專利名稱：雞貧血病毒vp1、vp2蛋白共表達(dá)的重組酵母工程菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的重組酵母基因工程菌株，特別涉及一種雞貧血病毒VP1、VP2蛋白共表達(dá)的重組酵母基因工程菌株，還涉及其構(gòu)建方法，進(jìn)一步涉及所表達(dá)的重組蛋白及其在研制新型抗雞貧血病毒的重組抗原疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞傳染性貧血是由雞貧血病毒(Chicken Anemia Virus, CAV)引起的，能夠?qū)е码u體免疫抑制的重要的病毒病，以雛雞再生障礙性貧血、全身淋巴組織萎縮、皮下和肌肉出血及伴隨免疫抑制為特征，雞傳染性貧血嚴(yán)重危害著世界的養(yǎng)雞業(yè)。隨著該病近年來呈現(xiàn)的新的變化，如發(fā)病日齡升高，感染發(fā)病后死亡率升高，混合感染和繼發(fā)感染嚴(yán)重等，使得對該病的防制越來越棘手，傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)難度大，病毒弱化困難，而且致弱的病毒很容易返強(qiáng)，使其很難在生產(chǎn)中安全應(yīng)用。CAV基因組編碼VP1、VP2和VP3三種蛋白，由于VPl和VP2蛋白在病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體方面具有重要作用，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，研究者們在探索利用基因工程技術(shù)來生產(chǎn)有效的CAV疫苗。人們利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)及桿狀病毒和釀酒酵母等真核表達(dá)系統(tǒng)對VP1、VP2基因均進(jìn)行了體外表達(dá)，Koch (1995)和Noteborn (1998)等人研究發(fā)現(xiàn)利用重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中共同表達(dá)VPl和VP2蛋白的細(xì)胞裂解物免疫雞群， 可以刺激機(jī)體產(chǎn)生具有中和活性的抗體，并且該抗體可以保護(hù)子代雞免受CAV感染，但可能由于生產(chǎn)成本的問題，一直未見到該疫苗商品化的報(bào)道。國內(nèi)的肖慶利等O001)在家蠶中共同表達(dá)了 VPl和VP2蛋白，并初步證實(shí)其可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體。劉常軍等Q003)構(gòu)建了一株含CAV VPU VP2基因的重組皰疹病毒，體內(nèi)外的試驗(yàn)結(jié)果均表明重組病毒具有很好的穩(wěn)定性，有望用來研制疫苗同時(shí)預(yù)防雞馬立克氏病和雞貧血病。Noteborn等人(1998) 在構(gòu)建的質(zhì)粒pCAV/E(Notebornet al. , 1991)的基礎(chǔ)上，在基因組的啟動子/增強(qiáng)子區(qū)域引入突變，構(gòu)建了突變的CAV基因組。轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)果顯示這些突變體可以獲得有感染性的病毒，但是對雞的T細(xì)胞的致病力明顯降低，尤其是當(dāng)啟動子/增強(qiáng)子區(qū)域12bp的插入片段發(fā)生突變時(shí)，這種變化更為明顯。這些突變的病毒在組織培養(yǎng)中是穩(wěn)定的，也能夠產(chǎn)生所需要的中和活性，因而可以作為疫苗株的候選株。國內(nèi)的張恒O003)構(gòu)建了 VP3基因缺失的CAV突變體，通過原核誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)證實(shí)突變可以抑制致病性蛋白VP3的生成，動物試驗(yàn)也證實(shí)這種突變體作為DNA疫苗來使用對雞群具有一定的免疫保護(hù)作用，因而可以作為未來DNA疫苗研制的一個方向。但是由于表達(dá)產(chǎn)物或者不能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，或者蛋白表達(dá)量低，要產(chǎn)生高滴度抗體需要多次加強(qiáng)免疫，因此，從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，不適合用于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。目前利用酵母表達(dá)系統(tǒng)開發(fā)雞傳染性貧血疫苗在國內(nèi)外還未有報(bào)道，但是在理論上是完全可行的。酵母菌的培養(yǎng)簡單、方便，所需培養(yǎng)基價(jià)格也較低，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過粗提即可應(yīng)用。因此，用酵母表達(dá)生產(chǎn)的CIA重組抗原疫苗將有很好的前景。本實(shí)驗(yàn)室人員林歡將CAV VPl和VP2基因分別在畢赤酵母中進(jìn)行了表達(dá)，但表達(dá)蛋白并未誘導(dǎo)良好的免疫反應(yīng)，這是因?yàn)閂Pl和VP2只有依靠表達(dá)過程中的相互作用才可形成誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的中和表位；根據(jù)以上基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)室人員陳紹平將林歡構(gòu)建的PPICTk-VPl和pPICTk-VP2載體共同轉(zhuǎn)化酵母宿主菌GS115，獲得了共表達(dá)CAV VPl和VP2的重組酵母菌株，表達(dá)蛋白免疫原性較好，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生CAV特異性抗體，但VPl蛋白在表達(dá)過程中只能獲得部分分泌。本研究將VPlN端進(jìn)行了缺失表達(dá)，通過體外構(gòu)建方法，獲得了同時(shí)包含多拷貝VPl和VP2基因的重組表達(dá)載體PA0815-VP1+VP2，轉(zhuǎn)化GS115宿主菌后經(jīng)表達(dá)驗(yàn)證，提高了 VPl的分泌表達(dá)量。本項(xiàng)目所利用的甲醇酵母具有表達(dá)產(chǎn)物活性高，生產(chǎn)規(guī)模容易放大，成本低廉等特點(diǎn)，使得利用該系統(tǒng)開發(fā)雞貧血疫苗具有很好應(yīng)用前景，而且在一個細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)VPI 與VP2有利于產(chǎn)生具有生物活性的VPl蛋白。本申請所應(yīng)用的疫苗具有上述價(jià)廉，生物活性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)榉乐萎?dāng)前流行的雞貧血提供確實(shí)、有效的工具和手段，并可為防治禽類免疫抑制病提供有效的參考和經(jīng)驗(yàn)。由于新型疫苗相對于傳統(tǒng)疫苗具有更低的成本，這將為該疫苗的應(yīng)用創(chuàng)造了一個很好的條件，投入應(yīng)用后既能有效的防止疫病造成的損失，同時(shí)也降低了養(yǎng)殖成本。該疫苗的研制將創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種可以共表達(dá)雞貧血病毒VP1、VP2蛋白的重組酵母工程菌株，其表達(dá)的VPl的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，表達(dá)的VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。優(yōu)選的，一種可以共表達(dá)雞貧血病毒VP 1、VP2蛋白的重組酵母工程菌株，其特征在于所述菌株為重組巴斯德畢赤酵母(Pichia.past0ris)GS115工程菌株，該菌株 (pA0815rCAVVPI-VP2/GS115)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC 5045， 保藏日期為2011年7月8日；本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供所述的重組酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟(I)VPl和VP2基因的擴(kuò)增以雞傳染性病毒株CAV/M9905株基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，從已構(gòu)建的插入CAV/M9905全基因的重組質(zhì)粒中分別擴(kuò)增出VP1、VP2基因，擴(kuò)增得到的VP1、VP2基因的核苷酸序列分別如SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4所示，擴(kuò)增片段分別插入pPICZ α B和 pPICZ α C載體中，分別擴(kuò)增得到融合有α -factor信號肽基因序列的VPl、VP2基因片段； 將擴(kuò)增出的基因片段插入畢赤酵母表達(dá)載體PA0815中，分別構(gòu)建成含有α -factor信號肽基因序列及VPl基因片段或含有α -factor信號肽基因序列及VP2基因片段的重組質(zhì)粒， 所述的CAV/M9905株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC 5016，保藏日期為2011年7月8日；(2)利用體外構(gòu)建多拷貝的方法，將CAV VPl和VP2基因共同構(gòu)建到同一個載體PA0815上，使其實(shí)現(xiàn)共載體表達(dá)，兩個基因在載體上各插入兩個拷貝，得到酵母重組載體 PA0815-2-VP1+VP2，載體構(gòu)建流程圖如圖1所示；(3)酵母轉(zhuǎn)化體的制備獲得的酵母重組載體pA0815-2-VPl+VP2轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的高產(chǎn)菌株，并將其馴化為工程菌株。其中所述引物序列如下CAVPlNd59F :5’ AGCCTGCAGGTAGGCTACCGAACCCCCAG3’CAVPlR :5’ AGAGAATTCCTCGAGTTAGGGCTGCGTCCCCCAG3’CAVP2F 5' AGCATCGATTATGCACGGGAACGGCGG 3’CAVP2R :5’ AGAGAATTCCTCGAGTTACACTATACGTACCGGGGC 3’其中，CAVPlNd59F、CAVPlR用于擴(kuò)增 VPl 基因片段；CAVP2F、CAVP2F 用于擴(kuò)增 VP2 基因片段；本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三是提供所述的重組酵母工程菌株在表達(dá)雞貧血病毒VP1、VP2蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之四是提供所述的重組酵母基因工程菌株表達(dá)的雞貧血病毒VPl、VP2重組蛋白，及其在制備預(yù)防雞傳染性貧血疫苗藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之五是提供一種雞傳染性貧血重組抗原疫苗，其特征在于包含有效劑量的所述的重組蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的重組抗原疫苗可用于預(yù)防雞傳染性貧血藥物的制備中。本發(fā)明相較于現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明利用甲醇酵母作為轉(zhuǎn)化受體菌，其表達(dá)產(chǎn)物活性高，生產(chǎn)規(guī)模容易放大， 成本低廉，而且在一個細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)VPl與VP2蛋白有利于產(chǎn)生具有生物活性的VPl蛋白；2,VPl和VP2兩個基因在pA0815載體上各插入兩個拷貝，再電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌GS115，從而達(dá)到提高基因拷貝數(shù)，進(jìn)而提高蛋白表達(dá)量的目的；3、通過對VPlN端進(jìn)行59個氨基酸的缺失表達(dá)，去除了 VPlN端精氨酸富集區(qū)域， 從而提高了 VPl的分泌表達(dá)量，而這一缺失經(jīng)驗(yàn)證并不會影響其中和表位的形成；4、對重組酵母菌株進(jìn)行小規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的高表達(dá)菌株，并將其馴化為工程菌株。對工程菌進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)，VPl表達(dá)量達(dá)到12g/L的水平；5、經(jīng)SDS-PAGE及flfestern-blot檢測證明表達(dá)的重組蛋白具有雞貧血病毒天然蛋白的生物學(xué)活性和抗原性。本實(shí)驗(yàn)將重組蛋白制成重組抗原疫苗，免疫SPF雞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該雞傳染性貧血重組抗原疫苗能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，使免疫雞獲得抵抗CAV攻擊的保護(hù)，并可有效阻止病毒在體內(nèi)的增殖。此疫苗的研制成功將會加速新型基因工程疫苗替代傳統(tǒng)疫苗的步伐，并將為雞傳染性貧血的防治帶來新的技術(shù)手段。本申請所應(yīng)用的疫苗具有上述價(jià)廉，生物活性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)榉乐飘?dāng)前流行的雞貧血提供確實(shí)、有效的工具和手段，并可為防制禽類免疫抑制病提供有效的參考和經(jīng)驗(yàn)。 由于新型疫苗相對于傳統(tǒng)疫苗具有更低的成本，這將為該疫苗的應(yīng)用創(chuàng)造了一個很好的條件，投入應(yīng)用后既能有效的防止疫病造成的損失，同時(shí)也降低了養(yǎng)殖成本。該疫苗的研制將創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。


圖1為本發(fā)明的雞貧血病毒VPl和VP2基因的載體構(gòu)建圖譜；圖 2 為 CAV VPl 基因 PCR 擴(kuò)增圖；1.陰性對照；2. Marker DL2000 ；3. CAVVPl 基因片段；圖 3 為 CAV VP2 基因 PCR 擴(kuò)增圖；1. Marker DL2000 ；2.陰性對照；3. CAVVP2 基因片段；圖4為重組質(zhì)粒pPIC9K-CAV VP1、pPIC9K_CAV VP2酶切鑒定結(jié)果；1 :pA0815-VP2 ；2 :pA0815_VPl ；3 =Marker Ikb DNA Ladder ；4 :MarkerDL2000 ；圖 5 重組質(zhì)粒 pA0815-CAVPl+VP2 和 pA0815_2_CAVPl+VP2 的酶切鑒定結(jié)果；1 PA0815-2-CAVP1+VP2的酶切鑒定結(jié)果；2 ρA0815-CAVPl+VP2的酶切鑒定結(jié)果；3、陰性對照；M Ikb Marker ；圖6為單克隆抗體與酵母表達(dá)的CAV VPUCAV VP2蛋白的^festern blot分析；1 預(yù)染 Marker ；2 :CAV VPl ；3 :CAV VP2圖7為真核表達(dá)蛋白與CAV VPl、CAV VP2單克隆抗血清的Dot-ELISA分析結(jié)果； 1 =CAV VPl ；2 =CAV VP2圖8為ELISA抗體檢測結(jié)果；圖9為免疫雞多克隆抗體與CAV感染的MDCC-MSB1細(xì)胞的IFA ；
A =CAV VPIPcAB ；B 陰性對照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1重組酵母工程菌株的構(gòu)建1材料和方法1. 1質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞PBluemCAV重組質(zhì)粒、抗CAV VPl單克隆抗體(MAb2F3)、抗 CAV VP2單克隆抗體(MAbEllC9)由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10F’由本實(shí)驗(yàn)室制作。畢赤酵母菌種GS 115和載體pA0815購自Invitrogen公司。CAV M9905病毒株由本實(shí)驗(yàn)室從13日齡發(fā)生貧血病肉仔雞組織中分離得到，該菌株(M990O現(xiàn)已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC 5016 ；pPICZ α B和 pPICZ α C載體購買自hvitrogen公司；HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG抗體、FITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗購買自Sigma公司。MDCC-MSB1細(xì)胞由哈爾濱獸醫(yī)研究所保藏。1. 2 試驗(yàn)試劑ExTaq 聚合酶，限制性內(nèi)切酶 BamHI、SaLI、EcoRI、NotI、SacI, Pyrobest DNA Polymerase, DNA Marker，T4DNA連接酶均購自大連寶生物工程有限公司，核酸凝膠回收試劑盒購自上海華舜公司。其他試劑為分析純。1. 3儀器設(shè)備低溫高速離心機(jī)CS_15RCentrifuge (BECKMAN)、PCR 儀(Takara PCR Thermal cycler)、2301 型電泳儀(KLB)、Imagemaster R VDS 凝膠掃描儀(Pharmacia Biotech)、 倒置顯微鏡(Nikon TS 100)、熒光顯微鏡(LEICAHC)、酶標(biāo)儀 Model-680 (BIO-RAD)、二氧化碳培養(yǎng)箱(FORMA SCIENTIFIC)、生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)、 BIO-RAD (Serial NO. 4IlBR 3336)電轉(zhuǎn)儀、空氣浴振蕩器HZQ-C (哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠)。1. 4CAV VPl基因及CAV VP2基因的克隆與表達(dá)1. 4. IVPl、VP2基因引物設(shè)計(jì)引物的設(shè)計(jì)與合成本實(shí)驗(yàn)室從13日齡發(fā)生貧血病肉仔雞組織中分離到雞貧血病病毒(CAV)，分離物能被已知CAV陽性血清所中和，并能利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出特異性寡聚核甘酸片段。分離物經(jīng)70°C 5min、50%氯仿15min處理后，可引起1日齡SPF雛雞發(fā)生雞傳染性貧血，因此認(rèn)為分離物是CAV (Chicken Anemia Virus)，并命名為CAV M9905，該菌株 (M9905)現(xiàn)已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為 CGMCC 5016 ；構(gòu)建插入CAV/M9905全基因的重組質(zhì)粒pBluemCAV，根據(jù)測定的CAV M9905的基因全序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增全長基因，所用方法具體參見文獻(xiàn)雞貧血病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位研究及感染性克隆構(gòu)建。王曉燕，2007，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文。1.4. 2VP1、VP2基因各片段的獲得根據(jù)已測定的CAV/M9905株的VPl和VP2基因序列，利用01igo6. 0分子生物學(xué)軟件分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，同時(shí)在引物中引入相應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)(PstlAhoI+EcoRI和 Clal/XhoI+EcoRI)，引物由上海英俊生物有限公司合成。CAVPlNd59F 5' AGCCTGCAGGTAGGCTACCGAACCCCCAG 3’CAVPlR 5' AGAGAATTCCTCGAGTTAGGGCTGCGTCCCCCAG 3’CAVP2F :5’ AGCATCGATTATGCACGGGAACGGCGG 3’CAVP2R :5’ AGAGAATTCCTCGAGTTACACTATACGTACCGGGGC 3’以重組質(zhì)粒pBluemCAV為模板，用VP1、VP2特異性引物擴(kuò)增VP1、VP2基因。反應(yīng)體系為水 70 μ LU0XPCR Buffer 10 μ L、dNTP Mixture 8 μ L、上、下游引物各 4 μ L、 Pyrobest DNA Polymerase 0. 5 μ L、模板4 μ L。VP1 反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性4min ；94°C 30s, 56 °C 45s, 72 °C 1. 5min,30 個循環(huán)；72°C 延伸 IOmin ；VP2 反應(yīng)條件為 94°C 預(yù)變性 4min ； 94°C 30s, 57°C 45s, 72°C 50s, 30個循環(huán)；72°C延伸lOmin，反應(yīng)結(jié)束后用華舜公司瓊脂糖凝膠試劑盒回收PCR產(chǎn)物，按說明書操作，擴(kuò)增得到的VP1、VP2基因的核苷酸序列分別如SEQ ID NO 2, SEQID NO 4 所示。1.4.3表達(dá)載體的構(gòu)建將PCR 回收的 CAV_VPlNd59 和 VP2 基因片段分別用 Pstl/Xhol 和 Clal/Xhol 酶切，分別插入pPICZaB和pPICZ α C載體中，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，獲得陽性克隆 pPICZ α B-VP lNd59 禾口 pPICZ α C-VP2。分別以 α FEcoRlU/CAVPIR 禾口 α FEcoRlU/CAVP2R 為上下游引物擴(kuò)增得到融合有α-factor信號肽的VPl和VP2基因。將回收的PCR產(chǎn)物與載體pA0815分別用EcoRI酶切，回收，用T4DNA連接酶于22°C連接過夜，然后轉(zhuǎn)化E. coli DH10F’感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，以EcoRI酶切及PCR進(jìn)行鑒定，并測序確證(北京英俊)，鑒定陽性克隆，獲得重組質(zhì)粒PA0815-VP1和pA0815-VP2。將CAVP2表達(dá)盒用BamHI和BglII 切下，連于PA0815-VP1載體上，構(gòu)建成為pA0815-VPl+VP2，再將CAVP1+VP2表達(dá)盒用BamHl 和BglII切下，連于pA0815-VPl+VP2載體上，構(gòu)建成為pA0815-2_VPl+VP2，此載體含有兩個拷貝的(VP1+VP2)表達(dá)盒。
1.4. 4重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定用限制性內(nèi)切酶EcoRI對重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815-VPl和pA0815_VP2進(jìn)行雙酶切。 反應(yīng)體系ddH20 14 μ L, IOXTango Buffer 2 μ L, EcoRI 0. 5 μ L, NotI 0.5yL，待檢質(zhì)粒 3μ L?；靹蚝笾?7°C水浴2小時(shí)，取10 μ L產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，紫外投射儀上觀察。 用限制性內(nèi)切酶BamHl和BglII對重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815_VPl+VP2和pA0815_2_VPl+VP2進(jìn)行雙酶切鑒定。反應(yīng)體系ddH20 13yL, IOXTango Buffer 2 μ L，限制性內(nèi)切酶各1 μ L， 待檢質(zhì)粒3 μ L?；靹蚝笾?7°C水浴2小時(shí)，取10 μ L產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖電泳，紫外投射儀上觀察。1. 4. 5酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化用限制性內(nèi)切酶MlI對制備的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，酚-氯仿-異戊醇抽提，乙醇沉淀回收后，與畢赤酵母GS 115感受態(tài)細(xì)胞混合，用BIO-RADGerialNO. 411BR 3336)電轉(zhuǎn)儀在參數(shù)為2. 0kV、25yF、200Q條件下進(jìn)行電擊，立即加入Iml預(yù)冷的lmol/L 山梨醇，溫浴后將內(nèi)容物涂布于含ΙΟΟμ g/ml G418抗性的YPDS平板，30°C培養(yǎng)3_7d。1.4.6重組質(zhì)粒的真核表達(dá)將PCR鑒定陽性的酵母轉(zhuǎn)化子接種于40ml BMGY培養(yǎng)基中，30°C 300rpm培養(yǎng)至 OD600為2-6時(shí)，1500g離心5min收集菌體，換IOml BMMY培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4d，每隔24h取樣并同時(shí)加入0.5%的甲醇。1.4.7重組酵母菌株的PCR篩選1. 4. 7. 1重組酵母菌PCR鑒定引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)目的基因插入兩側(cè)的表達(dá)載體核苷酸序列設(shè)計(jì)一對特異引物，并由上海博亞生物技術(shù)公司合成。引物序列為5， AOXl 弓丨物5， -gactggttccaattgagaagc-3，3， AOXl 弓丨物5， -gcaaatggcattctgacatcc-3，1.4. 7.2重組酵母基因組DNA的提取取少量轉(zhuǎn)化菌單個菌落培養(yǎng)物置Ep管中，加100 μ L滅菌水，100°C煮沸IOmin以消解酵母菌細(xì)胞壁，液氮冰凍30min，100°C煮沸l(wèi)Omin，12000r/min離心lOmin，取上清液， 即為重組酵母基因組DNA。1. 4. 7. 3PCR 擴(kuò)增鑒定以重組酵母基因組DNA為模板，用特異引物對整合到巴斯德畢赤酵母X-33染色體DNA中的PoIL-2成熟蛋白基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5yL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳觀察。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系10XPCR Buffer 5. O μ L、25mmol/LMgCl2 3. O μ L、5，A0X1 引物(20pmol/y L)0. 5μ L、3，AOXl 引物(20pmol/μ L) 0· 5 μ L、Tap 酶 0· 5 μ L、dNTP (lOmmol/ Ι.Ομ L、基因組DNA模板5. O μ L，以滅菌水補(bǔ)體積至50 μ L。擴(kuò)增反應(yīng)條件94°C 5min ； 94°C 0. 5min、55°C 0. 5min、72°C 2min，30 個循環(huán)；72°C IOmin01.4.8重組蛋白的Dot-ELISA檢測取目的蛋白2yL在NC膜上，膜干燥后，用5%脫脂乳室溫封閉lh，加入1 500 稀釋的CAV VPl及CAV VP2的單克隆抗血清，以雞的陰性血清做對照，室溫作用lh，PBST洗 4次，5min/次，加入1 5000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG為二抗，室溫作用45min，PBST 洗4次，5min/次，最后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。
1.4. 9重組蛋白的免疫印跡試驗(yàn)?zāi)康牡鞍纂娪竞?，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC)上，將膜封閉，加入1 500稀釋的CAV VPl單克隆抗體，輕輕搖動混勻，于37°C作用Ih后，洗滌NC膜，將洗滌后的膜置于適量 1 5000稀釋的HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG為二抗液中，室溫作用37°C作用45min，洗滌NC膜3 次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。2、結(jié)果2. ICAV VPl、CAV VP2 基因的擴(kuò)增以 pBluemCAV 為模板，分別用兩對引物 CAV VPlNd59F、CAV VPlR 和 CAV VP2F.CAV VP2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增后獲得與預(yù)期大小一致的1173bp和650bp的DNA條帶，結(jié)果如圖2、3所
7J\ ο2. 2重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定2. 2. 1重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815-VPl和pA0815_VP2經(jīng)EcoRI酶切鑒定，分別得到1446bp和 924bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，結(jié)果如圖4所示。2. 2. 2重組表達(dá)質(zhì)粒的序列測定與分析經(jīng)測序分析，重組表達(dá)質(zhì)粒的目的基因序列與CAV/M9905VP1、VP2基因序列完全一致，已正確地插入表達(dá)載體的讀碼框架中。以上PCR鑒定、酶切鑒定及序列分析結(jié)果表明，已成功構(gòu)建了基因pA0815-VPl、pA0815-VP2的重組酵母表達(dá)質(zhì)粒。2. 2. 3pA0815-2-VPl+VP2重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒pA0815-CAVPl+VP2 和 pA0815_2_CAVPl+VP2 的酶切鑒定結(jié)果；1 PA0815-2-CAVP1+VP2 的酶切鑒定結(jié)果8764bp 片段為 2X (CAVP1+VP2)表達(dá)盒；2 PA0815-CAVP1+VP2的酶切鑒定結(jié)果4382bp片段為1 X (CAVP1+VP2)表達(dá)盒；MOObp和 4000bp片段為載體自身酶切片段。3、陰性對照；M=Ikb Marker(TAKARA)。圖5所示。2. 3重組酵母菌株的PCR篩選 以His+轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板，用酵母5，AOXl和3，AOXl通用引物PCR驗(yàn)證目的DNA與酵母基因組整合情況，結(jié)果有11個轉(zhuǎn)化子能擴(kuò)增出ISOObp和IlOObp的片段， 說明重組菌株中整合了 VPl基因片段和VP2基因片段。2. 4重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定2. 4. 1 表達(dá)產(chǎn)物的 Western blot 分析以制備的MAbs為一抗，對表達(dá)的CAV VPl和CAV VP2蛋白進(jìn)行^festernblot (如圖6所示)分析，結(jié)果顯示MAbs均可以與酵母表達(dá)的CAV VPl和VP2蛋白發(fā)生反應(yīng)，與VP 1和VP2相互作用形成的蛋白也有良好的反應(yīng)。2. 4. 2表達(dá)產(chǎn)物的Dot-ELISA分析表達(dá)蛋白純化后進(jìn)行Dot-ELISA檢測，CAV VPU CAV VP2蛋白均可以被CAV單克隆抗體(抗CAV VPl單克隆抗體(MAb 2F3)、抗CAV VP2單克隆抗體(MAbEl 1C9))所識別， 而與陰性雞血清不發(fā)生反應(yīng)。表明所表達(dá)的融合蛋白具有免疫反應(yīng)活性(如圖7所示)，表達(dá)的VP 1的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，VP2蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO 3所示。實(shí)施例2重組蛋白免疫原性的檢測1重組蛋白的表達(dá)量
取破碎后的培養(yǎng)物，首先用紫外分光光度計(jì)測定蛋白濃度，濃度為48g/L，然后進(jìn)行SDS-PAGE，用薄層凝膠掃描測定目的蛋白占總蛋白的百分含量為25%，因此目的蛋白的表達(dá)量為12g/L。1. 1免疫動物雞傳染性貧血重組抗原疫苗的制備將發(fā)酵菌體蛋白按VP 1含量用PBS(PH7. 4) 分別稀釋至 200 μ g/0. 6πι1、400μ g/0. 6ml、2000 μ g/0. 6ml，與等體積法國佐劑((ISA50V2) 購自SEPPIC公司)乳化。取1周齡SPF雞50只，分5組，每組10只。1、2、3組為表達(dá)蛋白免疫組1組免疫劑量為50 μ g/0. 3ml/只，2組免疫劑量為100 μ g/0. 3ml/只，3組免疫劑量為500 μ g/0. 3ml/ 只；4組為常規(guī)滅活疫苗免疫組，常規(guī)滅活疫苗按照以下方法制備得到以IOOLD5tl劑量對一日齡SPF雛雞進(jìn)行CAV攻毒，攻毒后11天進(jìn)行剖殺，采取肝臟，對其進(jìn)行研磨，以PBS為稀釋液，將其稀釋成10%懸乳液，加入0.2%甲醛37°C滅活48h，然后無菌條件下以白油佐劑進(jìn)行乳化，制備成滅活疫苗，免疫劑量為0. 3ml/只；免疫途徑均為胸肌注射法；5組為非免疫對照組。各組免疫后定期采血，用ELISA和間接免疫熒光檢測抗體，并于免疫后14天各組取5只以IOOOTCID5ci劑量攻擊CAV/M9905病毒，攻毒后觀察7天，剖殺，采集肝臟，提取 DNA，PCR方法檢測病毒。各組余下的5只仍每7天定期采血至56天，檢測抗體。試驗(yàn)在負(fù)壓隔離器(澳大利亞進(jìn)口)中進(jìn)行。1. 2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)用0. lmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9. 6)將純化的CAV全病毒以100 μ L/孔包被ELISA 板，4°C過夜，用5%脫脂乳37°C封閉lh。然后用？851^85含0.05%1^拙-20)洗3遍，加入1 100稀釋的待檢血清，37°C作用lh，PBST洗3遍，加入1 5000稀釋的HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG抗體，37°C作用lh，PBST洗4遍，加入OPD顯色液，室溫、避光顯色I(xiàn)OminJOyL/ 孔，2mol/L H2SO4終止，于490nm測定吸光值。1.3 間接免疫熒光檢測(Immunofluorence assay IFA)取ImL CAV 感染的MDCC-MSB1 細(xì)胞懸液于 1. 5mL EP 管內(nèi)，1000r/min，離心 lOmin， 沉淀細(xì)胞，將沉淀的細(xì)胞用PH 7.4PBS洗兩遍。再用少量PBS將細(xì)胞均勻懸浮，然后涂于M 孔板中央，待細(xì)胞干燥后，用冰冷的95%乙醇室溫固定lOmin。固定后，倒掉乙醇，用PBS洗 3遍，待細(xì)胞稍稍干燥后，加入1 50、1 100稀釋的待檢血清，37°C孵育lh，用PBS洗3 遍，每次5min。稍稍干燥后，加入1 100稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗，37°C，30min，用 PBS洗5遍，每次5min，用甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。2 結(jié)果2. 1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)疫苗免疫后7天即可檢測到抗體陽性樣品，免疫后14天抗體陽性率達(dá)到90%，免疫后21天達(dá)到100%，至免疫后56天抗體陽性率仍維持在100% (如圖8所示)。2. 2 間接免疫熒光檢測(Immunofluorence assay I FA)將試驗(yàn)中制備的血清分別用CAV/M9905株感染48h以后的MDCC-MSB1細(xì)胞涂片進(jìn)行IFA檢測，同時(shí)用非免疫雞的血清做陰性對照，免疫重組蛋白后多抗血清對感染細(xì)胞呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，說明其可以與天然的病毒發(fā)生反應(yīng)；陰性血清對照對感染細(xì)胞均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。結(jié)果見圖9。
2. 3病毒檢測結(jié)果免疫后14天，各組雞進(jìn)行病毒感染，7天后剖殺，檢測病毒，免疫組除50 μ g/只劑量組有1只雞檢測到有病毒感染外，其他雞均未檢測到病毒存在。非免疫對照組5只雞均檢測到病毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該雞傳染性貧血重組抗原疫苗能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，使免疫雞獲得抗CAV攻擊的保護(hù)，并可有效阻止病毒在體內(nèi)的增殖。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，對本發(fā)明而言僅是說明性的，而非限制性的； 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種雞貧血病毒VP1、VP2蛋白共表達(dá)的重組酵母工程菌株，其特征在于表達(dá)的VPl 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，表達(dá)的VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示 ο
2.如權(quán)利要求1所述的重組酵母工程菌株，其特征在于所述菌株為重組巴斯德畢赤酵母(Pichia.pastoris)GS115工程菌株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC 5045。
3.構(gòu)建權(quán)利要求2所述的重組酵母工程菌株的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)VP1、VP2基因的擴(kuò)增以雞傳染性病毒株CAV/M9905株基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，從已構(gòu)建的插入 CAV/M9905全基因的重組質(zhì)粒中分別擴(kuò)增出VPl、VP2基因，擴(kuò)增得到的VPl、VP2基因的核苷酸序列分別如SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4所示，擴(kuò)增片段分別插入pPICZ α B和pPICZ α C 載體中，分別擴(kuò)增得到融合有α "factor信號肽基因序列的VP1、VP2基因片段；將擴(kuò)增出的基因片段插入畢赤酵母表達(dá)載體PA0815中，分別構(gòu)建成含有α-factor信號肽基因序列及VPl基因片段或含有α -factor信號肽基因序列及VP2基因片段的重組質(zhì)粒，所述的 CAV/M9905株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為 CGMCC 5016 ；(2)利用體外構(gòu)建多拷貝的方法，將CAVVP1、VP2基因共同構(gòu)建到同一個載體 PA0815上，使其實(shí)現(xiàn)共載體表達(dá)，兩個基因在載體上各插入兩個拷貝，得到酵母重組載體 PA0815-2-VP1+VP2 ；(3)酵母轉(zhuǎn)化體的制備獲得的酵母重組載體PA0815-2-VP1+VP2轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的高產(chǎn)菌株，并將其馴化為工程菌株。
4.權(quán)利要求1或2所述的重組酵母工程菌株在表達(dá)雞貧血病毒VPl、VP2蛋白中的應(yīng)用。
5.由權(quán)利要求1或2所述的重組酵母基因工程菌株表達(dá)的雞貧血病毒VPl、VP2重組蛋白。
6.權(quán)利要求5所述的重組蛋白在制備預(yù)防雞傳染性貧血疫苗藥物中的應(yīng)用。
7.一種預(yù)防雞傳染性貧血的重組抗原疫苗，其特征在于包含有效劑量的權(quán)利要求5所述的重組蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。
8.權(quán)利要求7所述的重組抗原疫苗在制備預(yù)防雞傳染性貧血藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種共表達(dá)雞貧血病毒VP1、VP2蛋白的重組酵母工程菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明的重組酵母工程菌株，其菌種保藏編號為CGMCC No.5045。對工程菌進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)，VP1表達(dá)量達(dá)到12g/L的水平。經(jīng)SDS-PAGE及Western-blot檢測證明表達(dá)的重組蛋白具有雞貧血病毒天然蛋白的生物學(xué)活性和抗原性。將重組蛋白制成重組抗原疫苗，免疫SPF雞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該雞傳染性貧血重組抗原疫苗能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，使免疫雞獲得抗CAV攻擊的保護(hù)，并可有效阻止病毒在體內(nèi)的增殖。
文檔編號A61K39/12GK102311928SQ20111024539
公開日2012年1月11日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者王永強(qiáng), 王笑梅, 祁小樂, 秦立廷, 高宏雷, 高玉龍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所