專(zhuān)利名稱(chēng)：阻止細(xì)胞dna合成抑制細(xì)胞增殖的多肽及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物工程領(lǐng)域，涉及一種阻止細(xì)胞DNA合成抑制細(xì)胞增殖的多肽及用途。
背景技術(shù)：
腫瘤是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病。臨床中主要應(yīng)用化療、放療及手術(shù)治療，這些方法形成了比較成熟的治療體系，取得了較好的效果。然而，由于目前常用的治療腫瘤藥物選擇性低，難以避免毒副作用強(qiáng)、正常細(xì)胞和腫瘤之間治療窗口小的缺點(diǎn)，要進(jìn)一步提高療效乃至達(dá)到治愈目的發(fā)展?jié)摿τ邢?，因此亟待研發(fā)新的有效治療方法。近來(lái)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的快速發(fā)展，為滿(mǎn)足這一社會(huì)需求提供了現(xiàn)實(shí)的可能性，其中，隨著細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Signaling transduction pathways)的闡明，發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的可用作治療腫瘤的藥靶。有一些已經(jīng)成功地應(yīng)用于臨床，取得了非常好的效果。比如在許多白血病細(xì)胞中表達(dá)BCR-ABL蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的蛋白激酶活性，在白血病的發(fā)生和發(fā)展中起重要的作用，通過(guò)研究BCR-ABL蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，人們?cè)O(shè)計(jì)和生產(chǎn)了多種能特異性抑制該蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的化合物，并成功開(kāi)發(fā)出包括格列衛(wèi)在內(nèi)的藥物應(yīng)用于治療白血病患者，格列衛(wèi)是目前治療多種白血病和其他腫瘤的首選藥物。細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)是由細(xì)胞內(nèi)外促進(jìn)生長(zhǎng)的因子經(jīng)過(guò)一系列蛋白參與傳遞到細(xì)胞核，引起細(xì)胞周期的許多調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)和功能變化而導(dǎo)致細(xì)胞分裂。在這些調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的蛋白中，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)擔(dān)當(dāng)著一個(gè)極其重要的角色，在細(xì)胞DNA復(fù)制過(guò)程中，DNA復(fù)制叉是DNA合成的關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合體，PCNA是DNA復(fù)制叉復(fù)合體的組成成分， PCNA可以結(jié)合DNA和多種蛋白質(zhì)，特別是PCNA結(jié)合DNA復(fù)制必需的DNA聚合酶，并使DNA 聚合酶能催化新生DNA鏈的合成，參與DNA復(fù)制過(guò)程。PCNA存在于所有分裂細(xì)胞中，由于 PCNA在細(xì)胞周期中的重要作用，阻斷PCNA在細(xì)胞周期中的生物功能是一個(gè)很有前途的開(kāi)發(fā)治療腫瘤和其他細(xì)胞增殖異常疾病新藥的途徑。至今為止，由于PCNA參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的機(jī)制還不清楚，目前沒(méi)有有效的方法或化合物能直接阻斷PCNA的生物功能，達(dá)到抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種阻止細(xì)胞DNA合成抑制細(xì)胞增殖的多肽及用途。本發(fā)明所述的多肽具備阻斷PCNA促進(jìn)細(xì)胞DNA合成和復(fù)制的生物學(xué)功能，從而抑制細(xì)胞分裂，該多肽也能有效地抑制多種腫瘤動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)模型中的腫瘤生長(zhǎng)。阻止細(xì)胞DNA合成抑制細(xì)胞增殖的多肽，其特征在于其氨基酸序列為甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天門(mén)冬氨酸-脯氨酸。所述阻止細(xì)胞DNA合成抑制細(xì)胞增殖的多肽在制備治療腫瘤及其他細(xì)胞生長(zhǎng)異常有關(guān)疾病的藥物的應(yīng)用。
所述阻止細(xì)胞DNA合成抑制細(xì)胞增殖的多肽相應(yīng)的核苷酸編碼序列。所述阻止細(xì)胞DNA合成抑制細(xì)胞增殖的多肽相應(yīng)的核苷酸編碼序列在制備治療人類(lèi)腫瘤及其他細(xì)胞生長(zhǎng)異常有關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。PTD-P15融合多肽，其特征在于其氨基酸序列為精氨酸-天門(mén)冬氨酸-亮氨酸-酪氨酸-天門(mén)冬氨酸-天門(mén)冬氨酸-天門(mén)冬氨酸-天門(mén)冬氨酸-賴(lài)氨酸-天門(mén)冬氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天門(mén)冬氨酸-脯氨酸。PTD-P15融合多肽在制備治療人類(lèi)腫瘤及其他細(xì)胞生長(zhǎng)異常有關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)多肽片段和PCNA的相互作用。該片段的序列為甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天門(mén)冬氨酸-脯氨酸；(見(jiàn)《氨基酸和核苷酸序列表》)， 在以后該多肽稱(chēng)為P15，同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)P15和PCNA結(jié)合后，阻止了 PCNA和DNA聚合酶的結(jié)合，而結(jié)合到PCNA蛋白質(zhì)的DNA聚合酶是細(xì)胞周期中的一個(gè)重要過(guò)程-DNA復(fù)制必需的。 根據(jù)這一結(jié)果，我們?cè)O(shè)想，如果在細(xì)胞中表達(dá)P15，這一多肽能抑制PCNA和DNA聚合酶的結(jié)合，從而抑制DNA聚合酶介導(dǎo)的DNA復(fù)制過(guò)程，達(dá)到阻止細(xì)胞分裂過(guò)程的目的。證明上述模型的關(guān)鍵之處在于把P15多肽導(dǎo)入細(xì)胞中，再觀(guān)察P15多肽對(duì)細(xì)胞分裂的影響。為達(dá)到這一目的，我們采用分子生物學(xué)的手段，制造一個(gè)DNA構(gòu)建體，這一構(gòu)建體編碼由P15和綠色熒光蛋白GFP組成的融合蛋白，再把這種構(gòu)建體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的人細(xì)胞中， 然后觀(guān)察表達(dá)P15-GFP融合蛋白的細(xì)胞中細(xì)胞周期的變化。另外，我們還通過(guò)人工合成的方式，生產(chǎn)一個(gè)由具有穿透細(xì)胞膜的多肽片段和P15多肽構(gòu)成的融合多肽PTD-P15 ；PTD的序列為精氨酸-天門(mén)冬氨酸-亮氨酸-酪氨酸-天門(mén)冬氨酸-天門(mén)冬氨酸-天門(mén)冬氨酸-天門(mén)冬氨酸-賴(lài)氨酸-天門(mén)冬氨酸-精氨酸。在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入PTD-P15，再觀(guān)察進(jìn)入細(xì)胞的P15多肽對(duì)細(xì)胞周期的影響。為了觀(guān)察P15多肽對(duì)動(dòng)物模型中腫瘤生長(zhǎng)的影響，我們通過(guò)小鼠尾靜脈注射PTD-P15融合多肽，觀(guān)察PTD-P15能否抑制動(dòng)物模型中腫瘤的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在幾種不同的具有生長(zhǎng)分裂能力的培養(yǎng)細(xì)胞系中表達(dá)P15多肽或加入PTD-P15，P15抑制了 PCNA結(jié)合DNA聚合酶的能力，導(dǎo)致這些細(xì)胞的DNA合成及其他幾個(gè)證明細(xì)胞生長(zhǎng)的觀(guān)察指標(biāo)都顯著降低，證明了 P15多肽具有抑制細(xì)胞增殖的能力；同時(shí)， 注射PTD-P15多肽能夠抑制細(xì)胞增殖和抑制動(dòng)物模型中腫瘤的生長(zhǎng)。與現(xiàn)有抑制細(xì)胞增殖的方法相比，采用本發(fā)明達(dá)到了以下效果①P15阻斷PCNA結(jié)合DNA聚合酶的能力，從而抑制了 DNA聚合酶促進(jìn)DNA復(fù)制的作用，導(dǎo)致細(xì)胞周期的停止，為治療腫瘤和其他細(xì)胞生長(zhǎng)異常疾病新藥的設(shè)計(jì)和篩選，提供了一種新的方法和途徑。同時(shí)，PTD-P15融合多肽能有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)，證明P15多肽在穿透細(xì)胞膜后仍具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)，也說(shuō)明具有穿膜功能的多肽或分子也可能用于幫助具有生物學(xué)活性P15穿透細(xì)胞膜。②P15多肽毒副作用低，抗原性弱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)P15多肽對(duì)細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯的影響，所以對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有明顯的殺傷作用。由PTD-P15融合多肽加入培養(yǎng)細(xì)胞和應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)，也沒(méi)有觀(guān)察到明顯的毒性。③在細(xì)胞中表達(dá)P15多肽和PTD-P15融合多肽能有效抑制多種人類(lèi)和鼠類(lèi)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)和體外培養(yǎng)系統(tǒng)中的生長(zhǎng)，證明P15在腫瘤等細(xì)胞生長(zhǎng)異常疾病的治療方面具有高效、廣譜等優(yōu)點(diǎn)。④PTD-P15多肽分子量小能化學(xué)合成，便于大規(guī)模直接應(yīng)用于臨床，同時(shí)也可用其他的方法(比如用質(zhì)粒及病毒載體)把P15多肽投人到細(xì)胞內(nèi)，以達(dá)到治療腫瘤和其他細(xì)胞增殖異常疾病的目的。


圖1 :PTD_N15阻斷PCNA結(jié)合DNA聚合酶。人直腸癌細(xì)胞Η ^9培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中， 分別加入對(duì)照多肽或不同量的PTD-P15多肽，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后，收集細(xì)胞，用免疫共沉淀法檢查細(xì)胞中PCNA蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA聚合酶的量，結(jié)果顯示加入PTD-P15能減少PCNA結(jié)合的 DNA聚合酶量，因?yàn)榻Y(jié)合于PCNA的DNA聚合酶的量和細(xì)胞DNA復(fù)制密切相關(guān)，所以，PTD-P15 能抑制細(xì)胞DNA復(fù)制速度。阻斷了 PCNA結(jié)合DNA聚合酶的能力，抑制了 DNA聚合酶促進(jìn) DNA復(fù)制的作用，阻斷了細(xì)胞的分裂。圖2a、圖2b、圖2c、圖2d 分別為PTD-P15抑制細(xì)胞周期。人直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，分別加入對(duì)照多肽或不同量的PTD-P15多肽，細(xì)胞培養(yǎng)M小時(shí)后，收集細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞在不同的細(xì)胞周期的百分比。結(jié)果顯示PTD-P15能增加(ViG1期細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)減少S期和&/M期細(xì)胞數(shù)量，表明PTD-P15抑制了細(xì)胞周期。
具體實(shí)施例方式下面借助具體實(shí)驗(yàn)及其數(shù)據(jù)結(jié)果對(duì)本發(fā)明進(jìn)行論證說(shuō)明，但應(yīng)該說(shuō)明的是，這些實(shí)施例子并不對(duì)本發(fā)明加以限制。P15多肽在下列實(shí)驗(yàn)中證明其抑制細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的有效性，包括但不限于下列實(shí)驗(yàn)。例1 在pEGFP質(zhì)粒中引入編碼P15多肽cDNA，DNA構(gòu)建體表達(dá)P15-GFP融合蛋白的檢測(cè)。pEGFP-N 1質(zhì)粒載體購(gòu)于美國(guó)Clontech公司(目錄號(hào)為6085-1)，質(zhì)粒包含編碼綠色熒光蛋白(GFP)的cDNA，用EcoRI-BamHI (購(gòu)于美國(guó)Promega公司，目錄號(hào)為R6011， R6021)酶切質(zhì)粒，酶切后的質(zhì)粒在瓊脂糖膠中分離、純化，用于以后的連接反應(yīng)。從膠中回收DNA片段的試劑盒來(lái)自德國(guó)Qiagen公司(產(chǎn)品目錄號(hào)為28704)。編碼P15多肽的cDNA來(lái)源于人工合成的雙鏈DNA，其序列為單鏈1 5’ TTTTGAATTCATGCCCTATTCGACAGAACTGATATTTTATATTGAAATGGATCCTGGATCC ；單鏈2 5’ TTTTGGATCCAGGATCCATTTCAATATAAAATATCTGTTCTGTCGAATAGGGCATGAATTC。兩個(gè)單鏈混合后，結(jié)合成雙鏈DNA，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后(純化用的試劑盒來(lái)自德國(guó) Qiagen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為28704)，用Ec0RI-BamHI酶切；再用瓊脂糖膠純化，然后和酶切純化后的載體PEGFP-Nl進(jìn)行連接反應(yīng)(連接試劑盒來(lái)自美國(guó)Promega公司，目錄號(hào)為 M1801)。轉(zhuǎn)化細(xì)菌后(感受態(tài)細(xì)菌來(lái)自美國(guó)!Iomega公司，目錄號(hào)為L(zhǎng)2001)，選出陽(yáng)性克隆，其cDNA序列的正確性通過(guò)核酸序列測(cè)定得到證實(shí)后，大規(guī)模純化制備質(zhì)粒(大規(guī)模純化試劑盒來(lái)自美國(guó)!Iomega公司，目錄號(hào)為A7270)，用于以后的實(shí)驗(yàn)。這種質(zhì)粒在真核細(xì)胞分別表達(dá)一個(gè)P15和GFP的融合蛋白，表達(dá)的P15連接在GFP的N未端，該融合蛋白稱(chēng)為 P15-GFP。轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于美國(guó)hvitr0gen(目錄號(hào)為11668)，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也按照生產(chǎn)廠(chǎng)家提供的使用說(shuō)明完成。C0S7細(xì)胞培養(yǎng)在質(zhì)量濃度為10%小牛血清DMEM營(yíng)養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染48 小時(shí)后，C0S7細(xì)胞用生理鹽水(PBQ洗兩次，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，用超聲波破壞DNA 后，加入適量的2-巰基乙醇和溴酚藍(lán)，于沸水中處理5分鐘，置于冰上保存，隨后上樣于質(zhì)量濃度為12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，此膜用抗GFP 抗體(購(gòu)于美國(guó)hvitrogen，目錄號(hào)為R970)檢測(cè)融合蛋白的產(chǎn)生，結(jié)果證實(shí)了 P15-GFP在細(xì)胞中的表達(dá)。例2 :P15多肽的表達(dá)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)。用NIH/3T3 (小鼠成纖維上皮細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)ATCC，目錄號(hào)為CRL_1658)和 MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞系，購(gòu)自美國(guó)ATCC，目錄號(hào)為HTB-22)檢測(cè)P15多肽對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。細(xì)胞在含質(zhì)量濃度為10%胎牛血清(FBQ的DMEM培養(yǎng)液，37°C、5% (體積)C02/95% (體積)空氣培養(yǎng)條件下培養(yǎng)于10厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿。用于實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒pEGFP-P15 (表達(dá)P15-GFP融合蛋白)；pEGFP_Nl作為對(duì)照質(zhì)粒。用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(購(gòu)自購(gòu)于美國(guó)Irwitrogen，目錄號(hào)為 11668)混合后，室溫放置15分鐘，加入培養(yǎng)于無(wú)血清DMEM營(yíng)養(yǎng)液的細(xì)胞中(細(xì)胞密度約為50% )在37°C中培養(yǎng)5小時(shí)，再加質(zhì)量濃度為10%胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。在熒光顯微鏡中，表達(dá)融合綠色熒光蛋白或單獨(dú)熒光蛋白的細(xì)胞很容易和不表達(dá)這些蛋白的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。另外，采用流式細(xì)胞儀，這些熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞也很容易分離純化出來(lái)。細(xì)胞周期等檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)志指標(biāo)被用來(lái)研究證實(shí)P15多肽對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，在這些實(shí)驗(yàn)中，僅僅只表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞作為對(duì)照組用。首先，我們用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3T3和MCF7細(xì)胞，兩天后，采用流式細(xì)胞儀把轉(zhuǎn)染了 DNA的GFP陽(yáng)性細(xì)胞挑選出來(lái)，分析這些細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明表達(dá)P15對(duì)細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯影響，而P15能抑制細(xì)胞周期進(jìn)入S 期，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期，其作用見(jiàn)下表(表1)。表1 :P15抑制細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期作用
權(quán)利要求
1.阻止細(xì)胞DNA合成抑制細(xì)胞增殖的多肽，其特征在于其氨基酸序列為甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天門(mén)冬氨酸-脯氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述阻止細(xì)胞DNA合成抑制細(xì)胞增殖的多肽在制備治療腫瘤及其他細(xì)胞生長(zhǎng)異常有關(guān)疾病的藥物的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述阻止細(xì)胞DNA合成抑制細(xì)胞增殖的多肽相應(yīng)的核苷酸編碼序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述阻止細(xì)胞DNA合成抑制細(xì)胞增殖的多肽相應(yīng)的核苷酸編碼序列在制備治療人類(lèi)腫瘤及其他細(xì)胞生長(zhǎng)異常有關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
5.PTD-P15融合多肽，其特征在于其氨基酸序列為精氨酸-天門(mén)冬氨酸-亮氨酸-酪氨酸-天門(mén)冬氨酸-天門(mén)冬氨酸-天門(mén)冬氨酸-天門(mén)冬氨酸-賴(lài)氨酸-天門(mén)冬氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天門(mén)冬氨酸-脯氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述PTD-P15融合多肽在制備治療人類(lèi)腫瘤及其他細(xì)胞生長(zhǎng)異常有關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種阻止細(xì)胞DNA合成抑制細(xì)胞增殖的多肽及用途，其氨基酸序列為甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天門(mén)冬氨酸-脯氨酸，在制備治療腫瘤及其他細(xì)胞生長(zhǎng)異常有關(guān)疾病的藥物的應(yīng)用。該多肽具有結(jié)合增殖細(xì)胞核抗原PCNA，并阻斷PCNA結(jié)合DNA聚合酶和促進(jìn)DNA合成的能力，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的生物效應(yīng)。應(yīng)用該多肽及衍生物，或通過(guò)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的cDNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該多肽，能達(dá)到有效抑制細(xì)胞增殖及腫瘤生長(zhǎng)的作用，在制備腫瘤及有關(guān)疾病的治療藥物、腫瘤藥物及診斷試劑的中具有獨(dú)特的使用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102321158SQ201110242869
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者夏獻(xiàn)民, 王桂華, 胡俊波 申請(qǐng)人:常州德健生物科技有限公司