專利名稱：分枝桿菌噬菌體d29顆粒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分枝桿菌噬菌體D29顆粒及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病一直是對人類健康威脅很大的人畜共患傳染病，特別是近二、三十年來由于人口流動、廣泛耐藥和多重耐藥結(jié)核菌(MDR-TB)傳播、艾滋病等因素影響，結(jié)核病疫情在全球范圍內(nèi)回升。世界衛(wèi)生組織(WHO)曾于1993年宣布全球結(jié)核病緊急狀態(tài)；1998年又重申遏制結(jié)核行動刻不容緩，并把每年的3月24日定為世界防治結(jié)核病日。WHO最新數(shù)據(jù)表明2009年新增結(jié)核病人940萬人，死于結(jié)核的病人達170萬人；2008年新增MDR-TB 病人44萬人，死于MDR-TB的則達15萬人。我國是全球22個結(jié)核病高負擔(dān)的國家之一，并屬于高耐藥國家，結(jié)核病人數(shù)位居全球第二，多重耐藥結(jié)核病占13.4%。但到目前為止，還沒有理想的新型抗多重耐藥結(jié)核的藥物可用于臨床。噬菌體(Bacteriophage，phage)是一類細菌病毒，對一些細菌具有高度的專一性，當(dāng)噬菌體侵染這些細菌時，可在細菌中繁殖并殺死細菌，而它對動植物沒有毒性。因此， 噬菌體以其特有的自然特征有望成為較好的抗菌藥物。20世紀前葉，噬菌體曾經(jīng)作為治療、 預(yù)防細菌感染的有效工具，但隨著抗生素的發(fā)明與廣泛應(yīng)用，許多國家對此未進行深入研究。然而，面對耐藥菌感染比例的不斷增長，有人預(yù)言噬菌體將成為近十年生物制藥領(lǐng)域的一大研究熱點。噬菌體已經(jīng)成功地應(yīng)用于多種動物細菌感染的治療，如禽類、魚類、犢牛、羔羊等。 對預(yù)防和治療人的細菌性感染方面也有很多臨床研究。Weber-Dabrowska等對20例腫瘤患者和27例細菌感染者使用噬菌體治療，發(fā)現(xiàn)所有患者的化膿、創(chuàng)傷、肺炎等并發(fā)現(xiàn)象都很快消失。Bretscher等提出使用噬菌體治療艾滋病的再度感染，可減緩艾滋病病毒耐多藥進化的速度。分枝桿菌噬菌體D29是一種寄生于分枝桿菌的DNA病毒，由蛋白質(zhì)外殼組成衣殼， 內(nèi)為DNA，沒有獨立的代謝體系，必須與宿主菌結(jié)合進入胞內(nèi)，利用宿主菌的代謝酶系進行復(fù)制，最終裂解細菌，釋放出子代噬菌體。分枝桿菌噬菌體D29的病毒顆粒呈類圓形，大小在75 150nm之間，具有廣譜宿主，包括恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌等。宿主在恥垢分枝桿菌中的增殖周期為90 180min，在結(jié)核分枝桿菌中的增殖周期為3 6h以上。分枝桿菌噬菌體D29已經(jīng)普遍應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的快速檢測及結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測。分枝桿菌噬菌體D29用于抗結(jié)核治療的研究中，體外實驗發(fā)現(xiàn)分枝桿菌噬菌體D29可以減少體外生長的巨噬細胞內(nèi)的恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌的活菌數(shù)量，具有殺滅巨噬細胞內(nèi)宿主菌的能力，具有治療結(jié)核病的可能；動物試驗也證明分枝桿菌噬菌體D29可減輕結(jié)核病豚鼠的臟器病變程度和臟器荷菌量，具有與利福平接近，甚至更好的療效，且對豚鼠沒有副作用，有希望作為新型抗結(jié)核藥物的開發(fā)對象。分枝桿菌噬菌體D29用于結(jié)核病治療有其潛在優(yōu)勢。噬菌體具有高度的宿主特異性，只針對致病菌，不會影響到其他的菌群，因此具有無副作用的優(yōu)點，同時減少了隨之所帶來的耐藥性問題；噬菌體可以隨宿主菌的增殖而增殖，并在細菌感染的整個過程中發(fā)揮作用，而不像抗生素那樣隨著時間的推移療效逐漸降低。在分枝桿菌噬菌體D29用于結(jié)核病治療的應(yīng)用中，重點要解決的問題是如何到達作用部位以及以何種形式有效地到達作用部位。分枝桿菌噬菌體D29作為一種微生物，培養(yǎng)獲得的產(chǎn)物一般都是包含培養(yǎng)介質(zhì)的液體。相對于固體而言，液體在儲存、運輸和使用時存在不方便以及穩(wěn)定性等問題，因此微生物產(chǎn)品欲制成藥物的話，固體化有其優(yōu)勢。微生物制劑采用冷凍干燥對于固化過程中維持其穩(wěn)定性有利，所以在微生物制劑的保存中通常都采用冷凍干燥法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分枝桿菌噬菌體D29顆粒及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的分枝桿菌噬菌體D29顆粒，它的活性成分由分枝桿菌噬菌體D29和保護劑(兼作稀釋劑)組成；所述保護劑為糖和/或蛋白和/或氨基酸和/或醇。所述糖可為蔗糖、乳糖和海藻糖中的至少一種。所述蛋白可為奶粉和牛血清白蛋白中的至少一種。所述氨基酸可為亮氨酸。所述醇可為甘露醇。所述保護劑可為一種糖、也可為多種糖的混合物。所述糖可為蔗糖、乳糖和海藻糖中的至少一種。所述保護劑還可為蛋白，如奶粉(如脫脂奶粉)或牛血清白蛋白。所述保護劑還可為糖和蛋白的混合物，如乳糖和奶粉的混合物，或乳糖和牛血清白蛋白的混合物。 所述保護劑還可為糖和氨基酸的混合物，如乳糖和亮氨酸的混合物。所述保護劑還可為糖和醇的混合物，如乳糖和甘露醇的混合物。所述保護劑優(yōu)選為如下⑴至(9)中的任意一種⑴蔗糖；(2)乳糖；(3)海藻糖；⑷乳糖和海藻糖；(5)乳糖和甘露醇；(6)奶粉；(7)乳糖和奶粉；⑶乳糖和牛血清白蛋白；(9)乳糖和亮氨酸。所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒具體可由所述分枝桿菌噬菌體D29、所述保護劑和水組成。所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒中，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量可為 1 X 102PFU/g至1 X 109PFU/g,水分的質(zhì)量百分含量可為10 %以下；所述分枝桿菌噬菌體D29 顆粒的粒度中位值D50可為20 μ m以下。所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒中，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量優(yōu)選為 lX104PFU/g至7X10TPFU/g，水分的質(zhì)量百分含量最優(yōu)選為至9% ；所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒的粒度中位值D50優(yōu)選為5. 00 μ m至18. 00 μ m。所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒中，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量最優(yōu)選為 1.99X 104PFU/g至6. 66X 107PFU/g，水分的質(zhì)量百分含量最優(yōu)選為1.23%至8. 30% ；所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒的粒度中位值D50最優(yōu)選為5. 60 μ m至17. 31 μ m。所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒中，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量可為(2. 72士0. 73) X 104PFU/g 至(3. 10士 1. 12) X 104PFU/g，(3. 10士 1. 12) X IO4PFU/ g 至(1. 29 士 0. 16) X 106PFU/g，(1. 29 士0. 16) X 106PFU/g 至(1. 81 士0. 19) X IO6PFU/ g, (1. 81+0. 19) X 106PFU/g 至(1. 86 + 0. 10) X 106PFU/g, (1. 86 + 0. 10) X IO6PFU/ g 至(2. 06 士 0. 23) X 106PFU/g，(2. 06 士0. 23) X 106PFU/g 至(2. 41 士0. 12) X IO6PFU/g, (2. 41 士0. 12) X IO6PFU/g 至(4. 49 士0. 99) X 106PFU/g，(4. 49 士0. 99) X 106PFU/g 至 (6. 53 士 0. 13) X106PFU/g，或(6. 53 士 0. 13) X 106PFU/g 至(5. 14 士 1. 52) X 107PFU/g。所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒中，水分的質(zhì)量百分含量可為(1.34士0. 11) %至 (2. 11 士0. 08) (2. 11 士0. 08) %M (2. 30士0. 57) (2. 30士0. 57) %M (2. 50士0. 20)
(2. 50士0. 20) %M (2. 74士0. 04) (2. 74士0. 04) %M (2. 84士0. 57) (2. 84士0. 57) % 至(2. 88 士 0.04) %、(2. 88 士 0.04) % 至(3. 27 士 0. 35) %、(3. 27 士 0. 35) % 至 (5. 08 士 0. 22) %、或(5. 08 士 0. 22) %至(8. 08 士 0. 27) %。所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒的粒度中位值D50可為(5. 65 士 0. 05) μ m 至(7. 49 + 0. 59) μ m、(7. 49 + 0. 59) μ m 至(7. 91 + 0. 39) μ m、(7. 91 + 0. 39) μ m 至(8. 14 + 0. 17) μ m、(8. 14 + 0. 17) μ m 至(8. 69 + 0. 94) μ m、(8. 69 + 0. 94) μ m 至(8. 94 + 0. 29) μ m、(8. 94 + 0. 29) μ m 至(9. 34 + 0. 40) μ m、(9. 34 + 0. 40) μ m 至 (10. 94 士 0. 45) μ m、(10. 94 士 0. 45) μ m 至(10. 56 士 0. 65) μ m、或(10. 56 士 0. 65) μ m 全 (15. 66 士 1. 65) μ mo本發(fā)明還保護所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒的制備方法，是將所述分枝桿菌噬菌體D29與所述保護劑作為原料一起進行固體化(固化)，得到分枝桿菌噬菌體D29顆粒。所述保護劑為乳糖和海藻糖時，所述乳糖和所述海藻糖作為原料的質(zhì)量比優(yōu)選為 1 1。所述保護劑為乳糖和奶粉時，所述乳糖和所述奶粉作為原料的質(zhì)量比優(yōu)選為1 5。 所述保護劑為乳糖和牛血清白蛋白時，所述乳糖和所述牛血清白蛋白作為原料的質(zhì)量比優(yōu)選為1 1。所述保護劑為乳糖和亮氨酸時，所述乳糖和所述亮氨酸作為原料的質(zhì)量比優(yōu)選為5 1。所述保護劑為乳糖和甘露醇時，所述乳糖和所述甘露醇作為原料的質(zhì)量比優(yōu)選為
1 Io所述保護劑與所述分枝桿菌噬菌體D29作為原料的配比可為Ig (IXlO4PFU 至1X1012PFU)。所述保護劑與所述分枝桿菌噬菌體D29作為原料的配比具體可為 Ig (IX IO6PFU至IX IOiqPFU)。所述保護劑與所述分枝桿菌噬菌體D29作為原料的配比具體優(yōu)選為 Ig (1. 88 X IO6PFU 至 5. 16 X IO9PFU)。所述保護劑與所述分枝桿菌噬菌體D29作為原料的配比可為 Ig (2. 68士0. 80) XlO6PFU 至(0. 74士0. 40) X 108PFU、Ig (0. 74士0. 40) X IO8PFU 至(0. 96士0. 09) X IO8PFUUg (0. 96士0. 09) X IO8PFU 至(1. 08 士0. 27) X 108PFU、 Ig (1. 08士0. 27) XlO8PFU 至(1. 30士0. 33) X 108PFU、Ig (1. 30士0. 33) X IO8PFU 至(1. 86士0. 78) XlO8PFUUg (1. 86士0. 78) X IO8PFU 至(2. 78士0. 15) X IO8PFU、或 Ig (2. 78士0. 15) X IO8PFU 至(4. 4士0. 76) X IO9PFU。所述固體化的方法具體可為噴霧干燥法。應(yīng)用噴霧干燥法進行所述固體化時，所述噴霧干燥法的參數(shù)具體可為入口溫度80°C至120°C (如80°C至100°C、100°C至120°C)、 氣流速度 90L/min 至 150L/min (如 90L/min 至 120L/minU20L/min 至 150L/min)、噴霧速率40%至100% (如40%至60%、60%至80%、80%至100% )、噴頭蓋孔徑為4. 0 μ m至 7. 0 μ m (如4. 0 μ m至5. 5 μ m、5. 5 μ m至7. 0 μ m)。所述噴霧干燥所用的儀器具體可為瑞士 BUCHI B-90納米噴霧干燥機。用于所述固體化的原料中，所述保護劑具體可以以水溶液的形式加入。所述固體化的原料優(yōu)選為無菌的原料。
本發(fā)明通過采用合適的保護劑、合適的儀器設(shè)備、優(yōu)化的工藝參數(shù)后，可以獲得適合于吸入給藥的分枝桿菌噬菌體D29顆粒物(干粉吸入劑)且分枝桿菌噬菌體D29活性保留值非常高。如果不使用保護劑，或保護劑選用不當(dāng)，分枝桿菌噬菌體D29在噴霧干燥過程中，絕大部分(>95%)將失活，失去了其固體化的意義。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)糖類、蛋白類、氨基酸類和醇類中的一種或幾種可以作為分枝桿菌噬菌體D29固體化的保護劑，采用糖類混合物作為保護劑使分枝桿菌噬菌體D29活性保留達到70%以上(見實施例5)，采用糖類與氨基酸蛋白質(zhì)類的混合物作為保護劑，則可以使分枝桿菌噬菌體D29活性保留達到80%左右 (見實施例9、10)，甚至90%以上(見實施例8)。常規(guī)的噴霧干燥，其所獲得顆粒的大小通常在數(shù)十微米甚至100微米以上，這樣大小的顆粒無法吸入進入下呼吸道，因此不適合肺部吸入給藥。本發(fā)明探索了噴霧干燥工藝對所獲得顆粒物大小的影響，適合于吸入給藥的顆粒。本發(fā)明提供的分枝桿菌噬菌體D29顆粒，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量可為lX102PFU/g至lX109PFU/g，水分的質(zhì)量百分含量可為10%以下，粒度中位值D50可為 20 μ m以下。本發(fā)明采用納米噴霧干燥技術(shù)制備獲得了可吸入顆粒物，并在噴霧干燥中采用了獨特的穩(wěn)定化技術(shù)，從而解決了分枝桿菌噬菌體D29干粉吸入劑制備過程中的技術(shù)難點； 采用吸入給藥可以更好的發(fā)揮分枝桿菌噬菌體D29在臨床肺結(jié)核病中的治療效果，解決了分枝桿菌噬菌體D29應(yīng)用中的技術(shù)難點。最終為分枝桿菌噬菌體D29發(fā)展成為一個藥物提供可能。


圖1為實施例1以蔗賴■作為保護劑時的電鏡照片
圖2為實施例3以海藻糖作為保護劑時的電鏡照片
圖3為實施例4以乳賴■作為保護劑時的電鏡照片
圖4為實施例5以乳賴■和海藻糖作為保護劑時的電鏡照片
圖5為實施例6以乳賴■和甘露醇作為保護劑時的電鏡照片
圖6為實施例7以脫脂奶粉作為保護劑時的電鏡照片
圖7為實施例8以乳賴■和脫脂奶粉作為保護劑時的電鏡照片
圖8為實施例9以乳賴■和牛血清白蛋白作為保護劑時的電鏡照片
圖9為實施例10以乳瞎和亮氨酸作為保護劑時的電鏡照片
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。CFU即菌落形成單位，PFU即空斑形成單位。7H9培養(yǎng)基美國BD公司(產(chǎn)品原廠編號271310)。分枝桿菌噬菌體D29 參考文獻為彭麗，羅永艾，陳保文等.噬菌體D29對感染敏感株結(jié)核分枝桿菌豚鼠的療效.中國人獸共患病學(xué)報.2009，25 (8) :733-736。
實施例中所用的恥垢分枝桿菌均為恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis) ATCC607 參考文獻劉克洋，杜茜，溫占波等.分枝桿菌噬菌體D29氣溶膠的噴霧和采樣介質(zhì)的初步研究.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2010，34(4) :347-350。收率的計算方法如下(收獲的分枝桿菌噬菌體D29顆粒的質(zhì)量/作為原料添加的保護劑的質(zhì)量)X 100%。含水量的計算方法如下取洗凈晾干的稱量瓶(直徑約45mm)，于100°C 士2°C烘干2h，放至室溫后精密稱重(Wtl)；將約Ig分枝桿菌噬菌體D29顆粒平鋪于稱量瓶中，精密稱重(W1)；將稱量瓶轉(zhuǎn)移至烘箱中，打開瓶蓋進行烘干處理(保護劑為糖類時在115°C 士2°C 條件下烘干20h ；保護劑含蛋白類時在80°C 士2°C條件下烘干20h)，然后蓋好瓶蓋，取出于室溫(相對濕度低于60% )條件下放置lOmin，精密稱重(W2)；含水量(％ ) = [(W1-W2)/ (W1-W0)] X 100%。分枝桿菌噬菌體D29顆粒的粒度測定方法如下本專利的實施例中采用LS908 (A) 激光粒度分析儀(珠海歐美克儀器有限公司)測定，具體方法為(1)在靜態(tài)樣品池中加入 7mL介質(zhì)(油酸乙酯)，放入儀器測量系統(tǒng)中，待儀器自動對中、清零后，儀器進入待測狀態(tài)； (2)采用分散介質(zhì)(油酸乙酯)將分枝桿菌噬菌體D29顆粒制成約5mg/mL的均勻懸液后， 取3滴懸液(0. ImL-O. 2mL)加入到靜態(tài)樣品池的介質(zhì)中，吹散均勻，放入儀器測量系統(tǒng)中， 待光柱穩(wěn)定后，即可進行粒度測定，以粒度中位值D50來表示顆粒的大小。也可采用其他商業(yè)可獲得的粒度儀，具體步驟需根據(jù)所使用儀器的操作規(guī)程作相應(yīng)調(diào)整。分枝桿菌噬菌體D29顆粒的電鏡測定方法將分枝桿菌噬菌體D29顆粒均勻地鋪在樣品托上，用日立E-1010離子濺射儀噴金后，日立S-3400N掃描電鏡下觀察、照相。采用其他商業(yè)可獲得的掃描電鏡也可獲得電鏡照片，具體步驟需根據(jù)所使用儀器的操作規(guī)程作相應(yīng)調(diào)整。分枝桿菌噬菌體D29顆粒中的噬菌體存活率的計算方法如下將分枝桿菌噬菌體 D29顆粒用SM液溶解后，再用SM液進行10倍梯度稀釋；分別取0. ImL稀釋液至不同的7H9 底層培養(yǎng)基平板(Φ90πιπι)上，用“L”棒涂布均勻；按照3mL菌液/50mL培養(yǎng)基的比例向加熱到約60°C的7H9上層培養(yǎng)基中加入濃度為107CFU/mL的恥垢分枝桿菌菌液，輕輕搖勻后向上述每個涂布了噬菌體D29的7H9底層培養(yǎng)基平皿中倒入5mL含恥垢分枝桿菌的7H9上層培養(yǎng)基；待上層培養(yǎng)基完全凝固后，將平皿放置于恒溫培養(yǎng)箱中37°C正置培養(yǎng)2天，觀察、 統(tǒng)計平板上的PFU(10 300的結(jié)果為可信區(qū)間)；根據(jù)稀釋度計算分枝桿菌噬菌體D29顆粒中的存活噬菌體個數(shù)；每個稀釋度的樣品涂布3個平皿，結(jié)果取平均值；存活率=(最終得到的分枝桿菌噬菌體D29顆粒中的存活噬菌體個數(shù)/噴霧干燥時加入的噬菌體個數(shù)/收率)X100%oSM 液稱取 2. 9g NaCl 禾口 1. Og MgSO4. 7H20，加入 25ml lmol/L Tris-Cl (pH 7. 5) 和2. 5ml 2% (g/100ml)明膠水溶液，加水至500ml，混勻后于121°C滅菌30min，放至室溫即得SM液。7H9底層培養(yǎng)基稱取1. 6g 7H9培養(yǎng)基、5. 6g瓊脂粉，加水315mL，混勻后121°C滅菌30min，然后45 50°C時無菌操作加入小牛血清復(fù)合物溶液(0ADC溶液)35ml，混勻后制成平板(12ml/平皿)；放至室溫凝固后，4°C冰箱保存。7H9上層培養(yǎng)基稱取1. 6g 7H9培養(yǎng)基、2. 8g瓊脂粉，加水315mL，混勻后121°C滅菌30min，無菌密封條件下置于4°C保存。OADC溶液將8. 5g NaCl、50g BSA(小牛血清白蛋白V因子)、20g葡萄糖用900mL 水充分溶解，得試劑A ；將1. 28g油酸、6mL 0. IM NaOH溶液和54mL水，充分溶解混合，得試劑B ；將37. 5mg生物素和12. 5mg維生素B6用IOmL水溶解，取ImL與25mg過氧化氫酶和 59mL水后振搖，使充分溶解，得試劑C ；將800mL試劑A、50mL試劑B和50mL試劑C混合，得到OADC原液；OADC原液用無菌濾膜過濾后(過濾裝置下層為0. 22μπι濾膜，上層為0. 45 μ m 濾膜)即為OADC溶液(加蓋后-20°C保存?zhèn)溆?。實施例1、噴霧干燥法制備分枝桿菌噬菌體D29顆粒一、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的制備1、稱取20g蔗糖(即作為原料添加的保護劑的質(zhì)量為20g)，加入到930g水中攪拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，得到濾液。2、向濾液中加入50g分枝桿菌噬菌體D29菌液[濃度為(1. 07士0. 32) X IO6PFU/ g]，混合均勻后采用瑞士 BUCHI B-90型納米噴霧干燥機噴霧干燥，得到分枝桿菌噬菌體 D29顆粒。儀器參數(shù)設(shè)定為入口溫度10(TC、氣流速度120L/min、噴霧速率40%、噴頭蓋 7. 0 μ m ；回流液收集至無菌燒瓶內(nèi)。二、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征數(shù)據(jù)如下收率為(83. 56士2. 15) %，含水量為(2. 84士0.57) % ；球形(見圖1)，大小在數(shù)微米至十幾微米間；粒譜測定顯示D50為 (10. 56 士 0. 65) μ m ；噬菌體存活率為(42. 47 士 11. 43) % ；所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒中， 存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量為(2. 72士0. 73) X 104PFU/g。實施例2、噴霧干燥法制備分枝桿菌噬菌體D29顆粒一、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的制備用乳糖代替蔗糖，其它完全同實施例1的步驟一。二、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征數(shù)據(jù)如下收率為(78. 72士 1.41) %，含水量為(5. 08 士 0.22) % ；類球形，大小在數(shù)微米至數(shù)十微米間；粒譜測定顯示D50為 (15. 66士 1. 65) μ m ；噬菌體存活率為(45. 58士 16. 50) % ；所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒中， 存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量為(3. 10士 1. 12) X104PFU/g。實施例3、噴霧干燥法制備分枝桿菌噬菌體D29顆粒一、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的制備1、稱取50g海藻糖(即作為原料添加的保護劑的質(zhì)量為50g)，加入到150g水中攪拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，得到濾液。2、向濾液中加入50g分枝桿菌噬菌體D29菌液[(1. 30士0. 33) X 108PFU/g]，混合均勻后采用瑞士 BUCHI B-90型納米噴霧干燥機噴霧干燥，得到分枝桿菌噬菌體D29顆粒。 儀器參數(shù)設(shè)定為入口溫度80°C、氣流速度90L/min、噴霧速率60%、噴頭蓋5. 5μ m ；回流液收集至無菌燒瓶內(nèi)。二、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征數(shù)據(jù)如下收率為(72. 57士2.49) % ；含水量為(8. 08士0.27) % ；球形(見圖2)，大小在數(shù)微米至十幾微米；粒譜測定顯示D50為(8. 69 士 0. 94) μ m ；噬菌體存活率為(50. 40 士 5. 22) % ；所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒中，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量為(1. 81 士0. 19) X 106PFU/g。實施例4、噴霧干燥法制備分枝桿菌噬菌體D29顆粒一、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的制備1、稱取50g乳糖(即作為原料添加的保護劑的質(zhì)量為50g)，加入到400g水中攪拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，得到濾液。2、向濾液中加入50g分枝桿菌噬菌體D29菌液[(4. 4士0. 76) X 109PFU/g]，混合均勻后采用瑞士 BUCHI B-90型納米噴霧干燥機噴霧干燥，得到分枝桿菌噬菌體D29顆粒。儀器參數(shù)設(shè)定為入口溫度120°C、氣流速度150L/min、噴霧速率100%、噴頭蓋4. 0 μ m ；回流液收集至無菌燒瓶內(nèi)。二、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征數(shù)據(jù)如下收率為(71. 05士0.22)% ；含水量為 (3. 27士0. 35)% ；球形、部分顆粒表面有凹陷(見圖3)，顆粒大小在數(shù)微米；粒譜測定顯示 D50為(5. 65 士 0.05) μ m;噬菌體存活率為(41. 50 士 12. 30) % ；所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒中，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量為(5. 14士 1. 52) X 107PFU/g。實施例5、噴霧干燥法制備分枝桿菌噬菌體D29顆粒一、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的制備1、稱取25g乳糖和25g海藻糖(即作為原料添加的保護劑的質(zhì)量為50g)，加入到 400g水中攪拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，得到濾液。2、向濾液中加入50g分枝桿菌噬菌體D29溶液[(0. 74士0. 40) X 108PFU/g]，混合均勻后采用瑞士 BUCHI B-90型納米噴霧干燥機噴霧干燥，得到分枝桿菌噬菌體D29顆粒。 儀器參數(shù)設(shè)定為入口溫度120°C、氣流速度120L/min、噴霧速率80%、噴頭蓋5. 5μπι;回流液收集至無菌燒瓶內(nèi)。二、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征數(shù)據(jù)如下收率為(84. 99士0. 62) % ；含水量為 (2. 88士0.04)% ；類球形，部分顆粒表面有皺折、凹陷(見圖4)，顆粒大小在數(shù)微米至十幾微米間；粒譜測定顯示D50為(10. 94士0. 45) μ m ；噬菌體存活率為(73. 80士9. 05) % ；所述
分枝桿菌噬菌體D29顆粒中，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量為(1. 29士0. 16) X IO6PFU/ g° 實施例6、噴霧干燥法制備分枝桿菌噬菌體D29顆粒一、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的制備1、稱取25g乳糖和25g甘露醇(即作為原料添加的保護劑的質(zhì)量為50g)，加入到 400g水中攪拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，得到濾液。2、向濾液中加入50g分枝桿菌噬菌體D29溶液[(0. 96士0. 62) X 108PFU/g]，混合均勻后，采用瑞士 BUCHI B-90型納米噴霧干燥機噴霧干燥，得到分枝桿菌噬菌體D29顆粒。 儀器參數(shù)設(shè)定為入口溫度120°C、氣流速度120L/min、噴霧速率80%、噴頭蓋5. 5μπι;回流液收集至無菌燒瓶內(nèi)。二、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征數(shù)據(jù)如下收率為(57. 16士3. 57)% ；含水量為(1. 34士0. 11) 球形并有一定粘連(見圖5)，顯微觀察顆粒大小在數(shù)微米至十幾微米；粒譜測定顯示D50為(8. 94 士 0. 29) μ m ；噬菌體存活率為(71. 60 士 3. 68) % ；所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒中，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量為(2. 41 士0. 12) X 106PFU/g。實施例7、噴霧干燥法制備分枝桿菌噬菌體D29顆粒一、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的制備1、稱取50g市售脫脂奶粉(內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司)(即作為原料添加的保護劑的質(zhì)量為50g)，加入到400g水中攪拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，得到濾液。2、向濾液中加入50g分枝桿菌噬菌體D29溶液[(0. 96士0. 09) X 108PFU/g]，混合均勻后，采用瑞士 BUCHI B-90型納米噴霧干燥機噴霧干燥，得到分枝桿菌噬菌體D29顆粒。 儀器參數(shù)設(shè)定為入口溫度120°C、氣流速度120L/min、噴霧速率80%、噴頭蓋5. 5μπι;回流液收集至無菌燒瓶內(nèi)。二、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征數(shù)據(jù)如下收率為(83. 40士2. 90) % ；含水量為 (2. 50 士 0. 20)% ；球形，部分顆粒表面凹陷(見圖6)，顯微觀察顆粒大小在數(shù)微米；粒譜測定顯示D50為(7. 91 士 0. 39) μ m ；噬菌體存活率為(80. 71 士 4. 34) % ；所述分枝桿菌噬菌體 D29顆粒中，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量為(1. 86士0. 10) X 106PFU/g。實施例8、噴霧干燥法制備分枝桿菌噬菌體D29顆粒一、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的制備1、稱取5g乳糖和25g市售脫脂奶粉(內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司)(即作為原料添加的保護劑的質(zhì)量為30g)，加入到400g水中攪拌溶解后，在生物安全柜中用 0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，得到濾液。2、向濾液中加入50g分枝桿菌噬菌體D29溶液[(1. 67士0. 09) X 108PFU/g]，混合均勻后，采用瑞士 BUCHI B-90型納米噴霧干燥機噴霧干燥，得到分枝桿菌噬菌體D29顆粒。 儀器參數(shù)設(shè)定為入口溫度120°C、氣流速度120L/min、噴霧速率80%、噴頭蓋5. 5μπι;回流液收集至無菌燒瓶內(nèi)。二、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征數(shù)據(jù)如下收率為(81. 10士3. 76) % ；含水量為(2. 11 士0.08)% ；類球形，部分顆粒表面內(nèi)凹甚至呈不規(guī)則形(見圖7)，顯微觀察顆粒大小在數(shù)微米至二十微米間；粒譜測定顯示D50為(7. 49士0. 59) μ m ；噬菌體存活率為 (95. 10士 1. 88) % ；所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒中，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量為 (6. 53 士 0. 13) X 106PFU/g。實施例9、噴霧干燥法制備分枝桿菌噬菌體D29顆粒一、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的制備1、稱取25g乳糖和25g牛血清白蛋白(即作為原料添加的保護劑的質(zhì)量為50g)， 加入到400g水中攪拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，得到濾液。2、向濾液中加入50g分枝桿菌噬菌體D29溶液[(1. 86士0. 78) X 108PFU/g]，混合均勻后，采用瑞士 BUCHI B-90型納米噴霧干燥機噴霧干燥，得到分枝桿菌噬菌體D29顆粒。 儀器參數(shù)設(shè)定為入口溫度120°C、氣流速度120L/min、噴霧速率80%、噴頭蓋5. 5μπι;回流液收集至無菌燒瓶內(nèi)。二、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征數(shù)據(jù)如下收率為(70. 58士 1. 09) % ；含水量為 (2. 74士0. 04) % ；球形，少量顆粒表面有皺折(見圖8)，顯微觀察顆粒大小在數(shù)微米至十幾微米間；粒譜測定顯示D50為(8. 14士0. 17) μ m ；噬菌體存活率為(85. 10士 18. 95) % ；所述
分枝桿菌噬菌體D29顆粒中，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量為(4. 49 士 0. 99) X IO6PFU/ g°實施例10、噴霧干燥法制備分枝桿菌噬菌體D29顆粒一、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的制備1、稱取25g乳糖和5g亮氨酸(即作為原料添加的保護劑的質(zhì)量為30g)，加入到 400g水中攪拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，得到濾液。2、向濾液中加入50g分枝桿菌噬菌體D29溶液[(0. 65士0. 16) X 108PFU/g]，混合均勻后，采用瑞士 BUCHI B-90型納米噴霧干燥機噴霧干燥，得到分枝桿菌噬菌體D29顆粒。 儀器參數(shù)設(shè)定為入口溫度120°C、氣流速度120L/min、噴霧速率80%、噴頭蓋5. 5μπι;回流液收集至無菌燒瓶內(nèi)。二、分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征分枝桿菌噬菌體D29顆粒的表征數(shù)據(jù)如下收率為(82. 85士0. 16) % ；含水量為 (2. 30士0. 57) % ；類球形，或不規(guī)則類球形(見圖9)，顯微觀察顆粒大小在數(shù)微米至二十微米間；粒譜測定顯示D50為(9. 34士0. 40) μ m ；噬菌體存活率為(78. 70士8. 91) % ；所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒中，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量為(2. 06士0. 23) X 106PFU/g。
權(quán)利要求
1.一種分枝桿菌噬菌體D29顆粒，它的活性成分由分枝桿菌噬菌體D29和保護劑組成； 所述保護劑為糖和/或蛋白和/或氨基酸和/或醇。
2.如權(quán)利要求1所述的分枝桿菌噬菌體D29顆粒，其特征在于所述糖為蔗糖、乳糖和海藻糖中的至少一種；所述蛋白為奶粉和牛血清白蛋白中的至少一種；所述氨基酸為亮氨酸；所述醇為甘露醇。
3.如權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其特征在于所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒中，存活的分枝桿菌噬菌體D29的含量為lX102PFU/g至lX109PFU/g，水分的質(zhì)量百分含量為10% 以下；所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒的粒度中位值D50為20 μ m以下。
4.權(quán)利要求1或2或3所述分枝桿菌噬菌體D29顆粒的制備方法，是將所述分枝桿菌噬菌體D29與所述保護劑作為原料一起進行固體化，得到分枝桿菌噬菌體D29顆粒。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述保護劑為如下(1)至(9)中的任意一種⑴蔗糖；⑵乳糖；⑶海藻糖；⑷乳糖和海藻糖；(5)乳糖和甘露醇；(6)奶粉；(7) 乳糖和奶粉；(8)乳糖和牛血清白蛋白；(9)乳糖和亮氨酸。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述保護劑與所述分枝桿菌噬菌體D29 作為原料的配比為Ig IX IO4PFU至1X1012PFU。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述保護劑與所述分枝桿菌噬菌體D29作為原料的配比為 Ig 1.88X IO6PFU 至 5. 16XlO9PFUt5
8.如權(quán)利要求4至7中任一所述的方法，其特征在于所述固體化的方法為噴霧干燥法。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述噴霧干燥法的參數(shù)為入口溫度80°C 至120°C、氣流速度90L/min至150L/min、噴霧速率40%至100%、噴頭蓋孔徑為4. 0 μ m至 7. 0 μ m0
10.如權(quán)利要求4至9中任一所述的方法，其特征在于所述固體化的原料為無菌的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分枝桿菌噬菌體D29顆粒及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的分枝桿菌噬菌體D29顆粒的活性成分由分枝桿菌噬菌體D29和保護劑組成；所述保護劑為糖和/或蛋白和/或氨基酸和/或醇。本發(fā)明采用納米噴霧干燥技術(shù)制備獲得了可吸入顆粒物，并在噴霧干燥中采用了獨特的穩(wěn)定化技術(shù)，從而解決了分枝桿菌噬菌體D29干粉吸入劑制備過程中的技術(shù)難點；采用吸入給藥可以更好的發(fā)揮分枝桿菌噬菌體D29在臨床結(jié)核病中的治療效果，解決了分枝桿菌噬菌體D29應(yīng)用中的技術(shù)難點，最終為分枝桿菌噬菌體D29發(fā)展成為一個藥物提供可能。
文檔編號A61K9/16GK102296056SQ20111025274
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者劉秋煥, 李京京, 王靜, 程洪亮, 鄒紅霞, 陸兵, 陳芳 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所