專利名稱：越橘發(fā)酵法制備的紫紅參及其在醫(yī)藥中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紫紅參制作工藝的改進(jìn)，具體的說(shuō)是提供了一種越橘發(fā)酵法制備的紫紅參，同時(shí)還公開(kāi)了紫紅參在抗腫瘤、心肌保護(hù)和因缺氧而引起的疾病等方面的醫(yī)用用途，屬于中醫(yī)藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
紫紅參也稱黑參是人參更深層次加工產(chǎn)品，其稀有皂苷成分人參皂苷他2，人參皂苷Rg3含量較紅參更高，且紫紅參中含有豐富人參皂苷Wd，人參皂苷Rg5，這些成分在紅參和白參中幾乎不存在，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg5比人參皂苷Rg3抗腫瘤活性更強(qiáng)。目前出現(xiàn)在韓國(guó)專利上的黑參加工方法主要是九蒸九曝法。由于九蒸九曝法在反復(fù)高溫蒸炙下可能生成致癌物質(zhì)苯并芘類化合物，且時(shí)間較長(zhǎng)，工藝繁瑣。Yoon-Jung Hwan等人使用日本杏發(fā)酵液進(jìn)行制備黑參，此法很少產(chǎn)生致癌物質(zhì)苯并芘類化合物，但是發(fā)酵制備時(shí)間較長(zhǎng)(1-6個(gè)月)，且該專利中沒(méi)有說(shuō)明稀有人參皂苷Rg5的含量增加。越橘果是杜鵑花科(五rica⑶從)越橘屬(Vaccinium. spp)植物越橘的成熟果實(shí)， 東北地區(qū)產(chǎn)量可占全國(guó)的90%，年產(chǎn)量在十萬(wàn)噸至百萬(wàn)噸左右。越橘果實(shí)中含有豐富的花色苷類物質(zhì)，這類物質(zhì)具有顯著的抗癌、抗氧化、抗衰老等多種功效。目前對(duì)采用發(fā)酵法制備紫紅參的加工工藝及其醫(yī)療活性研究較少，因此本發(fā)明公開(kāi)了一種采用越橘發(fā)酵液制備紫紅參的加工工藝及其提取物在抗腫瘤、心肌保護(hù)和耐缺氧上的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了一種越橘發(fā)酵法制備的紫紅參，不僅含有大量人參稀有皂苷組分還含有少量的花色苷類物質(zhì)。本發(fā)明還公開(kāi)了上述紫紅參的制備工藝，發(fā)酵制備時(shí)間大大縮短，并含有較高的人參稀有皂苷Rg5。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了紫紅參的醫(yī)用用途。本發(fā)明公開(kāi)的越橘發(fā)酵法制備的紫紅參，是通過(guò)以下方法制備的
1)越橘發(fā)酵液
將越橘清洗、搗碎、滅菌處理后，按體積比將越橘白砂糖保加利亞菌=(1 10) :1 (0. 2^0. 5)混合，其中，保加利亞菌菌液濃度為6X IO8個(gè)/ml，發(fā)酵罐中攪拌密封發(fā)酵，溫度為20°C 30°C，發(fā)酵時(shí)間為5-6天，發(fā)酵原液制備好后加廣10倍體積的水，調(diào)配成越橘發(fā)酵液；
2)發(fā)酵熟化
將清洗干凈的人參放入步驟1)的發(fā)酵液中，投放比例為發(fā)酵液/人參=(Γ10)L / kg, 發(fā)酵罐中30°C 70°C的條件下發(fā)酵時(shí)間為M 108h ；
3)蒸熟熟化發(fā)酵熟化后，通入熱風(fēng)溫度105°C，每次15min，攪拌，保持濕度30飛0%，熟化時(shí)間為 24 湖h ；
4)低溫熟化
保持溫度在2(T50°C，進(jìn)行低溫熟化M 108h ；即得干燥的發(fā)酵紫紅參。本發(fā)明所述的紫紅參在制備治療胃癌、肺癌、肝癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的紫紅參在制備治療因阿霉素類藥物造成的心肌損傷藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的紫紅參在制備治療因缺氧而引起的疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有紫紅參制備工藝相比其積極效果在于
采用越橘發(fā)酵液發(fā)酵制備的紫紅參，不僅含有人參稀有皂苷組分還含有花色苷類物， 可用于制備治療胃癌、肺癌、肝癌藥物和治療因抗生素類藥物造成的心肌損傷及其提高機(jī)體耐缺氧能力。本發(fā)明發(fā)酵工藝操作方便簡(jiǎn)單，發(fā)酵過(guò)程中加入了保加利亞菌，大大縮短了發(fā)酵液制備的時(shí)間，提高發(fā)酵效率，稀有皂苷Rg5含量較高，適用于大批量的工業(yè)生產(chǎn)。為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明工藝所制備的紫紅參中含有大量稀有人參皂苷及花色苷， 以下采用高效液相法對(duì)紫紅參進(jìn)行質(zhì)量評(píng)定
實(shí)驗(yàn)例1
本發(fā)明工藝制備紫紅參中人參皂苷的分析 1.1實(shí)驗(yàn)材料和方法 1.1.1實(shí)驗(yàn)材料
紫紅參本發(fā)明工藝制作；色譜甲醇和色譜乙腈美國(guó)Tedia ；其他常規(guī)化學(xué)試劑(分析純)北京化工廠。1.1. 2實(shí)驗(yàn)方法
1. 1. 2. 1 HPLC-MS 分析條件
儀器設(shè)備Agilent 1100 series, LC/MS，G1946D ；干燥氣流速度12L/min ；霧化氣壓力:50psi ；錐孔電壓=IV ；毛細(xì)管電壓:3KV ；
流速1. Oml/min，分流:08+0. 2 (分)千分之五；色譜柱色譜柱大連江申C18 column (150 mm X 6.0 mm, 5 μ m)；柱溫30°C ；流動(dòng)相乙腈和甲酸銨水溶液梯度洗脫，洗脫條件見(jiàn)為 0-15min 20%_40% 乙腈；15_55min 40%_80% 乙腈；55_65min 80%_100% 乙腈。1. 1.2. 2測(cè)試樣品的制備
將本發(fā)明紫紅參粉碎，過(guò)200-300目篩，精確稱取1. OOOg放入索氏提取器中加入50ml 分析甲醇，80°C水浴加熱提取10h。完成以后將甲醇真空濃縮，用色譜甲醇定容于25ml的容量瓶中，取樣0.22 um過(guò)濾待HPLC-MS測(cè)定。1. 2 HPLC-MS 分析結(jié)果
紫紅參提取物中35. 53 Imin化合物，[M-H]-為766，推測(cè)M為767，結(jié)合文獻(xiàn)考證推測(cè)此化合物為人參皂苷Rg5 (質(zhì)譜圖見(jiàn)附圖4)。紫紅參提取物中34. 65 Imin化合物，[M_H]_為766，推測(cè)M為767，結(jié)合文獻(xiàn)考證推測(cè)此化合物為人參皂苷Md。紫紅參提取物中26. 945min化合物，[M_H]_為784，推測(cè)M為785，結(jié)合文獻(xiàn)考證推測(cè)此化合物為人參皂苷Rg3。紫紅參提取物中25. 384min化合物，[M_H]_為619，推測(cè)M為620，結(jié)合文獻(xiàn)考證推測(cè)此化合物為人參皂苷他4。紫紅參提取物中24. 388min化合物，[M_H]_為619，推測(cè)M為620，結(jié)合文獻(xiàn)考證推測(cè)此化合物為人參皂苷I k3。紫紅參提取物中23. 657min化合物，[M_H]_為765，推測(cè)M為766，結(jié)合文獻(xiàn)考證推測(cè)此化合物為人參皂苷Rg4或F4。從紫紅參的提取液中我們可以看出，人參皂苷Rgl、Re、Rf、Rb 1、Rb2、Rb3、Rc、Rd等幾乎不能檢測(cè)出來(lái)，大量稀有皂苷如1^1、Rg4、Rg5、Rh4, I k3等出現(xiàn)，其中以人參皂苷Rg5
含量最從紫紅參HPLC (見(jiàn)附

圖1)、HPLC-MS Neg (見(jiàn)附圖2 )和HPLC-DAD譜圖中(見(jiàn)附圖 3)我們可以看到常規(guī)皂苷基本消失，大量稀有皂苷如人參皂苷Rg3、Rg5、Rh4, RkU F4, Rk3 等出現(xiàn)，其中含量最高的是人參皂苷Rg5，其次是人參皂苷Rg3、Rk3,他4，因此將人參加工成紫紅參可以獲得高活性人參加工產(chǎn)品。從發(fā)酵紫紅參HPLC-MS TIC圖譜我們可以看出人參皂苷20位糖基優(yōu)先脫除，3位或6位所連接的糖基很難脫除，這就導(dǎo)致Rg3等生成，而很少有他2、1 1的生成，其次是20位叔羥基的脫水反應(yīng)，從而得到URk3,Rh4、Rg5的生成， 最后是3位末端糖的乙?；鏡s4、Rs5、Rs6的生成。本實(shí)驗(yàn)例采用乙醇、氯仿、乙酸乙酯三種試劑結(jié)合索氏提取，所得結(jié)果經(jīng)分析與甲醇相似。實(shí)驗(yàn)例2
本發(fā)明工藝制備紫紅參中稀有皂苷含量的檢測(cè) 2. 1實(shí)驗(yàn)材料和方法 2. 1. 1實(shí)驗(yàn)材料本發(fā)明工藝制備紫紅參； 高麗紅參皇封參業(yè)有限公司提供； 色譜乙腈美國(guó)Tedia; 純水杭州哇哈哈有限公司； 色譜甲醇美國(guó)iTedia15Rgl、Re、Rg2、Rbl、Rb2、RcU S_Rg3、R-Rg3、S_Rh2、R-Rh2、Rg5、S-PPt、S-PPd, C_K、 Rhl標(biāo)準(zhǔn)品均有是實(shí)驗(yàn)室自制(HPLC檢測(cè)含量> 98%)。2. 1. 2實(shí)驗(yàn)方法
2. 1. 2. 1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制
將 Rg 1、Re、Rg2、Rb 1、Rb2、Rd、S_Rg3、R-Rg3、S_Rh2、R-Rh2、Rg5、S-PPt、S-PPd、C-K、Rh 1 標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成1. OOOmg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2. 1. 2. 2待測(cè)試樣品的制備
將本發(fā)明制備的紫紅參及高麗紅參分別粉碎，過(guò)200-300目篩，精確稱取1. OOOg放入索氏提取器中加入50ml分析甲醇，80°C水浴加熱提取10h。完成以后將甲醇真空濃縮，用色譜甲醇定容于25ml，取樣0. 23 μ m過(guò)濾，待HPLC-UV測(cè)定。2. 1. 2. 3 HPLC分析條件的建立
色譜柱大連江申C18 column (150 mm X6.0 mm, 5 μ m)；島津2010系列高效液 ffifeif ft(SPD-20A UV/VIS Detector , LC-20AT Prominence Liquid chromatograph,DGU-20A5 Proninence Degasser, CTU-IOASVP column oven, LC-solution 工作站)。柱溫30°C ；流速1. Oml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)203nm ；流動(dòng)相乙腈和水梯度洗脫，梯度洗脫條件為 0-25min 乙腈 19-20% ;25_35min 乙腈 20-31% ;35_60min 乙腈 31-40% ;60_90min 乙腈 40-80% ；90-120min 乙腈 80-100% ； 2. 1.2. 4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
分別將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至 1. OOOmg,0. 500mg/m、10. 250mg/ml、0. lmg/m、0. 050mg/ ml、0. 010mg/mL·分別按照4. 1. 2. 3分析條件進(jìn)針20 μ 1。以濃度為橫坐標(biāo)X，以峰面積為縱坐標(biāo)Y。線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 1. 2. 5 黑參 HPLC-UV 比較分析
將4. 1. 2. 2配制好的樣品溶液分別按照4. 1. 2. 3分析條件進(jìn)針20 μ 1，計(jì)算各峰面積， 用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中各物質(zhì)含量。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
分析結(jié)果見(jiàn)表2-1 ；本發(fā)明所制備的紫紅參中人參皂苷稀有皂苷的含量明顯增加，尤其是人參皂苷Rg5的含量增加的最為明顯，而相關(guān)專利中卻沒(méi)有人參皂苷Rg5含量增加的報(bào)道。表2-1本發(fā)明紫紅參及高麗紅參HPLC-UV比較分析結(jié)果(％)
權(quán)利要求
1.一種越橘發(fā)酵法制備紫紅參的制備工藝，包括以下步驟1)越橘發(fā)酵液將越橘清洗、搗碎、滅菌處理后，按體積比將越橘白砂糖保加利亞菌=(1 10) :1 (0. 2^0. 5)混合，其中，保加利亞菌液濃度為6X IO8個(gè)/ml，發(fā)酵罐中攪拌密封發(fā)酵，溫度為20°C 30°C，發(fā)酵時(shí)間為5-6天，發(fā)酵原液制備好后加廣10倍體積的水，調(diào)配成越橘發(fā)酵液；2)發(fā)酵熟化將清洗干凈的人參放入步驟1)的發(fā)酵液中，投放比例為發(fā)酵液/人參=(Γ10)L / kg, 發(fā)酵罐中30°C 70°C的條件下發(fā)酵時(shí)間為M 108h ；3)蒸熟熟化發(fā)酵熟化后，通入熱風(fēng)溫度105°C，每次15min，攪拌，保持濕度30飛0%，熟化時(shí)間為 24 湖h ；4)低溫熟化保持溫度在2(T50°C，進(jìn)行低溫熟化M 108h ；即得干燥的發(fā)酵紫紅參。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備工藝制備的紫紅參。
3.權(quán)利要求2所述的紫紅參在制備治療胃癌、肺癌、肝癌藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的紫紅參在制備治療因抗生素類藥物造成的心肌損傷藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的紫紅參在制備因缺氧而引起疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種越橘發(fā)酵法制備的紫紅參及其在醫(yī)藥中的用途，采用越橘發(fā)酵液發(fā)酵制備的紫紅參，不僅含有人參稀有皂苷組分還含有花色苷類物，可用于制備治療胃癌、肺癌、肝癌藥物和治療因抗生素類藥物造成的心肌損傷及其提高機(jī)體耐缺氧能力。本發(fā)明發(fā)酵工藝操作方便簡(jiǎn)單，發(fā)酵過(guò)程中加入了保加利亞菌，大大縮短了發(fā)酵液制備的時(shí)間，提高發(fā)酵效率，稀有皂苷Rg5含量較高，適用于大批量的工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P39/00GK102302529SQ20111025846
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者劉偉杰, 孫曉波, 李永娟, 鄭毅男 申請(qǐng)人:吉林省白山市皇封參業(yè)有限公司