專利名稱：一種殼聚糖衍生物的制備方法及其在抗凝血藥物上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖衍生物的制備方法及其在抗凝血藥物上的應(yīng)用，尤其是一種磺酸基殼聚糖的制備方法及其在抗凝血藥物上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，各種微創(chuàng)介入醫(yī)療裝置如醫(yī)用導(dǎo)管、手術(shù)導(dǎo)引線、金屬支架等已廣泛地應(yīng)用到各種醫(yī)療技術(shù)中，極大地豐富了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診療手段。然而在臨床應(yīng)用中，現(xiàn)有的裝置依然不同程度地存在感染、凝血和術(shù)后組織增生等問題，設(shè)計(jì)生物相容性聚合物為解決這些問題提供了有效途徑?，F(xiàn)在抗凝血藥物為肝素，但由于其制備困難，來源受限，且成本較高，容易失活，保存運(yùn)輸不方便，我們擬通過來源廣泛的海洋藥用資源-殼聚糖，進(jìn)行改性，擬發(fā)現(xiàn)一種可以替代肝素的新型海洋藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新的價(jià)廉、療效好的具有抗凝血作用的殼聚糖衍生物的制備方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下一種殼聚糖衍生物的制備方法，其具體制備步驟如下將氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中，所述氯磺酸與二甲基甲酰胺的體積比為4 25，攪拌均勻，并將其升溫至30 50°C，然后加入丁二酸單膽固醇酯殼聚糖，攪拌并反應(yīng)12 18h后，再滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 30%的氫氧化鈉溶液，中和至pH值為6 8，過濾，取濾液待用；再將得到的濾液進(jìn)行透析，透析結(jié)束后進(jìn)行冷凍干燥，得到所述的殼聚糖衍生物。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。進(jìn)一步，所述丁二酸單膽固醇酯殼聚糖的制備方法為(I)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I 5%的醋酸溶液加入到精制殼聚糖中，攪拌，溶解I 3h，得到殼聚糖的醋酸溶液，備用，所述醋酸溶液與精制殼聚糖的質(zhì)量比為80 : I 40 : I;(2)將二氯甲烷加入到膽固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解，所述膽固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的質(zhì)量比為10 30 10 20 I 3，溶解，加熱至40 60°C并反應(yīng)24 48小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，得到濾液，將所述濾液洗滌后，除去盡可能的雜質(zhì)，再進(jìn)行減壓蒸除溶劑，再加入丙酮溶液，重結(jié)晶，得到丁二酸單膽固醇酯(琥珀酸單膽固醇酯)，所述丙酮溶液與所述二氯甲烷的體積比為I : I;(3)將步驟(2)中得到的丁二酸單膽固醇酯滴加到丙酮中，溶解，得到丁二酸單膽固醇酯的丙酮溶液；(4)將步驟(I)中制得的殼聚糖的醋酸溶液加熱至30 50°C并不斷攪拌，然后將步驟(3)中制得的丁二酸單膽固醇酯的丙酮溶液滴加到殼聚糖的醋酸溶液中，反應(yīng)15 25小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，再加入丙酮，出現(xiàn)沉淀物，過濾后得到沉淀物；(5)將步驟(4)中得到的沉淀物，用丙酮洗滌，再過濾除去丙酮，得到洗滌后的沉淀物，最后將洗滌后的沉淀物進(jìn)行干燥，得到所述的丁二酸單膽固醇酯殼聚糖。進(jìn)一步，在步驟(2)中，所述濾液洗滌是用去離子水洗滌兩次后再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% HCl溶液洗滌兩次。進(jìn)一步，在步驟⑷中所述再加入的丙酮與步驟(3)中丙酮的體積比為3 I。進(jìn)一步，在步驟(5)中，所述用丙酮洗滌的次數(shù)為3 5次。進(jìn)一步，在步驟(5)中，所述將洗滌后的沉淀物進(jìn)行干燥的溫度為20 80°C。進(jìn)一步，在步驟(I)中，所述精制殼聚糖的制備方法為I)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I 5%的醋酸加入到殼聚糖中，攪拌，溶解，溶解后再過濾，得到濾液；2)向步驟I)得到的濾液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 8%的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值至7 8，出現(xiàn)沉淀物，過濾，洗滌，再過濾，得到沉淀物；3)將步驟2)中得到的沉淀物進(jìn)行干燥，即得所述的精制殼聚糖。進(jìn)一步，在步驟2)中，所述洗滌所述洗滌用的溶液為蒸餾水。進(jìn)一步，在步驟3)中，所述干燥的時(shí)間為24 48小時(shí)。 本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供一種用上述制備方法制得的殼聚糖衍生物在抗凝血藥物上的應(yīng)用。血紅細(xì)胞膜具有由磷脂分子及膽固醇分子自組裝形成的雙層膜.因此設(shè)計(jì)了含有膽固醇基的細(xì)胞膜仿生生物材料，有效地改善了材料的血液相容性。殼聚糖(Chitosan，CS)是甲殼素部分脫乙?；漠a(chǎn)物。這種天然的聚合物具有無毒性、生物降解性和生物相容性的特性，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。殼聚糖本身具有很強(qiáng)的凝血作用，其很多衍生物卻有較好的抗凝血作用。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明的殼聚糖衍生物，即0-磺酸基-N-膽留醇-殼聚糖具有良好的抗凝血性，且價(jià)格低廉，極有希望作為肝素的替代物用于臨床。為臨床提供一種新的價(jià)廉、療效好的抗凝血?jiǎng)?。而且合成過程易于操作，簡便醫(yī)德，易于工業(yè)化大生產(chǎn)，產(chǎn)業(yè)化程度高，投入及開發(fā)成本較小，為一種良好的具有潛在價(jià)值的海洋新藥。


圖I為本發(fā)明殼聚糖衍生物的制備方法中的殼聚糖與丁二酰化殼聚糖的紅外光譜圖；圖2本發(fā)明殼聚糖衍生物的制備方法中的磺酸基殼聚糖的IH-NMR圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I一種殼聚糖衍生物的制備方法，其具體制備步驟如下I、殼聚糖的精制
配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的醋酸溶液用移液管移取2. 5ml冰醋酸溶液于250ml容量瓶，用去離子水定容到刻線，搖勻即得。配置2%的氫氧化鈉溶液稱取氫氧化鈉顆粒2g，用去離子水溶于小燒杯中，轉(zhuǎn)移至IOOml量瓶，再用去離子水定容，搖勻即得。稱取5. Og殼聚糖置于500ml小燒杯中，加入250ml的I %醋酸，置于恒溫磁力攪拌器上攪拌溶解。溶解后，將殼聚糖溶液用布氏漏斗抽濾。濾液轉(zhuǎn)移至500ml的燒杯，用2%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7，此時(shí)出現(xiàn)大量白色沉淀。再次抽濾，并用蒸餾水洗至中性，抽濾脫水，濾餅至于表面皿中。將表面皿置于真空干燥箱干燥24小時(shí)，即得精制殼聚糖。2、丁二酸單膽固醇酯殼聚糖的合成
丁二酸單膽固醇酯的合成分別稱取2. Og膽固醇(5mmol)、1.5g 丁二酸酐(15mmol)、0. Ig DMAP (0. 8mmol)，置于IOOml圓底燒瓶中，加入40ml 二氯甲烷溶解，將圓底燒瓶置于恒溫水浴鍋中，加熱至回流，恒溫反應(yīng)40h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾液用去離子水，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%HCl(2mol/L)溶液各洗滌兩次(20ml)后，減壓蒸除溶劑。并置于燒杯中，力口入丙酮溶液，重結(jié)晶，出現(xiàn)白色固體。配置2%的醋酸溶液用移液管移取Iml冰醋酸溶液于50ml容量瓶，用去離子水定容到刻線，搖勻即得。膽固醇?xì)ぞ厶堑暮铣煞Q取0. 25g精制殼聚糖于IOOml圓底燒瓶，加入15ml、I %的醋酸溶液，置于恒溫磁力攪拌器上攪拌溶解lh。精密稱取單膽固醇琥珀酸酯12. 6mg，于小燒杯中溶于5ml丙酮。將圓底燒瓶轉(zhuǎn)移到恒溫水浴鍋中，升溫到40°C。恒溫?cái)嚢柘?，將單膽固醇琥珀酸酯的丙酮溶液滴加到圓底燒瓶中，并反應(yīng)20h。反應(yīng)結(jié)束后，在其中加入3倍丙酮(約45ml丙酮)，出現(xiàn)大量白色沉淀。抽濾，濾餅用丙酮洗滌4次，抽濾除去丙酮。濾餅置于表面皿上，40°C下置于真空干燥箱干燥即得。3、磺酸基殼聚糖的制備量取25mlDMF置于IOOml圓底燒瓶，冰水浴攪拌下滴加約4ml氯磺酸，攪拌混勻。將圓底燒瓶轉(zhuǎn)移至恒溫水浴鍋，升溫至40°C，加入精密稱取的丁二酸單膽固醇酯殼聚糖197. 9mg,恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)15h。20%氫氧化鈉溶液的配置稱取氫氧化鈉顆粒20g，用去離子水溶于小燒杯中，轉(zhuǎn)移至IOOml量瓶，再用去離子水定容，搖勻即得。反應(yīng)結(jié)束后將圓底燒瓶置于冰水浴中，滴加20%氫氧化鈉溶液中和至中性，出現(xiàn)白色沉淀。抽濾，取濾液儲存于小燒杯待用。透析袋的處理選截留分子量為8000 12000的透析帶，剪成長約5cm，寬約3cm的兩段，并剪四段細(xì)線，一起放入IOOOml的大燒杯，在燒杯中加滿去離子水，并于多功能萬用電爐上加熱煮沸30min。30min后，用鑷子夾出透析帶，用煮過的細(xì)線綁住一端，搓開帶子呈袋狀，待其中加入待透析液，封住另一端即得。透析將小燒杯中的濾液封入兩個(gè)透析袋中，分別放入盛滿去離子水的IOOOml大燒杯中，置于恒溫磁力攪拌器上攪拌2d，且每隔6h換一次水。冷凍干燥透析結(jié)束后，取透析液裝入IOml西林瓶，每瓶裝入約五分之一的透析液。封口后置于冷凍干燥箱中冷凍干燥。為證實(shí)所得產(chǎn)物的確是所要物質(zhì)，用氫譜對產(chǎn)物進(jìn)行表征，可證實(shí)。
一種用實(shí)施例I的制備方法制得的殼聚糖衍生物在抗凝血藥物上的應(yīng)用。實(shí)施例2一種殼聚糖衍生物的制備方法，其具體制備步驟如下I、殼聚糖的精制I)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸加入到殼聚糖中，攪拌，溶解，溶解后再過濾，得到濾液；2)向步驟I)得到的濾液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值至7，出現(xiàn)沉淀物，過濾，再用蒸餾水洗滌，再過濾，得到沉淀物；3)將步驟2)中得到的沉淀物進(jìn)行干燥，干燥時(shí)間為24小時(shí)，即得所述的精制殼聚 糖。2、丁二酸單膽固醇酯殼聚糖的合成(I)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的醋酸溶液加入到精制殼聚糖中，攪拌，溶解lh，得到殼聚糖的醋酸溶液，備用，所述醋酸溶液與精制殼聚糖的質(zhì)量比為40 I ；(2)將二氯甲烷加入到膽固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解，所述膽固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的質(zhì)量比為10 10 1，溶解，加熱至40°C并反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，得到濾液，將所述濾液用去離子水洗滌兩次后再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%HCl溶液洗滌兩次后，除去盡可能的雜質(zhì)，再進(jìn)行減壓蒸除溶劑，再加入丙酮溶液，重結(jié)晶，得到丁二酸單膽固醇酯(琥珀酸單膽固醇酯)，所述丙酮溶液與所述二氯甲烷的體積比為1:1;(3)將步驟(2)中得到的丁二酸單膽固醇酯滴加到丙酮中，溶解，得到丁二酸單膽固醇酯的丙酮溶液；(4)將步驟(I)中制得的殼聚糖的醋酸溶液加熱至30°C并不斷攪拌，然后將步驟(3)中制得的丁二酸單膽固醇酯的丙酮溶液滴加到殼聚糖的醋酸溶液中，反應(yīng)15小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，再加入丙酮(再加入的丙酮與步驟(3)中丙酮的體積比為3 1)，出現(xiàn)沉淀物，過濾后得到沉淀物；(5)將步驟⑷中得到的沉淀物，用丙酮洗滌3次，再過濾除去丙酮，得到洗滌后的沉淀物，最后將洗滌后的沉淀物在20°C下進(jìn)行干燥，得到所述的丁二酸單膽固醇酯殼聚糖。3、磺酸基殼聚糖的制備將氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中，所述氯磺酸與二甲基甲酰胺的體積比為
I 10，攪拌均勻，并將其升溫至30°C，然后加入丁二酸單膽固醇酯殼聚糖，攪拌并反應(yīng)12h后，再滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鈉溶液，中和至pH值為6，過濾，取濾液待用；再將得到的濾液進(jìn)行透析，透析結(jié)束后進(jìn)行冷凍干燥，得到所述的殼聚糖衍生物。為證實(shí)所得產(chǎn)物的確是所要物質(zhì)，用氫譜對產(chǎn)物進(jìn)行表征，可證實(shí)。一種用實(shí)施例2的制備方法制得的殼聚糖衍生物在抗凝血藥物上的應(yīng)用。實(shí)施例3一種殼聚糖衍生物的制備方法，其具體制備步驟如下I、殼聚糖的精制I)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的醋酸加入到殼聚糖中，攪拌，溶解，溶解后再過濾，得到濾液；
2)向步驟I)得到的濾液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值至7. 5，出現(xiàn)沉淀物，過濾，再用蒸餾水洗滌，再過濾，得到沉淀物；3)將步驟2)中得到的 沉淀物進(jìn)行干燥，干燥時(shí)間為36小時(shí)，即得所述的精制殼 聚糖。2、丁二酸單膽固醇酯殼聚糖的合成(I)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的醋酸溶液加入到精制殼聚糖中，攪拌，溶解2h，得到殼聚糖的醋酸溶液，備用，所述醋酸溶液與精制殼聚糖的質(zhì)量比為60 I ；(2)將二氯甲烷加入到膽固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解，所述膽固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的質(zhì)量比為20 15 2，溶解，加熱至50°C并反應(yīng)36小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，得到濾液，將所述濾液用去離子水洗滌兩次后再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%HCl溶液洗滌兩次后，除去盡可能的雜質(zhì)，再進(jìn)行減壓蒸除溶劑，再加入丙酮溶液，重結(jié)晶，得到丁二酸單膽固醇酯(琥珀酸單膽固醇酯)，所述丙酮溶液與所述二氯甲烷的體積比為1:1;(3)將步驟(2)中得到的丁二酸單膽固醇酯滴加到丙酮中，溶解，得到丁二酸單膽固醇酯的丙酮溶液；(4)將步驟(I)中制得的殼聚糖的醋酸溶液加熱至40°C并不斷攪拌，然后將步驟(3)中制得的丁二酸單膽固醇酯的丙酮溶液滴加到殼聚糖的醋酸溶液中，反應(yīng)20小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，再加入丙酮(再加入的丙酮與步驟(3)中丙酮的體積比為3 1)，出現(xiàn)沉淀物，過濾后得到沉淀物；(5)將步驟⑷中得到的沉淀物，用丙酮洗滌4次，再過濾除去丙酮，得到洗滌后的沉淀物，最后將洗滌后的沉淀物在50°C下進(jìn)行干燥，得到所述的丁二酸單膽固醇酯殼聚糖。3、磺酸基殼聚糖的制備將氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中，所述氯磺酸與二甲基甲酰胺的體積比為4 25，攪拌均勻，并將其升溫至40°C，然后加入丁二酸單膽固醇酯殼聚糖，攪拌并反應(yīng)15h后，再滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的氫氧化鈉溶液，中和至pH值為7，過濾，取濾液待用；再將得到的濾液進(jìn)行透析，透析結(jié)束后進(jìn)行冷凍干燥，得到所述的殼聚糖衍生物。為證實(shí)所得產(chǎn)物的確是所要物質(zhì)，用氫譜對產(chǎn)物進(jìn)行表征，可證實(shí)?！N用實(shí)施例3的制備方法制得的殼聚糖衍生物在抗凝血藥物上的應(yīng)用。實(shí)施例4一種殼聚糖衍生物的制備方法，其具體制備步驟如下I、殼聚糖的精制I)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的醋酸加入到殼聚糖中，攪拌，溶解，溶解后再過濾，得到濾液；2)向步驟I)得到的濾液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值至8，出現(xiàn)沉淀物，過濾，再用蒸餾水洗滌，再過濾，得到沉淀物；3)將步驟2)中得到的沉淀物進(jìn)行干燥，干燥時(shí)間為48小時(shí)，即得所述的精制殼聚糖。2、丁二酸單膽固醇酯殼聚糖的合成(I)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的醋酸溶液加入到精制殼聚糖中，攪拌，溶解3h，得到殼聚糖的醋酸溶液，備用，所述醋酸溶液與精制殼聚糖的質(zhì)量比為80 I ；(2)將二氯甲烷加入到膽固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解，所述膽固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的質(zhì)量比為30 20 3，溶解，加熱至60°C并反應(yīng)48小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，得到濾液，將所述濾液用去離子水洗滌兩次后再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%HC I溶液洗滌兩次后，除去盡可能的雜質(zhì)，再進(jìn)行減壓蒸除溶劑，再加入丙酮溶液，重結(jié)晶，得到丁二酸單膽固醇酯(琥珀酸單膽固醇酯)，所述丙酮溶液與所述二氯甲烷的體積比為1:1;(3)將步驟(2)中得到的丁二酸單膽固醇酯滴加到丙酮中，溶解，得到丁二酸單膽固醇酯的丙酮溶液；(4)將步驟(I)中制得的殼聚糖的醋酸溶液加熱至50°C并不斷攪拌，然后將步驟
(3)中制得的丁二酸單膽固醇酯的丙酮溶液滴加到殼聚糖的醋酸溶液中，反應(yīng)25小時(shí)，反 應(yīng)結(jié)束后，再加入丙酮(再加入的丙酮與步驟(3)中丙酮的體積比為3 1)，出現(xiàn)沉淀物，過濾后得到沉淀物；(5)將步驟⑷中得到的沉淀物，用丙酮洗滌5次，再過濾除去丙酮，得到洗滌后的沉淀物，最后將洗滌后的沉淀物在80°C下進(jìn)行干燥，得到所述的丁二酸單膽固醇酯殼聚糖。3、磺酸基殼聚糖的制備將氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中，所述氯磺酸與二甲基甲酰胺的體積比為6 40，攪拌均勻，并將其升溫至50°C，然后加入丁二酸單膽固醇酯殼聚糖，攪拌并反應(yīng)18h后，再滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的氫氧化鈉溶液，中和至pH值為8，過濾，取濾液待用；再將得到的濾液進(jìn)行透析，透析結(jié)束后進(jìn)行冷凍干燥，得到所述的殼聚糖衍生物。為證實(shí)所得產(chǎn)物的確是所要物質(zhì)，用氫譜對產(chǎn)物進(jìn)行表征，可證實(shí)。對比實(shí)施例5丁二?；瘹ぞ厶茄苌锏闹苽渑渲?%的鹽酸溶液精密移取2. 7ml的38%鹽酸溶液，置于50ml小燒杯中，用去離子水稀釋，后轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，去離子水定容，搖勻即得。丁二酸酐丙酮溶液的配置精密稱取丁二酸酐23mg于IOml小量瓶，加入丙酮溶液溶解并定容，搖勻即得。精密稱取精制殼聚糖0. 51g于IOOml燒杯中，加入2%鹽酸溶液50ml，置于恒溫磁力攪拌器上攪拌溶解，儲存過夜。將燒杯中殼聚糖鹽酸溶液轉(zhuǎn)移至IOOml圓底燒瓶，并將圓底燒瓶置于恒溫水浴鍋中，調(diào)節(jié)溫度至40°C，同時(shí)攪拌。移取Iml 丁二酸酐丙酮溶液，攪拌下，緩慢滴加到殼聚糖溶液中，恒溫反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用3倍丙酮溶液(約150ml左右)沉淀。然后用布氏漏斗抽濾，沉淀物再用丙酮溶液洗滌5次，抽濾脫去丙酮。將白色濾餅置于表面皿中，并于40°C真空干燥箱干燥至恒重。具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn)實(shí)施例I殼聚糖衍生物體外抗凝血的驗(yàn)證磺酸基殼聚糖的體外抗凝血實(shí)驗(yàn)取兩只直徑1cm，長IOcm的玻璃試管，編號為I和2。I號加入0. 2ml磺酸基殼聚糖透析液，2號不加。然后分別加入新鮮小鼠血液0. 3ml,立刻混勻，并于37°C水浴，每隔30s傾斜玻璃管，記錄血液凝固時(shí)間。每組測量三個(gè)樣本。
0. Olmol/L PBS溶液的配置稱取十二水合磷酸氫二鈉2. 9g，二水合磷酸二氫鈉0. 3g于IOOml容量瓶中，加去離子水溶解并定容到刻線，搖勻即得0. Imo 1/LpH為7. 4的PBS溶液。移取該溶液Iml于IOml容量瓶，加去離子水定容到刻線，搖勻即得。丁二?；瘹ぞ厶侨芤旱呐渲镁芊Q取10. 2mg 丁二酰化殼聚糖于小燒杯，加入0. 01mol/L PBS溶液攪拌溶解，即得。丁二?；瘹ぞ厶堑捏w外抗凝血實(shí)驗(yàn)取兩只直徑1cm，長IOcm的玻璃試管，編號為3和4。3號加入0. 2ml 丁二?；瘹ぞ厶侨芤海?號不加。然后分別加入新鮮小鼠血液0. 3ml,立刻混勻，并于37°C水浴，每隔30s傾斜玻璃管，記錄血液凝固時(shí)間。每組測量三個(gè)樣本。試驗(yàn)實(shí)施例2殼聚糖衍生物的抗凝血指數(shù)和溶血度小鼠眼瞼取血先取EP管，滴入肝素鈉注射液I滴，旋轉(zhuǎn)使整個(gè)EP管均勻鋪滿肝素鈉注射液。取玻璃吸管插入小鼠眼角部位，旋轉(zhuǎn)取血，用肝素鈉注射液的EP管接血，輕輕混勻。生理鹽水的配置稱取0. 9g氯化鈉于IOOml容量瓶，加去離子水使其溶解，并定容的刻線，即得。0. 5mol/L醋酸溶液的配置查資料可知冰醋酸濃度為17. 485mol/L。用移液管移取0. 29ml冰醋酸溶液于IOml小量瓶，加去離子水定容到刻度線，搖勻即得。1%殼聚糖和1%丁二?；瘹ぞ厶侨芤旱呐渲品謩e精密稱取殼聚糖和丁二酰化殼聚糖各50mg于小燒杯，加入0. 5mol/L醋酸溶液溶解，待完全溶解后轉(zhuǎn)移至5ml小量瓶，并定容至刻度線，搖勻即得?？鼓獙?shí)驗(yàn)取三只IOOml小燒杯,編號分別為I, 2, 3號。I號加入0. Iml磺酸基殼聚糖透析液，2號加入Iml 1%丁二?；瘹ぞ厶侨芤海?號什么都不加。再分別加入0. 2ml新鮮抗凝小鼠血，輕輕混勻并使之平鋪于燒杯底部。5分鐘后，將50ml生理鹽水緩慢流注于血液表面，輕輕搖勻后用紫外-可見分光光度計(jì)在540nm處測吸光度值。按照相同方法每個(gè)樣品平行測定5次，其平均吸光度值記為As，材料的抗凝血指數(shù)(BCI)定義為BCI = As/Aw X 100%(I)Aw為0. 2mL新鮮抗凝小鼠血與50ml生理鹽水混合后的吸光度。溶血實(shí)驗(yàn)取新鮮抗凝小鼠血0. 4ml加生理鹽水0. 5ml得稀釋血。取5只離心試管并編號為A，B，C，D，E號。A加入4. 5ml生理鹽水和0. 5ml I %的殼聚糖醋酸溶液，B加入4. 5ml生理鹽水和0. 5ml 1%的丁二?；瘹ぞ厶谴姿崛芤?，C加入4. 5ml生理鹽水和0. Iml磺酸基殼聚糖透析液。37°C恒溫30min后加入稀釋血0. 2mL,繼續(xù)恒溫60min,再以900r/min離心8min，取上清液用紫外-可見分光光度計(jì)在540nm處測吸光度值，5次平行測定吸光度平均值記為AS。按同樣方法，D為陽性對照，用5mL蒸餾水加稀釋血0. 2mL ;E為陰性對照，用5mL生理鹽水加稀釋血0. 2mL，分別測定吸光度值。按下式計(jì)算材料的溶血度HR = (AS-AN)/(AP-AN) X 100% (2)式中AP陽性對照吸光度，AN為陰性對照吸光度。試驗(yàn)實(shí)施例3磺酸基殼聚糖的表征制備的磺酸基殼聚糖透析液澄清透明，凍干后呈白色絮狀。凍干的磺酸基殼聚糖溶解于D20中，記錄磺酸基殼聚糖的IH-NMR如圖2所示。如圖2所示，殼聚糖已經(jīng)成功接枝了磺酸基和丁二酸酐膽固醇(4 5部位為殼聚糖本體，2 3為磺酸基部位，8 9為膽固醇部位)，說明磺酸基殼聚糖合成。試驗(yàn)實(shí)施例4 殼聚糖衍生物抗凝血作用的驗(yàn)證
磺酸基殼聚糖體外抗凝血實(shí)驗(yàn)加入磺酸基殼聚糖與未加的小鼠血液凝血時(shí)間如表I所示。表I磺酸基殼聚糖體外抗凝血時(shí)間
編號凝血時(shí)間平均
1>10min >1Omin>10min >10min
240s42s43s43.5s從上表可以看出，相同條件下，加入磺酸基殼聚糖的小鼠血液凝固時(shí)間要遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于未加該殼聚糖的血液，說明磺酸基殼聚糖具有很好的抗凝血作用?？瞻籽和耆?，而磺酸基殼聚糖后的血液一直未凝固。取加入磺酸基殼聚糖的小鼠血液，做成血涂片，并置于顯微鏡下觀察，可觀察到有完整的紅細(xì)胞。說明加入磺酸基殼聚糖溶液的小鼠血液并沒有全部溶血，磺酸基殼聚糖的確具有很好的抗凝血效果。丁二酰化殼聚糖的體外抗凝血實(shí)驗(yàn)加入丁二?；瘹ぞ厶桥c未加的小鼠血液凝血時(shí)間如表2所示。表2 丁二?；瘹ぞ厶求w外抗凝血時(shí)間
編號凝血時(shí)間
飛98s IOOs105sIOls442s 44s45s43.5s從上表可以看出，相同條件下，加入丁二?；瘹ぞ厶堑男∈笱耗虝r(shí)間長于未加該殼聚糖的血液，說明丁二?；瘹ぞ厶且灿锌鼓饔?。空白血液完全凝固，而加入丁二?；瘹ぞ厶呛蟮难汉髞硪材塘?，由于丁二酰化殼聚糖溶于PBS中，故出現(xiàn)了一定的溶血血現(xiàn)象。說明丁二?；瘹ぞ厶请m然也具有抗凝血作用，但抗凝血效果不理想。試驗(yàn)實(shí)施例5殼聚糖衍生物的抗凝血指數(shù)和溶血度殼聚糖衍生物的抗凝血指數(shù)加入殼聚糖衍生物和空白血液經(jīng)處理后吸光度值如下表所示。表3抗凝血試驗(yàn)
表3抗凝血試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.種殼聚糖衍生物的制備方法，其特征在于，其具體制備步驟如下 將氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中，所述氯磺酸與二甲基甲酰胺的體積比為I 6 10 40，攪拌均勻，并將其升溫至30 50°C，然后加入丁二酸單膽固醇酯殼聚糖，攪拌并反應(yīng)12 18h后,再滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 30%的氫氧化鈉溶液，中和至pH值為6 8,過濾，取濾液待用；再將得到的濾液進(jìn)行透析，透析結(jié)束后進(jìn)行冷凍干燥，得到所述的殼聚糖衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述丁二酸單膽固醇酯殼聚糖的制備方法為 (1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I 5%的醋酸溶液加入到精制殼聚糖中，攪拌，溶解I 3h，得到殼聚糖的醋酸溶液，備用，所述醋酸溶液與精制殼聚糖的質(zhì)量比為80 : I 40 : I; (2)將二氯甲烷加入到膽固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解，所述膽固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的質(zhì)量比為10 30 10 20 I 3，溶解，加熱至40 60°C并反應(yīng)24 48小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，得到濾液，將所述濾液洗滌后，進(jìn)行減壓蒸除溶齊U，再加入丙酮溶液，重結(jié)晶，得到丁二酸單膽固醇酯，所述丙酮溶液與所述二氯甲烷的體積比為1:1; (3)將步驟(2)中得到的丁二酸單膽固醇酯滴加到丙酮中，溶解，得到丁二酸單膽固醇酯的丙酮溶液； (4)將步驟(I)中制得的殼聚糖的醋酸溶液加熱至30 50°C并不斷攪拌，然后將步驟(3)中制得的丁二酸單膽固醇酯的丙酮溶液滴加到殼聚糖的醋酸溶液中，反應(yīng)15 25小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，再加入丙酮，出現(xiàn)沉淀物，過濾后得到沉淀物； (5)將步驟(4)中得到的沉淀物，用丙酮洗滌，再過濾除去丙酮，得到洗滌后的沉淀物，最后將洗滌后的沉淀物進(jìn)行干燥，得到所述的丁二酸單膽固醇酯殼聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述濾液洗滌是用去離子水洗滌兩次后再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%HC1溶液洗滌兩次。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟(4)中所述再加入的丙酮與步驟(3)中丙酮的體積比為3 I。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟(5)中，所述用丙酮洗滌的次數(shù)為3 5次。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟(5)中，所述將洗滌后的沉淀物進(jìn)行干燥的溫度為20 80°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟(I)中，所述精制殼聚糖的制備方法為 1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I 5%的醋酸加入到殼聚糖中，攪拌，溶解，溶解后再過濾，得到濾液； 2)向步驟I)得到的濾液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 8%的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值至7 8，出現(xiàn)沉淀物，過濾，洗滌，再過濾，得到沉淀物； 3)將步驟2)中得到的沉淀物進(jìn)行干燥，即得所述的精制殼聚糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，在步驟2)中，所述洗滌用的溶液為蒸餾水。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，在步驟3)中，所述干燥的時(shí)間為24 48小時(shí)。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求I 9任一項(xiàng)制備方法所得的殼聚糖衍生物在抗凝血藥物上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殼聚糖衍生物的制備方法，其具體制備步驟如下將氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中，所述氯磺酸與二甲基甲酰胺的體積比為1～610～40，攪拌均勻，并將其升溫至30～50℃，然后加入丁二酸單膽固醇酯殼聚糖，攪拌并反應(yīng)12～18h后，再滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10～30%的氫氧化鈉溶液，中和至pH值為6～8，過濾，取濾液待用；再將得到的濾液進(jìn)行透析，透析結(jié)束后進(jìn)行冷凍干燥，得到所述的殼聚糖衍生物。本發(fā)明還涉及一種殼聚糖衍生物在抗凝血藥物上的應(yīng)用。本發(fā)明合成過程易于操作，簡便醫(yī)德，易于工業(yè)化大生產(chǎn)，產(chǎn)業(yè)化程度高，投入及開發(fā)成本較小，為一種良好的具有潛在價(jià)值的海洋新藥。
文檔編號A61P7/02GK102702382SQ201110235390
公開日2012年10月3日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月17日
發(fā)明者陳大全 申請人:煙臺大學(xué)