專利名稱：葉酸修飾的o-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種葉酸修飾的O-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物，及其制備方法， 以及其作為介導(dǎo)靶向殼聚糖載藥納米膠束在制備抗腫瘤藥物受體靶向納米膠束制劑中的應(yīng)用，屬于藥物制劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，腫瘤已成為嚴(yán)重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，其死亡率占全球人類死亡總數(shù)的12%。因此，近半個世紀(jì)以來攻克腫瘤一直是各國政府與科研、醫(yī)療機(jī)構(gòu)的主要任務(wù)之一?；熥鳛槟[瘤三大常規(guī)治療方法之一，已成為腫瘤治療不可缺少的手段。目前臨床上常用的抗腫瘤化療用藥多以細(xì)胞毒性型藥物為主。腫瘤化療的根本目的是在保證患者安全的情況下以藥物消滅腫瘤細(xì)胞，即要求所使用的藥物對機(jī)體正常細(xì)胞無損害而對腫瘤細(xì)胞呈敏感的殺滅作用，達(dá)到安全、有效治愈腫瘤的目的。然而，實(shí)際上臨床使用的抗腫瘤化療藥物均有不同程度的毒副作用，有些嚴(yán)重的毒副反應(yīng)是限制藥物用藥劑量和使用的直接原因。發(fā)生這些毒副反應(yīng)的主要原因在于化療藥物缺乏對腫瘤部位的特異性，大劑量給藥時產(chǎn)生非特異性毒性，甚至對正常組織造成嚴(yán)重的損傷。例如紫杉醇(PaclitaXel，PTX)是從紅豆杉屬植物中分離提取的一種含有紫杉烷結(jié)構(gòu)的高效的細(xì)胞毒類新型抗癌藥，自1992 年FDA批準(zhǔn)PTX用于卵巢癌的臨床治療以來，由于其獨(dú)特的微管穩(wěn)定作用已被廣泛應(yīng)用于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤、非小細(xì)胞肺癌以及與艾滋病相關(guān)的KaPosi肉瘤的治療。但是由于PTX溶解度極低(僅約為1 μ g/mL)、治療指數(shù)窄、口服生物利用度差，因而臨床上唯一可獲得的PTX制劑為泰素注射液。上市注射液的增溶溶媒聚氧乙烯蓖麻油易產(chǎn)生諸如神經(jīng)毒性、腎毒性、心臟毒性、高敏性等毒副作用，加之PTX對心臟和腎亦有一定毒副作用，因此，PTX在臨床上的應(yīng)用受到了很大的限制。同樣的情況也發(fā)生在其它抗腫瘤藥物的注射劑中。所以，人們希望尋找出可以增加難溶性抗腫瘤藥物溶解度并且提高腫瘤組織內(nèi)藥物濃度而正常組織中藥物濃度較低的一種制劑形式，從而提高療效、降低藥物帶來的毒副反應(yīng)。藥物靶向技術(shù)就是為了解決這些問題而提出的并已成為整個藥學(xué)研究領(lǐng)域的執(zhí)占之一。納米給藥系統(tǒng)是近年來抗腫瘤藥物載體研究中的熱點(diǎn)。它具有改善藥物的溶解性，延長藥物在腫瘤部位的滯留時間，提高藥物生物利用度和具有一定靶向性等優(yōu)點(diǎn)，從而可提高抗腫瘤藥物的療效和減少化療中的非特異性不良反應(yīng)，尤其適用于腫瘤的治療。近年來，由親水基和疏水基團(tuán)組成的兩親性納米膠束在生物工程和藥物制劑領(lǐng)域受到了廣泛的研究。在水溶液中，各種兩親性聚合物為了減小表面自由能，通過疏水基團(tuán)的分子內(nèi)或分子間的促進(jìn)作用自發(fā)的形成膠束或自聚物。這些聚合物的膠束或自聚物由疏水性的內(nèi)核和親水性的外殼組成，由于疏水性的內(nèi)核能夠作為許多水溶性差的生物活性劑的容器，故而這種核殼結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是一種有前途的藥物傳輸載體。再者，這些聚合物膠束顯示了特殊的性質(zhì)，諸如不同的流變學(xué)特征、小的流體半徑和熱力學(xué)的穩(wěn)定性。因此，在過去的十年里，在開發(fā)新型的兩親聚合物諸如兩親性嵌段共聚物和疏水修飾的聚合物方面做了很大的努力。 近年，諸如殼聚糖、葡聚糖和普魯蘭糖等天然多糖受到了廣泛的關(guān)注，它們能夠被烷基鏈和膽汁酸疏水性修飾，形成納米大小的膠束或自聚物作為藥物傳輸系統(tǒng)。特別地，疏水修飾的殼聚糖在水溶液中形成的自聚物，作為疏水性藥物或基因的載體顯示了很好的潛力。殼聚糖，甲殼素的N-脫乙?；苌铮瞧咸前泛蚇-乙酰葡糖胺通過β_(1，4) 糖胺鍵連結(jié)的聚合物。近來，由于殼聚糖好的生物相容性、生物可降解性、和低的毒性，殼聚糖作為藥物或基因的載體吸引了科研人員很大的興趣。然而，殼聚糖在生理溶液中水溶性差是其在藥物傳輸中廣泛應(yīng)用的主要缺陷。據(jù)報(bào)道，殼聚糖的水溶性可通過許多途徑得以提高，諸如氨基的季氨化作用、羧甲基化和PEG化。PEG修飾的殼聚糖顯示出好的水溶性和生物相容性，在生理?xiàng)l件下具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的納米粒。羧甲基化被認(rèn)為是一種提高許多多糖水溶性的好方法。0-羧甲基殼聚糖(OCMC)，一種殼聚糖的羧甲基衍生物，其好的生物相容性、生物活性、抗腫瘤活性和水溶性在早期的文獻(xiàn)中已有報(bào)道，若將其進(jìn)行化學(xué)修飾的疏水改性，可在水性介質(zhì)中自聚集形成納米膠束。脫氧膽酸(DOCA)是一種最常用的疏水改性劑，其分子中既包含像碳原子側(cè)鏈末端的羧基和3α、12α位的羧基這樣的親水基，又包含環(huán)戊烯菲這樣的疏水基。因而，期望在OCMC中引入DOCA可通過自聯(lián)作用形成具有疏水核心的自聚物。然而，這種自聚物不能夠從網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(REQ逃逸，可被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng) (MPS)清除。再者，自聚物在腫瘤部位的不充分?jǐn)z取降低了給藥劑量的藥物療效，非特異的相關(guān)的正常組織毒副作用限制了最大給藥劑量的安全使用。這些限制條件阻礙了載藥自聚物完成潛在治療作用的可能性。為了完成腫瘤靶向給藥，研究人員已經(jīng)嘗試了很多方法，一個策略就是利用在腫瘤組織特定過渡表達(dá)的獨(dú)特的分子標(biāo)記物。眾所周知，葉酸受體(FR) 即葉酸偶聯(lián)蛋白，在許多人類實(shí)體腫瘤(卵巢癌、腎癌、子宮癌、結(jié)腸癌、肺癌)細(xì)胞表面過渡表達(dá)，但在正常細(xì)胞表面很少發(fā)現(xiàn)。葉酸(FA)作為配基用于靶向細(xì)胞膜并通過葉酸受體促進(jìn)納米粒的內(nèi)吞作用。重要的是，葉酸軛合物即通過葉酸Y羧基的共價(jià)衍生物，能夠保持很強(qiáng)的受體親和性，并且細(xì)胞通過葉酸受體攝取葉酸和葉酸軛合物的機(jī)制是一樣的。葉酸受體在靶細(xì)胞的再循環(huán)能導(dǎo)致吸收更多的葉酸軛合物。到目前為止，許多研究已經(jīng)報(bào)道了葉酸聚合物膠束、大分子納米粒和脂質(zhì)體作為抗癌劑或基因的靶向載體。葉酸類化合物作為腫瘤靶向的生理性配體，與腫瘤特異性單克隆抗體相比，具有費(fèi)用低、高度的化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性、無免疫原性、與受體的高度親和性、較快的腫瘤細(xì)胞內(nèi)攝取等優(yōu)點(diǎn)；再者，葉酸類化合物與其配體結(jié)合具有高親和性、選擇性、飽和性和生物效應(yīng)明顯等優(yōu)點(diǎn)，且葉酸受體僅在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，在正常組織無或很少表達(dá)，故具有很好的腫瘤組織特異性。因此，這種利用葉酸為靶彈頭，將葉酸連結(jié)到聚合物膠束表面，通過與葉酸受體特異結(jié)合而將藥物靶向投遞到腫瘤組織的方法，可以提高藥物在病灶局部的濃度， 提高療效、降低毒副作用，達(dá)到靶向治療的目的。綜上所述，研制一種可逃避巨噬細(xì)胞吞噬的葉酸受體靶向納米膠束作為難溶性抗腫瘤藥物的載體，可以改變藥物分布，增加藥物在體內(nèi)的滯留時間，提高抗癌藥物的腫瘤組織靶向性，在腫瘤的診斷和靶向治療中具有很大的研究開發(fā)前景。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物，其可以作為介導(dǎo)靶向聚合物納米膠束，用于包載難溶性抗腫瘤藥或抗腫瘤藥物增敏劑，制得的載藥聚合物納米膠束可有效逃避巨噬細(xì)胞的吞噬，延長藥物在體內(nèi)的滯留時間， 并可通過葉酸受體途徑有效攝入腫瘤細(xì)胞，增加藥物在腫瘤組織的分布，從而提高療效、降低毒副作用，達(dá)到靶向治療的目的。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物，是以葉酸、0-羧甲基殼聚糖和脫氧膽酸為原料制備而成的主動靶向的納米膠束載體材料，其是通過以下制備方法得到的(1) ο-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)①稱取250mg的O-羧甲基殼聚糖溶解在25ml蒸餾水中，然后加入75ml甲醇稀釋；②將制備量的(35 ^Omg)脫氧膽酸溶解于IOml無水二甲基亞砜中，然后加入相當(dāng)于脫氧膽酸1. 5倍摩爾量的1-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亞胺鹽酸鹽和相當(dāng)于脫氧膽酸1. 5倍摩爾量的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下攪拌池以活化脫氧膽酸；③將步驟②中活化的脫氧膽酸加入步驟①中溶解有0-羧甲基殼聚糖的溶液中， 強(qiáng)烈攪拌至溶液呈光學(xué)透明，然后使混合液在室溫下反應(yīng)36h，得到反應(yīng)溶液；④將上述得到的反應(yīng)溶液在甲醇與水的混合溶液(體積比4 1)中透析(透析袋截留相對分子質(zhì)量14k) 3天，以除去未反應(yīng)的脫氧膽酸及反應(yīng)副產(chǎn)物，然后冷凍干燥，即得兩親性的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)物，即DOMC ；(2) 0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸與葉酸偶聯(lián)①將制備量的(0. 8 2. 4mol)的葉酸或葉酸衍生物溶解于IOml無水二甲基亞砜中，然后滴加3 5滴三乙胺，并加入相當(dāng)于葉酸2倍摩爾量的1-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亞胺鹽酸鹽和相當(dāng)于葉酸2倍摩爾量的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下連續(xù)攪拌2h， 制成葉酸活性酯溶液；②稱取250mg的O-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)物(DOMC)溶解于25ml蒸餾水中，然后加入25ml甲醇，攪拌至溶液光學(xué)透明；③將葉酸活性酯溶液滴加到步驟②得到的DOMC溶液中，在室溫下攪拌36h，使葉酸偶聯(lián)到殼聚糖分子上；然后滴加0. IM的氫氧化鈉溶液至pH值為9. 0，終止反應(yīng)，得反應(yīng)液；④將上述得到的反應(yīng)液在pH值為7. 4的磷酸緩沖鹽溶液以及蒸餾水中各透析3 天，冷凍干燥，得葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物，即D0MC-FA。所述0-羧甲基殼聚糖為殼聚糖衍生物，其脫乙酰度> 85%，羧甲基取代度 ^ 80%，分子量為 50，000-150，000。所述脫氧膽酸的取代度范圍在2%-15% (實(shí)際應(yīng)用時，根據(jù)所需的取代度調(diào)整脫氧膽酸的用量)。所述葉酸衍生物為葉酸、亞葉酸、四氫葉酸或二氫葉酸，并且葉酸基的取代度范圍在 5% -15%。一種葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物的制備方法，步驟如下(1)0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)
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①稱取250mg的O-羧甲基殼聚糖溶解在25ml蒸餾水中，然后加入75ml甲醇稀釋；②將制備量的(35 ^Omg)脫氧膽酸溶解于IOml無水二甲基亞砜中，然后加入相當(dāng)于脫氧膽酸1. 5倍摩爾量的1-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亞胺鹽酸鹽和相當(dāng)于脫氧膽酸1. 5倍摩爾量的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下攪拌池以活化脫氧膽酸；③將步驟②中活化的脫氧膽酸加入步驟①中溶解有0-羧甲基殼聚糖的溶液中， 強(qiáng)烈攪拌至溶液呈光學(xué)透明，然后使混合液在室溫下反應(yīng)36h，得到反應(yīng)溶液；④將上述得到的反應(yīng)溶液在甲醇與水的混合溶液(體積比4 1)中透析(透析袋截留相對分子質(zhì)量14k) 3天，以除去未反應(yīng)的脫氧膽酸及反應(yīng)副產(chǎn)物，然后冷凍干燥，即得兩親性的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)物，即DOMC ；(2) 0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸與葉酸偶聯(lián)①將制備量的(0. 8 2. 4mol)的葉酸或葉酸衍生物溶解于IOml無水二甲基亞砜中，然后滴加3 5滴三乙胺，并加入相當(dāng)于葉酸2倍摩爾量的1-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亞胺鹽酸鹽和相當(dāng)于葉酸2倍摩爾量的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下連續(xù)攪拌2h， 制成葉酸活性酯溶液；②稱取250mg的O-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)物(DOMC)溶解于25ml蒸餾水中，然后加入25ml甲醇，攪拌至溶液光學(xué)透明；③將葉酸活性酯溶液滴加到步驟②得到的DOMC溶液中，在室溫下攪拌36h，使葉酸偶聯(lián)到殼聚糖分子上；然后滴加0. IM的氫氧化鈉溶液至pH值為9. 0，終止反應(yīng)，得反應(yīng)液；④將上述得到的反應(yīng)液在pH值為7. 4的磷酸緩沖鹽溶液以及蒸餾水中各透析3 天，冷凍干燥，得葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物，即D0MC-FA。所述0-羧甲基殼聚糖為殼聚糖衍生物，其脫乙酰度> 85%，羧甲基取代度 ^ 80%，分子量為 50，000-150，000。所述脫氧膽酸的取代度范圍在2% -15% (實(shí)際應(yīng)用時，根據(jù)所需的取代度調(diào)整脫氧膽酸的用量)。所述葉酸衍生物為葉酸、亞葉酸、四氫葉酸或二氫葉酸，并且葉酸基的取代度范圍在 5% -15%。所述葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物可以作為介導(dǎo)靶向殼聚糖載藥納米膠束，用于制備抗腫瘤藥物受體靶向納米膠束制劑。具體應(yīng)用時，制備方法可以為 稱取25mg葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物(DOMC-FA)，超聲分散于5ml去離子水中，然后加入5 20g的抗腫瘤藥物，或抗腫瘤藥物和抗腫瘤藥物增敏劑，在室溫下攪拌3小時；然后用探頭式超聲在90w功率下冰浴處理三次，每次兩分鐘，每次間隔2min，為了阻止溶液溫度升高，超聲脈沖開4s停2s ；然后將所得的混合物在3000r/min離心20min， 以除去游離的藥物和載體材料，接著過0. 45um的濾膜，即得抗腫瘤藥物受體靶向納米膠束制劑，溶液中，藥物濃度范圍在0. 02-4mg/ml ；4°C冰箱貯存或冷凍干燥。所述抗腫瘤藥物選擇紫杉醇、阿霉素、喜樹堿等；所述抗腫瘤藥物增敏劑選自維拉帕米、三苯氧胺、奎尼丁、環(huán)孢菌素A等。本發(fā)明的葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物，采用水溶性的0-羧甲基殼聚糖，將其進(jìn)行化學(xué)修飾的疏水改性，可得到兩親性的聚合物，可在水性介質(zhì)中自聚集形成納米膠束，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明制備的載體材料葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物具有良好的生物相容性、可降解性和無免疫原性，而且各種原料廉價(jià)易得，制備工藝簡單方便，條件溫和，是一種優(yōu)良的腫瘤靶向的載體材料。2、本發(fā)明制備的載藥納米膠束形態(tài)呈球形，粒徑較小，分布均勻，具有較高的載藥量和包封率，具有穩(wěn)定性好，緩釋性好等優(yōu)點(diǎn)。3、該載藥納米膠束通過葉酸-葉酸受體靶向進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，從而增加了藥物在腫瘤組織的分布，提高了療效，降低了毒副作用，達(dá)到了靶向治療腫瘤的目的。


圖1為載體材料DOMC-FA的1H-NMR結(jié)構(gòu)譜圖。圖2為載體材料DOMC-FA、DOMC分別對MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生的毒性結(jié)果。圖3MCF-7細(xì)胞對載羅丹明B的DOMC、DOMC-FA納米膠束溫育不同時間攝取的熒光電鏡照片，其中，A 游離羅丹明B ；B 載羅丹明B的DOMC納米膠束溶液；C 載羅丹明B的 DOMC-FA納米膠束溶液；D 載羅丹明B的DOMC-FA納米膠束溶液+ImM的游離葉酸。圖4為載紫杉醇DOMC-FA納米膠束粒徑分布圖。圖5為載紫杉醇DOMC-FA納米膠束透射電鏡照片。圖6為載紫杉醇、維拉帕米DOMC-FA納米膠束體外釋放的釋放百分率-時間曲線。圖7為載紫杉醇DOMC-FA、DOMC納米膠束分別對MCF-7細(xì)胞的毒性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1 葉酸修飾靶向殼聚糖載體材料(葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物)的合成(1)0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)稱取250mg的O-羧甲基殼聚糖溶解在25ml蒸餾水中，然后加入75ml甲醇稀釋； 將153mg脫氧膽酸溶解于IOml無水二甲基亞砜中，加入1 Umg 1_乙基_3_3_ 二甲基氨丙基碳化二亞胺鹽酸鹽(l-Ethyl-3- (3-Dimethylaminopropyl) carbodiiamideHydrochloride) 和68mgN-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)池；將活化的脫氧膽酸加入0-羧甲基殼聚糖的溶液中，強(qiáng)烈攪拌至溶液呈光學(xué)透明?；旌弦涸谑覝叵路磻?yīng)3 后，純化，冷凍干燥，得兩親性的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)物，即D0MC。紫外法測得脫氧膽酸的取代度為8. 9%。(2) 0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸與葉酸偶聯(lián)取M^iig葉酸溶解于IOml無水二甲基亞砜中，滴加5滴三乙胺，并加入2IOmgl-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亞胺鹽酸鹽和126mgN-羥基琥珀酰亞胺，室溫下連續(xù)攪拌2h， 制成葉酸活性酯溶液；稱取230mgD0MC溶解于25ml蒸餾水中，然后加25ml甲醇，攪拌至溶液光學(xué)透明。然后將葉酸活性酯溶液滴加到DOMC溶液中，在室溫下攪拌3 使葉酸偶聯(lián)到殼聚糖分子上。然后滴加0. IM的氫氧化鈉溶液至pH值為9.0終止反應(yīng)。分離純化，冷凍干燥，得葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物即D0MC-FA。紫外法側(cè)得葉酸的取代度為11.5%。所得葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物的1H-NMR結(jié)構(gòu)譜圖見圖1。 在DOMC-FA的1H-NMR譜圖中，0. 5-1. 2ppm處的吸收峰分別對應(yīng)于脫氧膽酸殘基上18、19和 21位的角甲基，6. 5-9. Oppm的峰歸屬于葉酸芳香環(huán)質(zhì)子的特征峰，說明脫氧膽酸和葉酸分別成功的偶聯(lián)到了羧甲基殼聚糖上。實(shí)施例2 載體材料細(xì)胞毒性檢測將對數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞5000cells/well/100y L，接種于96孔板，24 小時后分別給予膠束材料DOMC、DOMC-FA配置成的0. 01-lmg/mL的膠束溶液，置于37°C的培養(yǎng)箱中孵育72小時后，加入15 μ 1 5mg/ml MTT溶液，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4小時后將培養(yǎng)液替換成200 μ 1的DMS0，震蕩lOmin，用酶標(biāo)儀在570nm測定吸光度值。以不載體材料的腫瘤細(xì)胞為對照，計(jì)算細(xì)胞抑制率。載體材料DOMC_FA、DOMC分別對MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生的毒性結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，在 0. 01-lmg/mL范圍內(nèi)，DOMC、DOMC-FA的細(xì)胞存活率均大于85%，說明載體材料本身對細(xì)胞的毒性作用很小，僅僅是藥物的載體，對接下來的藥物敏感試驗(yàn)影響很小。實(shí)施例3 體外培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞對載羅丹明B納米膠束的攝取
制備包載羅丹明B的DOMC、DOMC-FA納米膠束。取對數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)M小時后，去掉培養(yǎng)液， 用冷的PBS清洗一次，再用載羅丹明B的DOMC、DOMC-FA納米膠束溶液Iml孵育0. 5h, 2h， 4h (羅丹明B濃度為5 μ Μ)，相同濃度游離羅丹明B作為對照，用PBS液三次，在熒光顯微鏡下觀察羅丹明B的攝取情況。結(jié)果見圖3。圖3為MCF-7細(xì)胞對載羅丹明B的D0MC、D0MC_FA 納米膠束溫育不同時間攝取的熒光電鏡照片，A 游離羅丹明B，B 載羅丹明B的DOMC納米膠束溶液，C 載羅丹明B的DOMC-FA納米膠束溶液，D 載羅丹明B的DOMC-FA納米膠束溶液+ImM的游離葉酸。結(jié)果表明，納米膠束在MCF-7腫瘤細(xì)胞中的攝取能力均隨時間的延長而增強(qiáng)。其中，葉酸修飾的納米膠束在細(xì)胞中的蓄積程度要高于非葉酸組，DOMC-FA納米膠束的攝取可被過量游離葉酸所抑制，說明葉酸修飾的納米膠束有良好的腫瘤細(xì)胞靶向作用，且納米膠束的攝取主要通過葉酸受體途徑。實(shí)施例4 制備載紫杉醇DOMC-FA納米膠束稱取25mg DOMC-FA聚合物超聲分散于5ml去離子水中，加入15mg紫杉醇，室溫下攪拌3小時。然后用探頭式超聲在90w功率下冰浴處理三次，每次兩分鐘，每次間隔2min， 超聲脈沖開4s停2s。將所得的混合物在3000r/min離心20min以除去游離的藥物和載體材料，接著自聚物溶液過0. 45um的濾膜，即得載紫杉醇DOMC-FA納米膠束溶液，4°C冰箱貯存或冷凍干燥。將制備的納米膠束溶液稀釋后，以ktasizer 3000 HS型激光粒度分布儀測定粒徑分布，測得平均粒徑為258. 2nm，多分散性系數(shù)為0. 132，如圖4所示；以H-7000型透射電子顯微鏡觀測其形態(tài)，如圖5所示。由圖4可知，所得載藥納米膠束溶液大小均一、形態(tài)圓整、成型性好、粒徑在250nm左右。實(shí)施例5 制備聯(lián)合載紫杉醇、維拉帕米的DOMC-FA納米膠束稱取25mg DOMC-FA聚合物超聲分散于5ml去離子水中，加入15mg紫杉醇、15mg維拉帕米，室溫下攪拌3小時。然后用探頭式超聲在90w功率下冰浴處理三次，每次兩分鐘， 超聲脈沖開4s停2s。將所得的混合物在3000r/min離心20min以除去游離的藥物和載體材料，接著自聚物溶液過0. 45um的濾膜，即得聯(lián)合載紫杉醇、維拉帕米DOMC-FA納米膠束溶液，4°C冰箱貯存。高效液相色譜法依次測得紫杉醇的包封率和載藥量分別為84. 43%和33. 61% ； 維拉帕米的包封率和載藥量分別為82.和33. 42%，說明該載藥納米膠束有疏水性內(nèi)核，具有很高的載藥量和包封率。載藥納米膠束4°C冰箱貯存3個月，其外觀形態(tài)、粒徑及其分布、包封率和載藥量幾乎沒有變化，說明該載藥納米膠束具有良好的穩(wěn)定性。實(shí)施例6 載紫杉醇、維拉帕米DOMC-FA納米膠束的體外釋放稱取25mg DOMC-FA聚合物超聲分散于5ml去離子水中，加入170. 8 μ g紫杉醇和 22. 73mg維拉帕米，室溫下攪拌3小時。然后用探頭式超聲在90w功率下冰浴處理三次，每次兩分鐘，超聲脈沖開4s停2So將所得的混合物在3000r/min離心20min以除去游離的藥物和載體材料，接著自聚物溶液過0. 45um的濾膜，即得聯(lián)合載紫杉醇、維拉帕米DOMC-FA納米膠束溶液，4°C冰箱貯存。采用反向動態(tài)透析法測定藥物的釋放度取Iml納米膠束溶液裝在截留分子量為 12，000的透析袋中，以含0. 5% Tween 80的PH為7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS) 150ml為釋放介質(zhì)，攪拌速度為lOOr/min，溫度為37士0. 5°C，在預(yù)定的時間取Iml透析介質(zhì)并加入等量新鮮的釋放介質(zhì)。取樣后進(jìn)樣20μ 1進(jìn)行HPLC測定，計(jì)算累積釋放百分率，如圖6所示。結(jié)果顯示，載藥納米膠束有良好的緩釋特性。實(shí)施例7 載紫杉醇DOMC-FA、DOMC納米膠束分別對MCF-7細(xì)胞抑制試驗(yàn)將對數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞5000CellS/Well/100l·! L，接種于96孔板，培養(yǎng)M小時后，將培養(yǎng)液替換為200 μ 1的葉酸偶聯(lián)載紫杉醇納米膠束(DOMC-FA/PTX)、無葉酸載紫杉醇納米膠束(D0MC/PTX)、游離紫杉醇藥物(Free PTX)三種制劑，置于37°C的培養(yǎng)箱中孵育72小時后，加入15 μ 1 5mg/ml MTT溶液，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4小時后將培養(yǎng)液替換成 200 μ 1的DMS0，震蕩lOmin，用酶標(biāo)儀在570nm測定吸光度值。以不加藥的腫瘤細(xì)胞為對照，計(jì)算細(xì)胞抑制率及IC5Q。紫杉醇制劑對MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生的毒性結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，葉酸偶聯(lián)載藥納米膠束有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，三種制劑的IC5tl值依次為14.01 士 0. 5nM、 11. 78士0. SnM和6. 61 士0. 9nM，抑制作用為葉酸偶聯(lián)膠束>無葉酸膠束>游離藥物。結(jié)果表明，葉酸偶聯(lián)載藥納米膠束有良好的腫瘤細(xì)胞靶向性和抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。
權(quán)利要求
1.一種葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物，其特征在于是以葉酸、0-羧甲基殼聚糖和脫氧膽酸為原料制備而成的主動靶向的納米膠束載體材料，其是通過以下制備方法得到的(1)0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)①稱取250mg的0-羧甲基殼聚糖溶解在25ml蒸餾水中，然后加入75ml甲醇稀釋；②將35 ^Omg脫氧膽酸溶解于IOml無水二甲基亞砜中，然后加入相當(dāng)于脫氧膽酸 1. 5倍摩爾量的1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺鹽酸鹽和相當(dāng)于脫氧膽酸1. 5倍摩爾量的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下攪拌池；③將步驟②中活化的脫氧膽酸加入步驟①中溶解有0-羧甲基殼聚糖的溶液中，強(qiáng)烈攪拌至溶液呈光學(xué)透明，然后使混合液在室溫下反應(yīng)36h，得到反應(yīng)溶液；④將上述得到的反應(yīng)溶液在甲醇與水的混合溶液中透析3天，然后冷凍干燥，即得兩親性的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)物；(2)0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸與葉酸偶聯(lián)①將0.8 2. 4mol葉酸或葉酸衍生物溶解于IOml無水二甲基亞砜中，然后滴加3 5滴三乙胺，并加入相當(dāng)于葉酸2倍摩爾量的1-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亞胺鹽酸鹽和相當(dāng)于葉酸2倍摩爾量的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下連續(xù)攪拌池，制成葉酸活性酯溶液；②稱取250mg的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)物溶解于25ml蒸餾水中，然后加入 25ml的甲醇，攪拌至溶液光學(xué)透明；③將葉酸活性酯溶液滴加到步驟②得到的DOMC溶液中，在室溫下攪拌36h，然后滴加氫氧化鈉溶液至PH值為9. 0，終止反應(yīng)，得反應(yīng)液；④將上述得到的反應(yīng)液在PH值為7.4的磷酸緩沖鹽溶液以及蒸餾水中各透析3天，冷凍干燥，得葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物，其特征在于所述0-羧甲基殼聚糖的脫乙酰度> 85%，羧甲基取代度> 80%，分子量為 50，000-150，000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物，其特征在于所述脫氧膽酸的取代度范圍在2% -15%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物，其特征在于所述葉酸衍生物為葉酸、亞葉酸、四氫葉酸或二氫葉酸，并且葉酸基的取代度范圍在 5% -15%。
5.權(quán)利要求1所述的葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物的制備方法，其特征在于，步驟如下(1)0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)①稱取250mg的0-羧甲基殼聚糖溶解在25ml蒸餾水中，然后加入75ml甲醇稀釋；②將35 ^Omg脫氧膽酸溶解于IOml無水二甲基亞砜中，然后加入相當(dāng)于脫氧膽酸 1. 5倍摩爾量的1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺鹽酸鹽和相當(dāng)于脫氧膽酸1. 5倍摩爾量的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下攪拌池；③將步驟②中活化的脫氧膽酸加入步驟①中溶解有0-羧甲基殼聚糖的溶液中，強(qiáng)烈攪拌至溶液呈光學(xué)透明，然后使混合液在室溫下反應(yīng)36h，得到反應(yīng)溶液；④將上述得到的反應(yīng)溶液在甲醇與水的混合溶液中透析3天，然后冷凍干燥，即得兩親性的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)物；(2) 0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸與葉酸偶聯(lián)①將0.8 2. 4mol葉酸或葉酸衍生物溶解于IOml無水二甲基亞砜中，然后滴加3 5滴三乙胺，并加入相當(dāng)于葉酸2倍摩爾量的1-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亞胺鹽酸鹽和相當(dāng)于葉酸2倍摩爾量的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下連續(xù)攪拌池，制成葉酸活性酯溶液；②稱取250mg的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸偶聯(lián)物溶解于25ml蒸餾水中，然后加入 25ml的甲醇，攪拌至溶液光學(xué)透明；③將葉酸活性酯溶液滴加到步驟②得到的DOMC溶液中，在室溫下攪拌36h，然后滴加氫氧化鈉溶液至PH值為9. 0，終止反應(yīng)，得反應(yīng)液；④將上述得到的反應(yīng)液在PH值為7.4的磷酸緩沖鹽溶液以及蒸餾水中各透析3天，冷凍干燥，得葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述0-羧甲基殼聚糖的脫乙酰度 ^85%,羧甲基取代度> 80%，分子量為50，000-150, 000 ；所述脫氧膽酸的取代度范圍在 2% -15%。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述葉酸衍生物為葉酸、亞葉酸、四氫葉酸或二氫葉酸，并且葉酸基的取代度范圍在5% -15%。
8.權(quán)利要求1所述的葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物作為介導(dǎo)靶向殼聚糖載藥納米膠束在制備抗腫瘤藥物受體靶向納米膠束制劑中的應(yīng)用。
9.一種制備抗腫瘤藥物受體靶向納米膠束制劑的方法，其特征在于，步驟為稱取 25mg葉酸修飾的0-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物，超聲分散于5ml去離子水中，然后加入5 20mg的抗腫瘤藥物，或抗腫瘤藥物和抗腫瘤藥物增敏劑，在室溫下攪拌3小時；然后用探頭式超聲在90w功率下冰浴處理三次，每次兩分鐘，每次間隔2min，超聲脈沖開如停 2s ；然后將所得的混合物在3000r/min離心20min，接著過0. 45um的濾膜，即得抗腫瘤藥物受體靶向納米膠束制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述抗腫瘤藥物為紫杉醇、阿霉素或喜樹堿；所述抗腫瘤藥物增敏劑為維拉帕米、三苯氧胺、奎尼丁或環(huán)孢菌素A。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種葉酸修飾的O-羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸復(fù)合物，是以葉酸、O-羧甲基殼聚糖和脫氧膽酸為原料制備而成的主動靶向的納米膠束載體材料，本發(fā)明采用O-羧甲基殼聚糖為載體材料，用脫氧膽酸進(jìn)行疏水性改造，然后用葉酸表面修飾，制成葉酸介導(dǎo)腫瘤組織靶向的聚合物膠束。以紫杉醇為模型藥物采用自組裝法制備載藥納米膠束，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，該載藥納米膠束載藥量和包封率高，具有緩釋性，通過葉酸受體途徑有效攝入腫瘤細(xì)胞，增加藥物在腫瘤組織的分布，從而提高療效、降低毒副作用，達(dá)到靶向治療的目的。該發(fā)明為難溶性抗腫瘤藥物提供了一種理想的新型藥物載體和制劑形式。
文檔編號A61K9/00GK102319436SQ201110236200
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者劉光璞, 劉悅, 張典瑞, 段存賢, 王飛虎, 賈樂姣, 陳瑀璇 申請人:山東大學(xué)