專利名稱：一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法。
背景技術(shù)：
豬博卡病毒(Porcine Bocavirus,PBoV)是一種無(wú)包膜的單鏈DNA病毒,歸屬于細(xì)小病毒科博卡病毒屬。2005年，Allander首次從患呼吸道感染的嬰幼兒中分離得到人的博卡病毒。自此以后，世界各地紛紛在呼吸道，血液，糞便，尿液等處發(fā)現(xiàn)博卡病毒。有呼吸道病癥的患者感染博卡病毒的幾率明顯比正常人高。 2009年，在瑞典豬群中偶然發(fā)現(xiàn)豬群中存在PBoV，2010年我國(guó)豬群中也檢測(cè)到PBoV。在臨床上博卡病毒主要導(dǎo)致人、牛、豬等動(dòng)物的下呼吸道感染和腹灣。而豬Kobu病毒(Porcine Kokuvirus)為小RNA病毒科成員，不同種屬動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)的Kobu病毒存在著差異，這類病毒是胃腸炎疾病的主要病原之一，弓丨起幼齡動(dòng)物(豬、牛、人少數(shù))高發(fā)病率和高死亡率，成年動(dòng)物死亡率較低，但感染率同樣很高，主要癥狀和傳胃流腹極為相似。自2010年4月至今，韓國(guó)、泰國(guó)；我國(guó)的廣東、福建、廣西、江西、湖北、河北和山東規(guī)?；i場(chǎng)的仔豬陸續(xù)發(fā)生嚴(yán)重腹瀉哺乳仔豬多在出生后2-3天發(fā)生嘔吐，隨后發(fā)生劇烈腹瀉，死亡率較高，有的地區(qū)出現(xiàn)腹瀉后死亡率達(dá)到100%。而母豬和育肥豬無(wú)明顯癥狀。按照流行性腹瀉、傳染性胃腸炎和輪狀病毒感染時(shí)的處理措施，基本無(wú)顯著效果。臨床解剖主要癥狀為胃腸道的嚴(yán)重出血。對(duì)嚴(yán)重腹瀉仔豬采集的樣本分析發(fā)現(xiàn)，流行性腹瀉、傳染性胃腸炎和輪狀病毒檢測(cè)陽(yáng)性率較低，陽(yáng)性率不足5%,而豬博卡病毒(porcine bocavirus,PBoV)和Kobu病毒檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)到86. 6%。由此可見(jiàn)，PBoV和Kobu病毒是這次仔豬腹瀉的罪魁禍?zhǔn)住５侥壳盀橹?，由于?duì)該兩種病毒的認(rèn)識(shí)還不夠深入，尚無(wú)有效的疫苗和防治措施，因此研制抗PBoV和Kobu病毒藥物迫在眉睫。目前，卵黃抗體已經(jīng)廣泛運(yùn)用于雞、鴨、鵝、犢牛、仔豬和羔羊等動(dòng)物疾病的緊急治療和預(yù)防中，如雞傳染性法氏囊、雞新城疫、雞白痢、鴨病毒性肝炎、小鵝瘟、豬輪狀病毒、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病、羔羊輪狀病毒腹瀉、仔豬輪狀病毒腹瀉等。卵黃抗體是一種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的多克隆抗體，制備簡(jiǎn)單，容易提取，可以高效特異的對(duì)病毒性/細(xì)菌性疾病進(jìn)行治療；而且雞大規(guī)模工業(yè)化飼養(yǎng)成本低，經(jīng)濟(jì)方便。同時(shí)使用卵黃抗體進(jìn)行疾病治療可以減少抗生素的使用，減少耐藥株的出現(xiàn)，從而降低疫病控制成本。因此，卵黃抗體在生物制品的開(kāi)發(fā)和疾病的防治方面具有廣闊的前景。且迄今為止，運(yùn)用卵黃抗體治療豬呼吸道綜合癥的研究尚未有報(bào)到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液及其制備方法，用于防治仔豬腹瀉，在降低防疫成本和耐藥性菌株產(chǎn)生的前提下，有效的提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能和疫病防治效果，且不會(huì)對(duì)人產(chǎn)生食源性污染和藥物殘留。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液，以實(shí)驗(yàn)分離當(dāng)前流行的毒株為基礎(chǔ)，將分離的豬博卡病毒和豬Kobu病毒滅活后制備成二聯(lián)滅活疫苗免疫非免疫母雞，免疫后收集免疫母雞所產(chǎn)雞蛋，從蛋黃中提取出卵黃抗體將其制備成安全、高效的卵黃抗體注射液。上述的治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法，包括以下步驟I)分離當(dāng)前流行的PBoV和Kobu病毒，分別用豬腎原代細(xì)胞分離培養(yǎng)PBoV，用Vero細(xì)胞培養(yǎng)Kobu病毒，測(cè)定病毒滴度后制備成二聯(lián)滅活疫苗，制備的疫苗中PBoV和Kobu病毒的TCID5tl不低于107/ml ；2)利用制備的二聯(lián)滅活疫苗免疫非免產(chǎn)蛋母雞，免疫程序如下與產(chǎn)蛋前30天首次免疫，免疫劑量為2ml/羽，首次免疫后2、4分別進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫,免疫劑量為3ml/羽，此后每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導(dǎo)母雞持續(xù)性的產(chǎn)生抗PBoV和 Kobu病毒的抗體；3)第三次免疫后14天收集雞蛋，運(yùn)用75%乙醇消毒蛋殼，在無(wú)菌條件下收集卵黃，運(yùn)用等量磷酸鹽緩沖液(O. IM PBS, PH7. 2)后置組織勻漿器中，5000轉(zhuǎn)/分勻漿I分鐘，加入乳酸至PH為4. 0，2 8°C攪拌過(guò)夜，置-80°C冷凍后解凍，并重復(fù)冷凍一次，然后8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨，2 8°C攪拌2消失，后2 8°C靜置過(guò)夜，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸銨；4)運(yùn)用微量中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定PBoV和Kobu病毒的中和抗體效價(jià)；5)將效價(jià)測(cè)定好的卵黃抗體進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn),合格后無(wú)菌分裝,使PBoV和Kobu病毒抗體效價(jià)不低于I : 64。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明中制備的卵黃抗體注射液為免疫球蛋白制劑，能夠特異性的中和PBoV和Kobu病毒，可用于治療臨床上由PBoV和Kobu病毒單獨(dú)感染或混合感染導(dǎo)致的仔豬腹瀉；使用本發(fā)明中制備的注射液不僅可以治愈易感染上述病原的豬，同時(shí)對(duì)同群未感染上述病原的豬使用可以使其獲得被動(dòng)免疫；臨床實(shí)驗(yàn)表明，使用本發(fā)明制備的產(chǎn)品后可以顯著提高豬群生產(chǎn)性能；本發(fā)明制備成本低，見(jiàn)效快，本制品無(wú)毒副作用，使用后無(wú)藥物殘留，生產(chǎn)使用過(guò)程中對(duì)人畜無(wú)危害，同時(shí)使用本發(fā)明中制備的產(chǎn)品不會(huì)導(dǎo)致耐藥菌毒株的出現(xiàn)，對(duì)食品安全無(wú)潛在的危害，適宜大規(guī)模推廣。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :PboV和Kobu病毒流行毒株的分離鑒定以及病毒TCID5tl測(cè)定I、PboV流行毒株的分離鑒定I)采集疑似PboV發(fā)病豬糞便，按照I : I的比例加入生理鹽水稀釋混勻后以500g的離心力低速離心10分鐘，取離心上清分別按照1000IU/ml的比例加入青霉素、鏈霉素和卡那霉素，37°C放置I小時(shí)后接種豬腎原代細(xì)胞；37°C，5% CO2吸附2小時(shí)，期間每隔15分鐘搖勻一次，吸附完成后除去病毒液，加入含2%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C，5% CO2培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變情況，如培養(yǎng)至5天后無(wú)細(xì)胞病變出現(xiàn)則將細(xì)胞培養(yǎng)物置_40°C反復(fù)凍融三次，12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清接種豬腎原代細(xì)胞細(xì)胞繼續(xù)傳代。以此類推連續(xù)進(jìn)行傳代。該分離毒株傳代至第5代時(shí)在接種72小時(shí)后出現(xiàn)細(xì)胞病變。2)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)到的方法，合成一對(duì)特異性引物P1、P2。其中Pl :GGGCGAGAACATTGAAGAGGT, P2 :TTGTGAGTATGGGTATTGGTG，擴(kuò)增片段大小為 496bp。將出現(xiàn)細(xì)胞病變的病毒液上清提取DNA，運(yùn)用PCR進(jìn)行進(jìn)行鑒定。如擴(kuò)增出特異性的片段則判定為PBoV陽(yáng)性。2、PBoV分離毒株的TCID5tl測(cè)定將生長(zhǎng)良好的豬腎原代細(xì)胞運(yùn)用胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為5X105/ml，傳代到96孔板中，每孔O. 1ml，然后置37°C，5% CO2培養(yǎng)。96孔板中細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，將培養(yǎng)液吸出，加入病毒稀釋液，每個(gè)梯度8孔，每孔O. Iml。病毒液稀釋按照10倍倍比稀釋，選取IO1 IO9等9個(gè)稀釋度進(jìn)行病毒接種。加入病毒液后置37°C，5% CO2吸附2小時(shí)，然后去除病毒液，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后觀察并記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，運(yùn)用Reed-Muench氏法計(jì)算TCID5tlt5經(jīng)計(jì)算該病毒的TCID5tl為106 25/ml。3、Kobu病毒流行毒株的分離鑒定以及病毒TCID5tl測(cè)定I)采集疑似Kobu病毒發(fā)病豬糞便，按照I : I的比例加入生理鹽水稀釋混勻后·以500g的離心力低速離心10分鐘，取離心上清分別按照1000IU/ml的比例加入青霉素、鏈霉素和卡那霉素，37°C放置I小時(shí)后接種Vero細(xì)胞；37°C，5% CO2吸附2小時(shí)，期間每隔15分鐘搖勻一次，吸附完成后除去病毒液，加入含2%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，370C ,5% CO2培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變情況，如培養(yǎng)至5天后無(wú)細(xì)胞病變出現(xiàn)則將細(xì)胞培養(yǎng)物置_40°C反復(fù)凍融三次，12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清接種Vero細(xì)胞細(xì)胞繼續(xù)傳代。以此類推連續(xù)進(jìn)行傳代。該分離毒株傳代至第3代時(shí)在接種72小時(shí)后出現(xiàn)細(xì)胞病變。2)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)到的方法，合成一對(duì)特異性引物P3、P4。其中P3 TGGACGACCAGCTCTTCCTTAAACAC,P4 AGTGCAAGTGCAAGTCTGGGTTGCAGCCAACA,擴(kuò)增片段大小為495bp。將出現(xiàn)細(xì)胞病變的病毒液上清提取RNA，運(yùn)用RT-PCR進(jìn)行進(jìn)行鑒定。如擴(kuò)增出特異性的片段則判定為Kobu病毒陽(yáng)性。4、Kobu病毒分離毒株的TCID5tl測(cè)定將生長(zhǎng)良好的Vero細(xì)胞運(yùn)用胰酶消化后按照I : 4的比例傳代到96孔板中，每孔O. 1ml，然后置37°C，5% CO2培養(yǎng)。96孔板中細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，將培養(yǎng)液吸出，加入病毒稀釋液，每個(gè)梯度8孔，每孔O. Iml。病毒液稀釋按照10倍倍比稀釋，選取IO1 IO9等9個(gè)稀釋度進(jìn)行病毒接種。加入病毒液后置37°C，5% CO2吸附2小時(shí)，然后去除病毒液，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后觀察并記錄細(xì)胞病變孔數(shù),運(yùn)用Reed-Muench氏法計(jì)算TCID50 0經(jīng)計(jì)算該病毒的TCID5tl為IO7 2Vml實(shí)施例2滅活疫苗的制備及免疫I、菌毒滅活分別將測(cè)定好菌毒滴度的菌毒液混合，混合后制備的疫苗中PBoV和Kobu病毒的TCID50不低于107/ml，混合后加入O. 2%的甲醛37°C滅活24小時(shí)，滅活檢驗(yàn)合格后備用。2、滅活疫苗制備油相制備由注射用白油94體積份，加司本_80°C 6體積份，混合后,然后加硬脂酸鋁(每100毫升混合液加入2克硬脂酸鋁)，逐漸攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。水相制備取滅菌吐溫_80°C 4體積份，加入滅活病毒液96體積份，充分振搖，使吐溫-80°C完全溶解。
乳化取油相I體積份放于乳化缸內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)緩慢加入水相I體積份，加完后再以10000r/min攪拌2 5分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞水溶液，使其終濃度為O. 01%，得到制備卵黃抗體用滅活疫苗。3、疫苗免疫非免疫母雞產(chǎn)蛋前30天首次免疫,免疫劑量為2ml/羽，首次免疫后2、4分別進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為3ml/羽，此后每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導(dǎo)母雞持續(xù)性的產(chǎn)生抗PBoV和Kobu病毒的抗體。實(shí)施例3卵黃抗體的制備和效價(jià)測(cè)定I、卵黃抗體的制備第三次免疫后14天收集雞蛋，運(yùn)用75%乙醇消毒蛋殼，在無(wú)菌條件下收集卵黃，·運(yùn)用等量磷酸鹽緩沖液(O. IM PBS, PH7. 2)后置組織勻漿器中，5000轉(zhuǎn)/分勻漿I分鐘，力口入乳酸至PH為4.0，2 8°C攪拌過(guò)夜，置-80°C冷凍后解凍，并重復(fù)冷凍一次，然后8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨,2 8°C攪拌2消失，后2 8°C靜置過(guò)夜，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸銨。2、PBoV和Kobu病毒抗體的效價(jià)測(cè)定I)細(xì)胞制備分別取豬原代腎細(xì)胞和Vero，運(yùn)用胰酶消化調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X IO5/ml,然后傳代至96孔板中，每孔0. Iml,加入至96孔板后輕微前后左右搖晃,混勻細(xì)胞使其能夠均勻貼壁。2)體外中和實(shí)驗(yàn)分別將PBoV病毒液和Kobu病毒進(jìn)行稀釋，稀釋至2000TCID5(I/ml。取制備的卵黃抗體進(jìn)行2倍倍比稀釋，取21 21°等10個(gè)稀釋度。每個(gè)稀釋度取0. 4ml卵黃抗體稀釋液分別加入等量的稀釋病毒液，37°C水浴I小時(shí)使卵黃抗體與PBoV或Kobu病毒進(jìn)行中和反應(yīng)。3)細(xì)胞接種以及中和效價(jià)測(cè)定中和反應(yīng)完畢后，將96孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液去除，力口入中和反應(yīng)后的混合液，其中PBoV中和后加入到豬原代腎細(xì)胞中，Kobu病毒中和后加入到Vero細(xì)胞中，每孔O. lml，37°C吸附I小時(shí)，然后去除吸附混合液，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后觀察細(xì)胞病變孔數(shù)并記錄,然后按照Reed-Muench氏法計(jì)算中和抗體效價(jià)。3、將效價(jià)測(cè)定好的卵黃抗體進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn),合格后無(wú)菌分裝,使PBoV和Kobu病毒的抗體效價(jià)不低于I : 64。實(shí)施例42011年3月天津某豬場(chǎng)10日齡仔豬489頭，出現(xiàn)腹瀉癥狀，主要表現(xiàn)為食欲減退、并出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，個(gè)別豬出現(xiàn)嘔吐等癥狀。發(fā)病率高達(dá)60 %，死亡病豬解剖主要癥狀為胃腸道嚴(yán)重出血。采集病豬腸道和排泄物進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為Kobu病毒陽(yáng)性。隨后對(duì)所有腹瀉仔豬注射本發(fā)明制備的卵黃抗體進(jìn)行治療，每頭豬注射3ml，每天I次連續(xù)3天，同時(shí)對(duì)未發(fā)病仔豬注射等劑量卵黃抗體進(jìn)行預(yù)防。同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，對(duì)嚴(yán)重腹瀉豬進(jìn)行補(bǔ)液，腹腔注射5%的葡萄糖氯化鈉溶液，每頭豬40ml，每天一次，另外與加強(qiáng)消毒等其它措施相結(jié)合。用卵黃抗體治療后新發(fā)病例迅速減少，輕度腹瀉豬只迅速好轉(zhuǎn)，用藥后3天無(wú)仔豬因腹瀉死亡。
權(quán)利要求
1.一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液，其特征在于在于其包括從以PBoV和Kobu病毒二聯(lián)滅活疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞后收集的免疫產(chǎn)蛋母雞雞蛋的卵黃中提取的卵黃抗體。
2.權(quán)利要求I所述的治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)分離當(dāng)前流行的PBoV和Kobu病毒，分別用豬腎原代細(xì)胞分離培養(yǎng)PBoV，用VeiO細(xì)胞培養(yǎng)Kobu病毒，測(cè)定病毒滴度后制備成二聯(lián)滅活疫苗； 2)利用制備的二聯(lián)滅活疫苗免疫非免產(chǎn)蛋母雞； 3)第三次免疫后14天收集雞蛋，運(yùn)用75%乙醇消毒蛋殼，在無(wú)菌條件下收集卵黃，運(yùn)用等量磷酸鹽緩沖液(O. IM PBS, PH7. 2)后置組織勻漿器中，5000轉(zhuǎn)/分勻漿I分鐘，加入乳酸至PH為4. 0，2 8°C攪拌過(guò)夜，置-80°C冷凍后解凍，并重復(fù)冷凍一次，然后8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨,2 8°C攪拌2消失，后2 8°C靜置過(guò)夜，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸銨； 4)運(yùn)用微量中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定PBoV和Kobu病毒的中和抗體效價(jià)； 5)將效價(jià)測(cè)定好的卵黃抗體進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，合格后無(wú)菌分裝，使PBoV和Kobu病毒抗體效價(jià)不低于I : 64。
3.權(quán)利要求2所述的治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，步驟I)中制備的疫苗中PBoV和Kobu病毒的TCID5tl不低于107/ml。
4.權(quán)利要求2或3所述的治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，步驟2)中，免疫程序如下與產(chǎn)蛋前30天首次免疫,免疫劑量為2ml/羽，首次免疫后2月、4月分別進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為3ml/羽，此后每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導(dǎo)母雞持續(xù)性的產(chǎn)生抗PBoV和Kobu病毒的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法，所述的卵黃抗體注射液以實(shí)驗(yàn)分離當(dāng)前流行的毒株為基礎(chǔ)，將分離的豬博卡病毒和豬Kobu病毒滅活后制備成二聯(lián)滅活疫苗免疫非免疫母雞，免疫后收集免疫母雞所產(chǎn)雞蛋，從蛋黃中提取出卵黃抗體將其制備成安全、高效的卵黃抗體注射液。本發(fā)明的有益效果為制備的卵黃抗體注射液能有針對(duì)性的對(duì)豬博卡病毒和豬Kobu病毒單獨(dú)感染或混合感染病豬進(jìn)行有效的治療，同時(shí)可運(yùn)用該注射液對(duì)同舍未感染仔豬注射進(jìn)行預(yù)防；該注射液制備工藝簡(jiǎn)單可規(guī)?；a(chǎn)并運(yùn)用于臨床。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102908620SQ20111022329
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者李帥偉, 廖榮斌 申請(qǐng)人:廣州格拉姆生物科技有限公司