dá)胰島素通路中的InsR，Akt或Gsk3 β ；步驟(2)中，還包括檢測(cè)所述體系中InsR，Akt或Gsk3 β的磷酸化情況，若磷酸化發(fā)生上調(diào)(優(yōu)選顯著上調(diào)，如上調(diào)20%以上，較佳的上調(diào)50%以上；更佳的上調(diào)80%以上)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu) 選例中，步驟(I)中，所述的體系還表達(dá)糖原合成酶；步驟⑵中，還包括檢測(cè)所述體系中糖原合成酶的表達(dá)或活性，若表達(dá)或活性發(fā)生上調(diào)(優(yōu)選顯著上調(diào)，如上調(diào)20%以上，較佳的上調(diào)50%以上；更佳的上調(diào)80%以上)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的體系選自細(xì)胞體系(如表達(dá)miR_181a的細(xì)胞)(或細(xì)胞培養(yǎng)物體系)、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系(如線蟲)。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于提聞膜島素敏感性有用的物質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種測(cè)定miR-181a表達(dá)量的試劑的用途，用于制備診斷或檢測(cè)動(dòng)物胰島素敏感性情況或胰島素抵抗的試劑或試劑盒。在本發(fā)明的另一方面，提供一種提高胰島素敏感性的方法，包括下調(diào)動(dòng)物中miR-181a的表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括給予動(dòng)物有效量的miR_181a抑制劑。由于MicroRNA的一個(gè)家族(如miR-181家族)中各個(gè)成員間序列相似，因此具有相似的靶基因，可能發(fā)揮相似的生物功能，比如miR-181a，miR-181b都具有調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞分化的功能(Naguibneva,I. et al.,The microRNA miR-181 targets the homeobox protein Hox-Allduring mammalian myoblast differentiation),而miR—181a,miR—181c 都能夠下調(diào) SIRTl的表達(dá)(Saunders et al. ,miRNAs regulate SIRTl expression during mouse embryonicstem cell differentiation and in adult mouse tissues),提不除了 miR-181a 夕卜，miR-181家族的其他成員miR-181b，c，d也可能與胰島素敏感性有關(guān)，抑制miR-181家族的表達(dá)可能提高胰島素敏感性。在本發(fā)明的另一方面，提供一種miR_27a和miR-146或其促進(jìn)劑，以及miR_181b，miR-181c和miR-181d的抑制劑的用途，用于制備提高胰島素敏感性的組合物。在本發(fā)明的另一方面，提供一種miRNA的用途，用于作為篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的靶標(biāo)(或用于篩選提高提高胰島素敏感性的物質(zhì))，所述的miRNA選自miR-27a、miR_146b、miR_181b，miR_181c 或 miR_181d。在本發(fā)明的另一方面，一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(al)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miRNA的體系；和(a2)檢測(cè)所述體系中miRNA的表達(dá)情況；其中，若所述候選物質(zhì)可提高miRNA的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)；其中，所述的miRNA 選自miR_27a 或 miR_146b。在一個(gè)優(yōu)選例中，上述步驟(al)包括在測(cè)試組中，將候選物質(zhì)加入到表達(dá)所述miRNA的體系中；和/或步驟(a2)包括檢測(cè)測(cè)試組的體系中miRNA的表達(dá)，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)miRNA的體系；如果測(cè)試組中miRNA的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于(優(yōu)選顯著高于，如低20%以上，較佳的高50%以上；更佳的高80%以上)對(duì)照組，就表明該候選物是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。
在本發(fā)明的另一方面，一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(bl)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miRNA的體系；和(b2)檢測(cè)所述體系中miRNA的表達(dá)情況；其中，若所述候選物質(zhì)可抑制miRNA的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)；其中，所述的miRNA 選自miR_181b、miR_181c, miR_181d。在一個(gè)優(yōu)選例中，上述步驟(bl)包括在測(cè) 試組中，將候選物質(zhì)加入到表達(dá)所述miRNA的體系中；和/或步驟(b2)包括檢測(cè)測(cè)試組的體系中miRNA的表達(dá)，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)miRNA的體系；如果測(cè)試組中miRNA的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選顯著低于，如低20%以上,較佳的低50%以上；更佳的低80%以上)對(duì)照組，就表明該候選物是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的體系選自細(xì)胞體系(如表達(dá)所述miRNA(選自miR-27a、miR_146b、miR_181b、miR_181c，或 miR_181d)的細(xì)胞)(或細(xì)胞培養(yǎng)物體系)、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系(如線蟲)。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于提聞膜島素敏感性有用的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的候選物質(zhì)包括(但不限于)針對(duì)所述miRNA(選自miR-27a、miR-146b、miR-181b、miR-181c，或 miR-181d)設(shè)計(jì)的干擾分子、核酸抑制物、結(jié)合分子(如抗體或配體)、小分子化合物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖l、MiR_181a 作用于 SIRTl 3，UTR。A :在18個(gè)潛在的microRNAs中，miR_181a可顯著抑制SIRTl 3’UTR的轉(zhuǎn)錄活性。在轉(zhuǎn)染pRL-SIRTl-3’ UTR及含相應(yīng)microRNA前體的質(zhì)粒72小時(shí)后，收集HEK293T細(xì)胞做熒光素酶基因檢測(cè)。與pSIF-GFP(pSIF)相比*p < O. 05，**p < O. 01。除非另行說明，本圖及其它圖中誤差值的坐標(biāo)采用標(biāo)準(zhǔn)差。B :人miR_181a序列與人、大鼠及小鼠中SIRTl 3’UTRs的序列比對(duì)。miR_181a的核心區(qū)域?yàn)榧雍隗w5’ ACAUUCA 3’。C =SIRTl 3’ UTR突變體不具有抑制SIRTl 3’ UTR的轉(zhuǎn)錄活性的作用。與其它各組相比廣P <0.01。D:miR-181a核心區(qū)域突變體不具有抑制SIRTl 3’ UTR的轉(zhuǎn)錄活性的作用。與其它各組相比**p < O. 01。圖2、MiR_181a在轉(zhuǎn)錄水平抑制SIRTl蛋白表達(dá)。A :miR_181a可顯著抑制SIRTl蛋白表達(dá)，而miR_181a突變體對(duì)SIRTl蛋白表達(dá)沒有影響。與 pSIF-GFP (pSIF)或 pSIF-181a_m 相比，**p < O. 01。B :過表達(dá)miR_181a劑量依賴性抑制SIRTl蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染不同劑量的miR_181a類似物(圖中簡(jiǎn)寫為“miR-181a類”)72小時(shí)后，收集HEK293T細(xì)胞做免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)。與未轉(zhuǎn)染miR-181a類似物的細(xì)胞相比、< O. 01。C :用反義核酸(anti_181a)抑制miR_181a可劑量依賴性上調(diào)SIRTl蛋白水平。轉(zhuǎn)染不同劑量 的anti-181a 72小時(shí)后，收集HEK293T細(xì)胞做免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)。與未轉(zhuǎn)染反義核酸的細(xì)胞相比、< O. 01。D :過表達(dá)miR-181a不影響SIRTl mRNA水平。在轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒(表達(dá)miR_181a質(zhì)粒)72小時(shí)后，收集HEK293T細(xì)胞做實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。E :上調(diào)或下調(diào)miR-181a不影響SIRTl mRNA水平。在轉(zhuǎn)染相應(yīng)核苷酸(miR_181a類似物)72小時(shí)后，收集HEK293T細(xì)胞做實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。圖3、MiR_181a在產(chǎn)生胰島素抵抗的!fepG2細(xì)胞和db/db小鼠肝臟中上調(diào)。A :葡萄糖胺成功誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗。用葡萄糖胺處理HepG2細(xì)胞18小時(shí)，IOOnM胰島素刺激細(xì)胞15分鐘后收集細(xì)胞做免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)，未用胰島素刺激細(xì)胞作為對(duì)照。磷酸化InsR(p-InsR)與不用葡萄糖胺但僅用胰島素處理的相比減少，表示胰島素抵抗發(fā)生。B MiR-181a在產(chǎn)生胰島素抵抗的IfepG2細(xì)胞中上調(diào)。葡萄糖胺處理IfepG2細(xì)胞18小時(shí)后收集細(xì)胞做實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。、< O. 01。C =SIRTl蛋白水平在db/db小鼠肝臟中下調(diào)。蛋白水平通過免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)。D MiR-181a在db/db小鼠肝臟中上調(diào)。肝臟樣品取自經(jīng)基因型檢測(cè)的10周齡小鼠，MiR-181a表達(dá)水平用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。不同基因型小鼠各14只。圖4、過表達(dá)miR_181a抑制SIRTl表達(dá)并誘導(dǎo)肝臟胰島素抵抗。A :在H印G2細(xì)胞中miR_181a下調(diào)SIRTl蛋白水平及胰島素誘導(dǎo)的InsR，Akt和Gsk30的磷酸化。轉(zhuǎn)染不同劑量的miR-181a類似物72小時(shí)后，用IOOnM胰島素刺激細(xì)胞15分鐘收集細(xì)胞做免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)。B :對(duì)(A)圖中SIRTl蛋白水平及胰島素誘導(dǎo)的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化水平的量化統(tǒng)計(jì)。與同組中未轉(zhuǎn)染miR-181a類似物的細(xì)胞相比，*p < O. 05，**p < O. 01。C和D :在!fepG2細(xì)胞中miR_181a抑制胰島素誘導(dǎo)的糖原合成酶活性(C)及糖原合成(D)的上調(diào)。與未轉(zhuǎn)染miR-181a類似物胰島素刺激的細(xì)胞相比，#P < 0.01。E和F :在原代培養(yǎng)的肝臟(E)和C2C12肌肉細(xì)胞(F)中miR_181a類似物抑制SIRTl蛋白水平及胰島素誘導(dǎo)的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化。蛋白水平通過免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)。圖5、抑制miR_181a能夠增加SIRTl的蛋白表達(dá)并提高胰島素敏感性。(A，B)在正常(A)和誘導(dǎo)胰島素抵抗⑶狀態(tài)下，用反義核酸抑制IfepG2細(xì)胞中的miR-181a能夠顯著增加SIRTl的蛋白表達(dá)并提高胰島素誘導(dǎo)的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化。指定濃度的反義核酸轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞72小時(shí)后，用IOOnM的胰島素刺激細(xì)胞15分鐘，提蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。(C，D)對(duì)于(A和B)中正常(C)及誘導(dǎo)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)⑶時(shí)SIRTl蛋白和InsR(IR)，Akt和Gsk3 β磷酸化水平的灰度分析定量。*ρ < O. 05，**ρ < O. 01與每組中未轉(zhuǎn)染anti-181a的作差異分析。(E，F(xiàn))在正常(E)和誘導(dǎo)胰島素抵抗(F)狀態(tài)下，用反義核酸抑制小鼠肝臟原代細(xì)胞中的miR-181a能夠顯著增加SIRTl的蛋白表達(dá)并提高胰島素誘導(dǎo)的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化。(G, H)抑制miR_181a能夠增加胰島素誘導(dǎo)的糖原合成酶活性(G)以及糖原合成(H)的上調(diào)。*p < O. 05，**p < O. 01，與每組中未轉(zhuǎn)染anti-181a的作差異分析。圖6、miR_181a對(duì)于胰島素信號(hào)通路的調(diào)控依賴于SIRTl。(A)正常狀態(tài)下，在H印G2細(xì)胞中用腺病毒過表達(dá)SIRTl (Ad-SIRTl)能夠回復(fù)miR-181a對(duì)于胰島素刺激的InsR，Akt的磷酸化的抑制作用，腺病毒過表達(dá)的GFP (Ad-GFP)作為負(fù)對(duì)照，免疫印跡法用來檢測(cè)蛋白及其磷酸化水平。(B,C)對(duì)于(A)中感染了 Ad-GFP(B)和 Ad-SIRTl (C)的 H印G2 細(xì)胞中 SIRTl 蛋白和胰島素刺激的InsR，Akt的磷酸化的灰度分析定量。< O. 05，**p < O. 01，與每組中未轉(zhuǎn)染miR-181a類似物的作差異分析。(D)在HepG2細(xì)胞中，誘導(dǎo)胰島素抵抗的情況下，利用尼克酰胺(NAM)來抑制SIRTl的活性后，反義核酸anti-181a對(duì)于胰島素刺激的InsR和Akt的磷酸化的上調(diào)作用消失。免疫印跡法用來檢測(cè)蛋白及其磷酸化水平。(E)對(duì)于(D)中尼克酰胺處理的HepG2細(xì)胞中SIRTl蛋白和胰島素刺激的InsR，Akt的磷酸化的灰度分析定量。< O. 05，**p < O. 01與每組中未轉(zhuǎn)染anti-181a的作差異分析。(F)在SIRTl敲除小鼠(KO)的肝臟原代細(xì)胞中，反義核酸anti_181a對(duì)于胰島素敏感性的改善作用消失。(G-H)對(duì)于(F)中野生型小鼠(WT) (G)以及SIRTl敲除小鼠⑶的肝臟原代細(xì)胞中SIRTl蛋白和胰島素刺激的InsR，Akt的磷酸化的灰度分析定量。< O. 05，、< O. 01與每組中未轉(zhuǎn)染anti-181a的作差異分析。*p < O. 05,**p < O. 01與每組中未轉(zhuǎn)染anti_181a的作差異分析。圖7、小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明miR_181a能夠調(diào)節(jié)SIRTl的蛋白水平以及肝臟胰島素敏感性。(A和B)在小鼠肝臟中利用腺病毒載體過表達(dá)miR-181a(Ad-miR_181a)導(dǎo)致胰島素刺激的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化的減弱。對(duì)八周齡的雄性C57BL/6小鼠尾靜脈注射表達(dá)miR-181a和GFP (Ad-GFP)的腺病毒載體，注射12天后殺小鼠檢測(cè)肝臟中miR_181a的表達(dá)(A)和胰島素信號(hào)通路一些蛋白的磷酸化(B)。< O. 05，每組9只小鼠。 (C)對(duì)于⑶中SIRTl蛋白以及胰島素刺激的InsR，Akt和Gsk3 β磷酸化水平的灰度分析統(tǒng)計(jì)。與Ad-GFP組相比，*ρ < O. 05,**ρ < O. Ol0(D)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖(DIO)的小鼠腹腔注射LNA-anti_181a增加了肝臟SIRTl蛋白的表達(dá)以及胰島素刺激的InsR，Akt和Gsk3 β磷酸化水平。(E)對(duì)于⑶中SIRTl蛋白以及胰島素刺激的InsR，Akt和Gsk3 β磷酸化水平的灰度分析統(tǒng)計(jì)。與LNA-control組相比，*p < O. 05, **p < O. 01。(F)注射 LNA-anti_181a 的 DIO 小鼠肝臟中 miR_181a 以及 G6Pase，PEPCK 的 mRNA水平下降。與LNA-control組相比，*p < O. 05，**p < O. 01，每組11只小鼠。(G)注射LNA-anti_181a的DIO小鼠饑餓血糖低于注射LNA-control對(duì)照組。與LNA-control組相比，*p < 0. 05,每組11只小鼠。
(H) Pearson correlation coefficient test 顯不注射 LNA-anti_181a 的 DIO 小鼠個(gè)體miR-181a的表達(dá)與饑餓血糖相關(guān)(η = 11)。(I)最后一次注射LNA9天后，葡萄糖耐受性實(shí)驗(yàn)顯示LNA_anti_181a改善了 DIO小鼠的葡萄糖耐受性。與LNA-control組相比，*p < 0. 05，每組11只小鼠。(J)LNA-anti_181a減少了(I)圖中葡萄糖耐受性實(shí)驗(yàn)所作圖的曲線下面積。與LNA-control組相比，*p < 0. 05,每組11只小鼠。(K) Pearson correlation coefficient test 顯不注射 LNA-anti_181a 的 DIO 小鼠個(gè)體miR-181a的表達(dá)與葡萄糖耐受性實(shí)驗(yàn)所作圖的曲線下面積相關(guān)(η = 11)。圖8、Western檢測(cè)miR_27a和miR_146b對(duì)于細(xì)胞的胰島素敏感性的影響情況。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期的研究，意外地發(fā)現(xiàn)了一些microRNA (miRNA)在調(diào)節(jié)胰島素敏感性中發(fā)揮作用，這些miRNA包括miR-181a、miR-27a、miR-146b。其中，miR_181a通過抑制SIRTl表達(dá)而影響胰島素敏感性?；诒景l(fā)明的揭示，所述的miR-181a的抑制劑以及所述的miR-27a、miR-146b本身可用于提高胰島素敏感性，從而預(yù)防、緩解或治療胰島素敏感性下降、胰島素抵抗、糖代謝失調(diào)相關(guān)的疾病，如2型糖尿病。miR_181a 及其用途本發(fā)明中，所述的miR_181a是具有SEQ ID NO 1所示核酸序列的小核糖核酸AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU(SEQ ID NO 1)miR-181a是為一種本領(lǐng)域已知的microRNA (miRNA)小分子，其對(duì)于調(diào)控RNA是有用的。其在哺乳動(dòng)物中非常保守，在動(dòng)物的眼睛，胸腺，免疫細(xì)胞表達(dá)量較高。然而，對(duì)于miR-181a結(jié)合的靶點(diǎn)和其與胰島素敏感性或糖代謝之間的關(guān)系目前并不清楚。miR_181a可以被分離自細(xì)胞，或者可通過人工合成的方式獲得。在得知了miR-181a或其前體的序列后，本領(lǐng)域人員可以方便地制備獲得miR-181a或其前體。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，miR-181a是一個(gè)新的、與胰島素敏感性密切相關(guān)的藥物靶點(diǎn)，其藉由抑制SIRTl蛋白表達(dá)，抑制胰島素信號(hào)通路，進(jìn)一步下調(diào)胰島素敏感性。針對(duì)miR-181a的各種治療手段可以作為提高動(dòng)物胰島素敏感性的新穎和有效的手段。miR_181a為靶點(diǎn)的藥物篩選在得知了 miR-lSla與胰島素敏感性的密切相關(guān)性后，可以基于該特征來篩選抑制miR-181a的物質(zhì)。之后，可從所述的物質(zhì)中找到對(duì)于提高胰島素敏感性真正有用的藥物。因此，本發(fā)明提供一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括用候選物質(zhì)處理表達(dá)miR-181a的體系；和檢測(cè)所述體系中miR_181a的表達(dá)或活性；若所述候選物質(zhì)可抑制miR-181a的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。所述的表達(dá)miR-181a的體系例如可以是細(xì)胞(或細(xì)胞培養(yǎng)物)體系，所述的細(xì)胞可以是內(nèi)源性表達(dá)miR-lSla的細(xì)胞；或可以是重組表達(dá)miR_181a的細(xì)胞。所述的表達(dá)miR-181a的體系還可以是亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系(如動(dòng)物模型，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物的動(dòng)物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進(jìn)行篩選時(shí)，為了更易于觀察到miR-181a的表達(dá)或活性的改變，還可設(shè)置對(duì)照組，所述的對(duì)照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)miR-181a的體系。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于提高胰島素敏感性真正有用的物質(zhì)?；趍iR-lSla的作用機(jī)理為通過抑制SIRTl蛋白表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮提高胰島素敏感性的作用。因此還可以在篩選體系中表達(dá)SIRTl蛋白(較佳地包括其編碼基因以及3’UTR區(qū)作為表達(dá)盒)。從而，可通過進(jìn)一步觀察所述體系中SIRTl蛋白·的表達(dá)情況來分析候選藥物的有效性。若SIRTl蛋白表達(dá)發(fā)生上調(diào)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)；或者，檢測(cè)所述體系中miR-181a與SIRTl基因的相互作用(結(jié)合或互補(bǔ))，若相互作用減弱，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。此外，還可以在篩選體系中表達(dá)胰島素通路中的關(guān)鍵因子，如InsR，Akt或Gsk3i3，從而通過觀察所述體系中這些因子的磷酸化情況來分析候選物質(zhì)的有效性。若磷酸化水平發(fā)生上調(diào)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。此外，還可以在篩選體系中表達(dá)糖原合成酶，從而通過觀察所述體系中糖原合成酶的表達(dá)或活性來分析候選物質(zhì)的有效性。若磷酸化水平發(fā)生上調(diào)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。本發(fā)明對(duì)于SIRT1、InsR, Akt, Gsk3 β或糖原合成酶的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)、蛋白活性、蛋白存在量、分泌情況或磷酸化情況的檢測(cè)方法沒有特別的限制?？梢圆捎贸Ｒ?guī)的PCR技術(shù)，或蛋白定量或半定量檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行，例如(但不限于)=RT-PCR法，SDS-PAGE法，Western-Blot 法等。另一方面，本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個(gè)篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠?qū)τ谝种苖iR_181a的表達(dá)和活性，進(jìn)而提聞膜島素敏感性有用的物質(zhì)。miR-27a、miR_146b 及其用途本發(fā)明人還找到了若干miRNA，它們對(duì)于提高胰島素敏感性是有用的，所述的miRNA 選自 miR-27a 或 miR_146b。因此，所述的miR_27a或miR_146b或它們的促進(jìn)劑可用于制備提高胰島素敏感性的組合物，并且也可以用于作為藥物篩選的靶點(diǎn)，篩選通過提高miR-27a或miR-146b的表達(dá)或活性而提高胰島素敏感性的組合物。所述的miRNA (選自miR_27a或miR_146b)的促進(jìn)劑是指任何可提高miRNA或其前體的活性、提高miRNA或其前體的穩(wěn)定性、上調(diào)miRNA或其前體的表達(dá)、增加miRNA或其前體有效作用時(shí)間的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對(duì)于上調(diào)miRNA有用的物質(zhì)，從而可用于提高胰島素的敏感性。此外，一些miRNA的模擬物(mimic)或其它修飾形式也可以作為miRNA的促進(jìn)劑，只要它們具有與所述miRNA相同的效果，或者能夠提高miRNA的表達(dá)或活性。因此，本發(fā)明提供一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括用候選物質(zhì)處理表達(dá)miR-27a或miR-146b的體系；和檢測(cè)所述體系中miR_27a或miR-146b的表達(dá)或活性；若所述候選物質(zhì)可提聞(顯者提聞，如提聞20% ;更佳地提聞40% ;更佳地提高60% )miR-27a或miR-146b的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。所述的表達(dá)miR-27a或miR-146b的體系例如可以是細(xì)胞(或細(xì)胞培養(yǎng)物)體系，所述的細(xì)胞可以是內(nèi)源性表達(dá)miR-27a或miR-146b的細(xì)胞；或可以是重組表達(dá)miR_27a或miR_146b的細(xì)胞。所述的表達(dá)miR_27a或miR_146b的體系還可以是亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系(如動(dòng)物模型，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物的動(dòng)物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進(jìn)行篩選時(shí)，為了更易于觀察到miR_27a或miR_146b的表達(dá)或活性的改變，還可設(shè)置對(duì)照組，所述的對(duì)照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)miR-27a 或 miR_146b 的體系。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于提高胰島素敏感性真正有用的物質(zhì)。miR-181b，c，d 及其用途 本發(fā)明人還推測(cè)若干個(gè)miRNA，它們對(duì)于提高胰島素敏感性是有用的，所述的miRNA 選自 miR_181b, c, d。因此，所述的miR-181b，c, d的抑制劑可用于制備提高胰島素敏感性(通過下調(diào)這些miRNA的表達(dá)或活性)的組合物，并且也可以用于作為藥物篩選的靶點(diǎn)，篩選通過提高miR-181b, c，d的表達(dá)或活性而提高胰島素敏感性的組合物。因此，本發(fā)明提供一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括用候選物質(zhì)處理表達(dá)miR-181b, c, d的體系；和檢測(cè)所述體系中miR_181b, c, d的表達(dá)或活性；若所述候選物質(zhì)可降低(顯著降低，如降低20% ;更佳地降低40% ;更佳地降低60% )miR-181b, c, d的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。所述的表達(dá)miR-181b，c，d的體系例如可以是細(xì)胞(或細(xì)胞培養(yǎng)物)體系，所述的細(xì)胞可以是內(nèi)源性表達(dá)miR-181b, c, d的細(xì)胞；或可以是重組表達(dá)miR_181b, c, d的細(xì)胞。所述的表達(dá)miR-181b，c，d的體系還可以是亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系(如動(dòng)物模型，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物的動(dòng)物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進(jìn)行篩選時(shí)，為了更易于觀察到miR-181b，c, d的表達(dá)或活性的改變，還可設(shè)置對(duì)照組，所述的對(duì)照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)miR-181b, c, d 的體系。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于提高胰島素敏感性真正有用的物質(zhì)。miRNA調(diào)節(jié)劑及其用途基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種miRNA抑制劑的用途，用于制備提高胰島素敏感性的組合物，所述的miRNA選自miR-181a, b, c, d。進(jìn)一步地,所述的miR-181a抑制劑還可用于促進(jìn)SIRTl基因的轉(zhuǎn)錄或蛋白的表達(dá)；抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)；或抑制軟骨細(xì)胞的凋亡。如本文所用，所述的“miRNA抑制劑”包括了核酸抑制物、拮抗劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等，只要它們能夠下調(diào)miRNA或其前體的表達(dá)水平。它們可以是化合物、化學(xué)小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。所述的miRNA抑制劑是指任何可阻止miRNA (特別是其中的結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn))或其前體與其靶向序列結(jié)合、降低miRNA或其前體的活性、降低miRNA或其前體的穩(wěn)定性、下調(diào)miRNA或其前體的表達(dá)、減少miRNA或其前體有效作用時(shí)間的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對(duì)于下調(diào)miRNA有用的物質(zhì)，從而可用于提高胰島素的敏感性。例如，所述的抑制劑是核酸抑制物，蛋白抑制劑，抗體，配體，核酸酶，核酸結(jié)合分子，只要其能夠下調(diào)miRNA的表達(dá)。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的抑制劑是核酸抑制物。較佳地，所述的核酸抑制物通過阻止miRNA與其祀向序列結(jié)合,從而發(fā)揮作用。所述的核酸抑制物例如選自(但不限于)miRNA的反義核酸，miRNA的鎖核酸反義核酸；肽核酸；siRNA (沉默miRNA前體)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的miRNA的抑制劑是miRNA的反義核酸。如本文所用，“反義核酸”又稱為“反義核酸”或“反義寡核苷酸(AS-ONs，antisense-oligonucleotides) ”或“反義藥物”,是指長(zhǎng)度約為15-30個(gè)堿基的DNA分子、RNA分子它們的經(jīng)修飾的形式或它們的類似物，可與mRNA互補(bǔ)。本領(lǐng)域人員均了解，根據(jù)本發(fā)明提供的反義核酸，可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兓⒈Ａ羝浠钚裕@些變化形式均可用于本發(fā)明。任何可起到抑制或沉默miRNA的作用的反義核酸都 是可用于本發(fā)明的，其類型不限于DNA或是RNA。例如，所述的miRNA的反義核酸是與miRNA的序列基本上(較佳地為完全)互補(bǔ)的序列。例如，當(dāng)所述的miRNA為miR-181a時(shí)，所述的miR-181a的反義核酸與SEQ ID NO :5所示的序列具有80%以上的相同性，較佳地具有85%以上的相同性，更佳地具有90%以上的相同性，最佳地具有95%以上的相同性，如具有96%、97%、98%或99%以上的相同性；或者所述的miR-181a的反義核酸是SEQ ID NO:5所示序列的片段；它們均具有SEQ ID NO :5所示序列的反義核酸相同的功能?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)指出了一些反義核酸的變化形式是可取的，它們也可以針對(duì)相應(yīng)的祀序列發(fā)揮抑制作用。如Improved targeting of miRNA with antisenseoligonucleotides (2294-2304 Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 8)文獻(xiàn)中提至Li，在反義核酸的兩個(gè)末端截短I個(gè)堿基是可以保留其活性的。又如Design and deliveryof antisense oligonucleotides to block microRNA function in cultured Drosophilaand human cells (NATURE PROTOCOLS ；V0L. 3N0. 10 ；2008 ； 1537-1549)文獻(xiàn)綜述了多個(gè)研究，認(rèn)為一般而言，在反義核酸的兩邊延長(zhǎng)一些堿基是可以的。而在反義核酸和miRNA間親和性很高(如鎖核酸修飾)時(shí)，反義核酸可以被截短到約2/3長(zhǎng)度。如本文所用，所述的“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2XSSC，0. 1% SDS,60°C ;或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50% (v/v)甲酰胺，0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。在本發(fā)明中，所述的“反義核酸”還包括經(jīng)修飾的反義核酸，所述的修飾基本不改變反義核酸的活性，更佳地，所述修飾可提高反義核酸的活性、穩(wěn)定性或治療效果。對(duì)反義核酸的修飾包括但不限于鎖核酸修飾、甲氧基化修飾、肽核酸修飾、硫代修飾、磷酸骨架由磷脂連接骨架代替，這些修飾均是本領(lǐng)域技術(shù)人員易于實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)選地，所述的修飾為鎖核酸修飾。組合物本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt% ;較佳的
0.00001-2(^七％;更佳的，0. 0001-10wt% )的所述的 miRNA(選自 miR_27a 或 miR_146b)或其促進(jìn)劑；或含有有效量的miRNA(選自miR-181a，b，c，d)抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述的組合物可用于提高胰島素敏感性。任何前述的miRNA或其促進(jìn)劑或抑制劑均可用于組合物的制備。如本文所用，所述“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充齊U、潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑。在得知了所述miRNA或其促進(jìn)劑或抑制劑的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來將所述的miRNA或其促進(jìn)劑或抑制劑或它們的藥物組合物給藥于哺乳動(dòng)物。包括但不限于皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等。 本發(fā)明所述的miRNA或其促進(jìn)劑或抑制劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于所述的miRNA或其促進(jìn)劑或抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的miRNA或其促進(jìn)劑或抑制劑每天以約O. 00001mg-50mg/kg動(dòng)物體重(較佳的O. 0001mg-10mg/kg動(dòng)物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。I.材料與方法哺乳動(dòng)物細(xì)胞株及細(xì)菌株HEK293T :人胚胎腎細(xì)胞系，由HEK293細(xì)胞衍生而來，同時(shí)表達(dá)SV40病毒的大T抗原。HepG2 :人肝癌細(xì)胞系。C2C12 :小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞系。以上細(xì)胞株均購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。DH5ci細(xì)菌用于質(zhì)?？寺〉拇竽c桿菌。主要試劑及試劑盒miR_181a， miR-543， miR_30a， miR_199b， miR_200a， miR_7， miR_9， miR-22，miR_29a， miR_29b， miR_34a， miR-128， miR-132， miR-138， miR-154， miR-204， miR-212，miR-217 WmiRBase 數(shù)據(jù)庫(http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/)得到。它們相應(yīng)的Pre-miRNA序列相應(yīng)的DNA序列化學(xué)合成經(jīng)配對(duì)后連入pSIF-GFP的BamH I/EcoR I位點(diǎn)，獲得可表達(dá)microRNA的質(zhì)粒。miR-181a AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU (SEQ ID NO 1)miR-181a 的前體(Pre-Hsa_miR-181a)TGAGTTTTGAGGTTGCTTCAGTGAACATTCAACGCTGTCGGTGAGTTTGGAATTAAAATCAAAACCATCGACCGTTGATTGTACCCTATGGCTAACCATCATCTACTCCA(SEQ ID NO 2)MiRNA_181a 核苷酸類似物(即 miR_181a mimics);反義核酸(anti_181a)及miR-181a鎖核酸反義核酸(LNA-anti_181a)均合成于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司(GenePharma, Shanghai, China)。它們的序列或結(jié)構(gòu)是MiRNA_181a核苷酸類似物序列或結(jié)構(gòu)正義5’-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU TT-3’ (SEQ ID NO 3)；反義5’-ACUCACCGACAGCGUUGAAUGUU TT-3’ (SEQ ID NO :4)。反義核酸為2' -O-甲基化修飾的ACTCACCGACAGCGTTGAATGTT(SEQ ID NO: 5)，每個(gè)堿基均有2' -O-甲基化修飾。miR_181a 鎖核酸反義核酸(LNA-anti_181a):購(gòu)于 Exiqon 公司。Taq酶、限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)自O(shè)xoid公司；瓊脂粉購(gòu)自捷倍思公司；核酸分析電泳用瓊脂糖購(gòu)自Biowest公司；質(zhì)粒大抽試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。細(xì)胞總RNA抽提試劑TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司；miR_181a反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems公司。煙酰胺(nicotinamide),棕櫚酸(palmitate),葡萄糖胺(D- (+) -Glucosaminehydrochloride)均購(gòu)自Sigma公司；注射用胰島素購(gòu)自Novo Nordisk公司；PVDF膜購(gòu)自 Millipore 公司；蛋白印跡化學(xué)發(fā)光試劑SuperSignal West Pico ChemiluminescentSubstrate 購(gòu)自 Thermo Scientific 公司，Tmmobi I on TM Western Chemi luminescent HRPSubstrate 購(gòu)自 Millipore 公司；X-Omat 光片購(gòu)自 Kodak 公司?！た贵w
權(quán)利要求
1.一種HiiR-ISla抑制劑的用途，用于制備提高胰島素敏感性的組合物。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于抑制胰島素抵抗，改善糖代謝，預(yù)防或治療糖代謝失調(diào)相關(guān)疾病。
3.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于 上調(diào)SIRTl蛋白的表達(dá)； 上調(diào)胰島素刺激的InsR，Akt或Gsk3 β磷酸化水平；和/或 上調(diào)胰島素刺激的糖原合成酶活性或糖原合成。
4.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的miR-181a抑制劑是抑制或阻止miR-181a與其靶向基因位點(diǎn)結(jié)合的物質(zhì)。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的miR-181a抑制劑是抑制或阻止miR-181a與SIRTl的3’ UTR的UGAAUGUU序列位點(diǎn)結(jié)合的物質(zhì)。
6.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的miR-181a抑制劑包括miR_181a的反義核酸，miR-181a的鎖核酸反義核酸；肽核酸；siRNA ;或攜帶或表達(dá)miR_181a的反義核酸，miR-181a的鎖核酸反義核酸，肽核酸；siRNA的構(gòu)建物。
7.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的miR-181a抑制劑是SEQID N0:5所示的反義核苷酸，或2' -O-甲基化修飾的SEQ ID NO 5所示的反義核苷酸。
8.—種miR-181a抑制劑，其特征在于，其是SEQ ID NO :5所示的反義核苷酸，或2' -O-甲基化修飾的SEQ ID NO :5所示的反義核苷酸。
9.一種miR-181a的用途，用于作為篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的靶標(biāo)。
10.一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括 (1)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miR-181a的體系；和 (2)檢測(cè)所述體系中miR-181a的表達(dá)情況； 其中，若所述候選物質(zhì)可降低miR-181a的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，步驟(I)包括在測(cè)試組中，將候選物質(zhì)加入到表達(dá)miR-181a的體系中；和/或 步驟⑵包括檢測(cè)測(cè)試組的體系中miR-181a的表達(dá)，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)miR-181a的體系； 如果測(cè)試組中miR-181a的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對(duì)照組，就表明該候選物是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的體系還表達(dá)SIRTl蛋白； 步驟(2)中，還包括檢測(cè)所述體系中SIRTl基因的轉(zhuǎn)錄或蛋白的表達(dá)情況，若轉(zhuǎn)錄或表達(dá)發(fā)生上調(diào)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)；或者，檢測(cè)所述體系中miR-181a與SIRTl基因的相互作用，若相互作用減弱，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的體系還表達(dá)胰島素通路中的 InsR, Akt 或 Gsk3 β ； 步驟(2)中，還包括檢測(cè)所述體系中InsR，Akt或Gsk3i3的磷酸化情況，若磷酸化發(fā)生上調(diào)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的體系還表達(dá)糖原合成酶； 步驟(2)中，還包括檢測(cè)所述體系中糖原合成酶的表達(dá)或活性，若表達(dá)或活性發(fā)生上調(diào)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。
15.一種測(cè)定miR-181a表達(dá)量的試劑的用途，用于制備診斷或檢測(cè)動(dòng)物胰島素敏感性情況或胰島素抵抗的試劑或試劑盒。
16.一種miRNA或其促進(jìn)劑的用途，用于制備提高胰島素敏感性的組合物；所述的miRNA 選自miR-27a 或 miR-146b。
17.—種miRNA的抑制劑的用途，用于制備提高胰島素敏感性的組合物；所述的miRNA選自miR-181b、miR-181c，miR-181d。
18.—種miRNA的用途，用于作為篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的靶標(biāo)，所述的miRNA 選自miR-27a、miR_146b、181b、miR_181c 或 miR_181d。
19.一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括 (al)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miRNA的體系；和 (a2)檢測(cè)所述體系中miRNA的表達(dá)情況； 其中，若所述候選物質(zhì)可提聞miRNA的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是提聞膜島素敏感性的潛在物質(zhì)； 其中，所述的miRNA選自miR-27a或miR_146b。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，步驟(al)包括在測(cè)試組中，將候選物質(zhì)加入到表達(dá)所述miRNA的體系中；和/或 步驟(a2)包括檢測(cè)測(cè)試組的體系中miRNA的表達(dá)，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)miRNA的體系； 如果測(cè)試組中miRNA的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于對(duì)照組，就表明該候選物是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。
21.—種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括 (bl)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miRNA的體系；和 (b2)檢測(cè)所述體系中miRNA的表達(dá)情況； 其中，若所述候選物質(zhì)可抑制miRNA的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)； 其中，所述的 miRNA 選自:miR-181b、miR-181c，miR_181d。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，步驟(bl)包括在測(cè)試組中，將候選物質(zhì)加入到表達(dá)所述miRNA的體系中；和/或 步驟(b2)包括檢測(cè)測(cè)試組的體系中miRNA的表達(dá)，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)miRNA的體系； 如果測(cè)試組中miRNA的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對(duì)照組，就表明該候選物是提高胰島素敏感性的潛在物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及若干個(gè)microRNAs，特別是miR-181a作為調(diào)節(jié)胰島素敏感性的靶標(biāo)的新用途。本發(fā)明揭示了miR-181a在調(diào)節(jié)胰島素敏感性中發(fā)揮作用，其通過抑制SIRT1表達(dá)而影響胰島素敏感性。因此，miR-181a抑制劑可用于提高胰島素敏感性，從而預(yù)防、緩解或治療胰島素敏感性下降、胰島素抵抗、糖代謝失調(diào)相關(guān)的疾病。
文檔編號(hào)A61P3/10GK102908621SQ20111022014
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2011年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月2日
發(fā)明者翟琦巍, 周犇, 李程 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院