專利名稱：一種新型免疫調(diào)節(jié)蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
一種新型免疫調(diào)節(jié)蛋白及其制備和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因重組及表達(dá)的促Treg活化蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(CD4+CD25+regulatory T cells, Tregs)是在研究自身免疫性疾病時(shí)發(fā)現(xiàn)的一類特殊的⑶4+T淋巴細(xì)胞亞群，表達(dá)⑶25、CTLA-4、GITR、⑶86和特征性的轉(zhuǎn)錄因子FoxP3，對維持和調(diào)節(jié)人體免疫平衡有重要作用。Tregs具有持久的免疫抑制活性。Tregs可識(shí)別自身抗原和外來抗原，非特異性抑制其它免疫相關(guān)細(xì)胞活性， 抑制不適當(dāng)或過度的免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)和維持免疫穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)免疫耐受。Tregs的特殊生物學(xué)功能，為臨床治療自身免疫性疾病和移植免疫相關(guān)疾病提供了新的思路。根據(jù)細(xì)胞發(fā)育過程、抗原特異性、活化機(jī)制和信號(hào)通路，Tregs分為天然型Treg細(xì)胞(nTregs)和誘生型 Treg細(xì)胞(iTregs)。天然Tregs占全部⑶4+細(xì)胞的5%-10%，在外周血不到2%，且只有 CD4+CD25bHgh+high orCD4+CD25+Fox3+T細(xì)胞才為具有免疫抑制的Tregs。因此，如何獲得足夠數(shù)量的有功能的Tregs成為其臨床應(yīng)用的瓶頸。嘗試誘發(fā)或擴(kuò)大Tregs的調(diào)節(jié)功能主要有兩種途徑分離有適應(yīng)癥患者Tregs在體外擴(kuò)增后回輸和利用相關(guān)媒介在體內(nèi)增強(qiáng)Tregs 功能。后一方法需要一種生物制劑。
尋求能在體內(nèi)活化Tregs增強(qiáng)其抑制功能且無毒副作用的生物制劑成為研究的熱點(diǎn)。Jiaxiang(an additional [J] · Int Tmmunol , 2009, 21 (3) :283-294)等分離健康人外周血⑶4+⑶25+T細(xì)胞使其感染人類免疫缺陷病毒I (HIV-1)并檢測Treg相關(guān)功能標(biāo)記物， 研究發(fā)現(xiàn)，靜止的⑶4+CD25+T細(xì)胞感染有活性或滅活的HIV-1后，Treg特征性標(biāo)記Fox3表達(dá)量增多，⑶4+CD25+T細(xì)胞的抑制功能增強(qiáng)了 2 5倍，且上調(diào)抗凋亡分子Bcl_2延長細(xì)胞生存，表達(dá)歸巢受體⑶62L和α 4β 7，誘導(dǎo)⑶4+⑶25+T在外周淋巴結(jié)和粘膜相關(guān)淋巴組織聚集。HIV引起的靜止⑶4+⑶25+Τ的生物學(xué)行為改變引起了人們的關(guān)注。HIV主要通過其包膜蛋白gpl20與Q34+T細(xì)胞表面0)4分子結(jié)合入侵人體。Christian Becker (Blood, 2009, 114(6 ) :1263-1269)等發(fā)現(xiàn)真核表達(dá)獲得的可溶性重組gpl20分子能夠與⑶4分子結(jié)合上調(diào)⑶4+⑶25+T細(xì)胞內(nèi)cAMP，增強(qiáng)其抑制功能，單劑量輸注5 μ g gpl20輸入小鼠體內(nèi)，足以能夠保護(hù)小鼠免死于致死性的移植物抗宿主病，說明游離的gpl20分子在體內(nèi)外均與CD4分子結(jié)合，增強(qiáng)⑶4+⑶25+T細(xì)胞的抑制功能，可能為一種潛在的生物制劑。
外膜蛋白gpl20由恒定區(qū)和高變區(qū)組成V1 V5區(qū)段為高變區(qū)，位于gpl20表面， Cl C5區(qū)為穩(wěn)定區(qū)，主要位于gpl20核心區(qū)域。gpl20的第4恒定區(qū)(C4)與⑶4的MHC II分子結(jié)合部位結(jié)合，引起gpl20的構(gòu)象改變，在其第3高變區(qū)(V3)發(fā)生蛋白水解，并通過細(xì)胞表面融合受體(fusion receptor)與跨膜蛋白gp41融合,使gp41暴露,從而使疏水性較強(qiáng)的gp41 —端插入靶細(xì)胞胞膜中，便于病毒胞膜與靶細(xì)胞膜融合，完成HIV侵入CD4+ 靶細(xì)胞。C4區(qū)是gpl20與⑶4結(jié)合的主要區(qū)域，V3區(qū)對HIV侵入有重要的輔助作用，此外， gpl20的第2恒定區(qū)(C2)、第3恒定區(qū)(C3)和第4高變區(qū)(V4)也有一定的輔助作用。OgertRA等研究發(fā)現(xiàn)HIV gpl20全長在大腸桿菌中很難得到表達(dá)，通過同源基因重組技術(shù)克隆對 AIDS治療藥物vicriviroc有抗性HIV gpl20的C2-V5區(qū)，證實(shí)C2-V5區(qū)與gpl20全長有同樣的生物學(xué)活性，對vicriviroc有100%的抗性。可見C2-V5區(qū)是gpl20活性中心。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人類免疫缺陷病毒的被膜蛋白gpl20 C2-C4蛋白分子，簡稱 PC2-C4，其氨基酸序列優(yōu)選如SEQ ID N0:1所示。
本發(fā)明提供編碼pC2-C4蛋白的核酸序列，優(yōu)選如SEQ ID NO 2所示。
本發(fā)明還提供包含pC2-C4蛋白分子核酸序列的載體和宿主菌。
本發(fā)明進(jìn)一步提供制備pC2-C4蛋白分子的方法，包括克隆構(gòu)建了 gpl20的 C2-V3-C3-V4-C4(為方便描述，以下核苷酸序列簡稱gC2_C4，翻譯的蛋白命名為pC2_C4)區(qū) cDNA原核表達(dá)載體，在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得了以包涵體形式的高表達(dá)，純化獲得純度大于 90%的蛋白pC2-C4。原核表達(dá)的蛋白無活性，需在體外環(huán)境下復(fù)性，重新折疊形成正確的空間構(gòu)象，恢復(fù)生物學(xué)活性。
本發(fā)明的蛋白經(jīng)體外復(fù)性后，恢復(fù)生物學(xué)活性，能夠與人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞 Hut78 和 jurkat clone E6-1 表面 CD4 分子結(jié)合。
本發(fā)明獲得的蛋白可用于
I)與HIV競爭性結(jié)合CD4，預(yù)防HIV感染；
2)增加體內(nèi)活化Treg細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)Treg功能，用于治療自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等免疫介導(dǎo)的相關(guān)疾??；
3)抑制腫瘤細(xì)胞增殖并可誘導(dǎo)凋亡，用于防治腫瘤。
相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明表現(xiàn)有以下特點(diǎn)
1、重組分子截取了 gpl20的C2-C4區(qū),減小了分子量,避免因gpl20分子量大表達(dá)困難的問題；
2、保留了 gpl20與⑶4結(jié)合主要結(jié)構(gòu)域和輔助結(jié)構(gòu)域，gpl20 C2-C4區(qū)特異性結(jié)合⑶4分子，具有靶向特異性，提高重組分子的轉(zhuǎn)化效率，gpl20 C2-C4與⑶4結(jié)合后，可活化體內(nèi)靜止的⑶4+⑶25-T細(xì)胞，增強(qiáng)其抑制功能；
3、蛋白pC2-C4分子量小，降低了蛋白的免疫原性；
4、構(gòu)建重組分子的原核表達(dá)系統(tǒng)，并融合6個(gè)HIS標(biāo)簽，蛋白以包涵體形式表達(dá)， 具有蛋白表達(dá)量高、純度高、易于純化回收等優(yōu)點(diǎn)。


圖1. gpl20結(jié)構(gòu)簡式圖
圖2. C2-C4區(qū)基因片段PCR和載體構(gòu)建雙酶切鑒定
M IOObp DNA marker ;lane1:C2_C4 per 結(jié)果電泳圖，與理論值大小相符；lane 2 :質(zhì)粒pET28a-c2-c4 ；Lane 3 =BamHI和Sal雙酶切鑒定質(zhì)粒pET28a_C2_C4，結(jié)果與理論值相符。
圖3. SDS-PAGE凝膠電泳和western-blot鑒定蛋白表達(dá)
A M :蛋白marker ；lane1:誘導(dǎo)前對照；lane 2 :誘導(dǎo)后全菌；lane 3 :誘導(dǎo)后上清；lane4 :包涵體溶解液；5 :純化后；B1 :western_blot檢測蛋白表達(dá)。
圖4.免疫共沉淀法驗(yàn)證蛋白與⑶4相互作用圖
1:空白對照；2 Tca8113 陰性對照組；3 :Hut78 細(xì)胞組；4 Jurkat clone E6-1 cells細(xì)胞組。
圖5.1. 5 μ mo I/L的重組蛋白pC2_C4對混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用(100X)
A PBS 組:20h :32h :44h :56h :68h :80h ；
B pC2-C4 組:20h !②32h :44h :56h :68h :80h ；
圖6.1. 5 μ mol/L的重組蛋白pC2_C4對混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用
*表示與PBS組比較P < O. 05
圖7.不同濃度的pC2-C4對混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用
*表示與PBS組比較P < O. 05圖8. pC2-C4作用后Foxp3的表達(dá)水平
A Foxp3mRNA的表達(dá)*表示同PBS組比較P < O. 05
B Foxp3蛋白的表達(dá)1:空白對照；2 =PBS組；3 :pC2_C4組具體實(shí)施方式
現(xiàn)結(jié)合以下實(shí)施例更加詳細(xì)的描述本發(fā)明的gpl20蛋白及其制備方法和應(yīng)用。提供這些實(shí)施例的目的僅在于示例性地說明本發(fā)明，不能將其理解為是對本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Samtoook等人所著《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中的條件進(jìn)行操作，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
實(shí)施例一 RT-PCR擴(kuò)增C2-C4區(qū)基因片段
分離中國流行株HIV-1感染患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，Trizol (購自invitrogen) 法提取總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄酶superscript III (購自invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 以cDNA模板，特異性引物指導(dǎo)下PCR擴(kuò)增C2-C4區(qū)DNA片段。特異性引物上游引物5，-CGCAGGATCCTCTGTCAATTTCACGG-3,引入內(nèi)切酶 BamHI 位點(diǎn)；下游引物 5，-ACGCGTCGACATACATTGCTTTTCCT-3，引入內(nèi)切酶 SalI 位點(diǎn)。反應(yīng)條件98°C預(yù)變性 3min， 98°C 30s, 50°C 30s, 72°C 60s，共 30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin。
PCR結(jié)果電泳圖見圖2，Iane I。
實(shí)施例二 C2-C4原核表達(dá)載體的構(gòu)建
凝膠回收試劑盒(上海捷瑞生物技術(shù)公司)純化回收目的基因C2-C4，BamHI和 SalI雙酶切后亞克隆至原核表達(dá)載體pET28a，命名pET28a_C2_C4，所表達(dá)的蛋白命名為 pC2-C4，BamHI和SalI雙酶切鑒定，理論大小498bp，鑒定正確者寄出測序。BamHI和SalI 雙酶切電泳圖見圖2，lane2-3。測序結(jié)果與序列完全相符。
C2-C4 序列如 SEQ ID NO 2 所示。
實(shí)施例三蛋白pC2-C4的誘導(dǎo)表達(dá)
將質(zhì)粒pET28a-C2_C4轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株大腸桿菌BL21中。挑取單克隆菌落，接種于LB (含25%卡那霉素)培養(yǎng)基，37°C、150rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日按1: 100轉(zhuǎn)接LB (含 25%卡那霉素)培養(yǎng)基，37°C、300rpm劇烈振蕩培養(yǎng)，檢測OD值至0D550約為0. 6時(shí)，加誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度O. lmmol/L，37°C誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)5小時(shí)。
誘導(dǎo)前后分別取菌液，冷卻至4°C，12，OOOrpm離心3min，棄上清液，收獲菌體。按每I克細(xì)菌加入20ml 50mM Tris-HCl (pH 8. O)重懸菌體，以功率300W、工作5秒、間隙3 秒、總時(shí)間8min為一循環(huán),共5次進(jìn)行超聲破碎。14，000g, 20min離心,收集上清和沉淀包涵體，SDS-PAGE凝膠電泳(見圖3A :1_4)和western-blot鑒定蛋白表達(dá)(見圖3 BI)，蛋白以包涵體形式獲得大量表達(dá)。
實(shí)施例四蛋白pC2-C4的純化
挑保存菌種接種于LB (含25%卡那霉素)培養(yǎng)基，37°C、150rpm振蕩培養(yǎng)過夜。 次日按1: 100轉(zhuǎn)接2000ml LB (含25 %卡那霉素)培養(yǎng)基，37°C、300rpm劇烈振蕩培養(yǎng)， 檢測OD值至0D550約為O. 6時(shí)，加誘導(dǎo)劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度 O. lmmol/L，37°C誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)5小時(shí)。
包涵體洗漆液(2mol/Lurea, 2% Triton X 100, lmmol/L EDTA, 300mmol/NaCl, 50mMTri s-HCl pH 8. 0)重復(fù)洗滌包涵體2次。
每克包涵體加入15ml包涵體溶解液(8M尿素，IOOnM PMSF, 50mM Tris-HCl pH 8. 0，300mmol/L NaCl)，室溫放置3_4h，4000r/min室溫離心lOmin，收集上清液，準(zhǔn)備蛋白質(zhì)純化。
以Qiagen的N1-NTA凝膠、親和層析方法純化蛋白pC2_C4
a)平衡液 1(8M 尿素，300mmol NaCl 50mM Tris_Hcl，pH8. O) 10 個(gè)柱床體積平衡鎳柱
b)包涵體溶解液等柱床體積過柱，夾閉流出口，室溫靜置30min，分次純化全部包涵體溶解液。
c)洗滌液 2(20mmol 咪唑，8M 尿素，300mmol NaCl 50mM Tris-Hcl，ρΗ8· O) 2 個(gè)柱體積洗滌非特異結(jié)合蛋白。
d)洗脫液 3(500mmol 咪唑，8M 尿素，300mmol NaCl 50mM Tris_Hcl，pH8· O) 5 個(gè)柱體積洗脫目標(biāo)蛋白。
e) 10個(gè)柱床三蒸水洗柱后灌注20%乙醇保存于4度冰箱。
SDS-PAGE凝膠電泳分析蛋白純化。結(jié)果見圖3 A5，可見純度很高的目的條帶。
實(shí)施例五蛋白PC2-C4的復(fù)性
純化后蛋白溶解液用洗脫液3 (500mmol咪唑，8M尿素，300mmol NaCl，50mM Tris-Hcl, pH8. O) 3倍稀后裝入透析袋(pierce公司)，配制復(fù)性液(2M尿素，Immol還原型谷胱甘肽，O.1mmol氧化型谷胱甘肽，IOOmmol苯甲基磺酰氟，10 %丙三醇,300mmol NaCl, 50mM Tris-Hcl，pH8.0)置4°C冰柜中預(yù)冷，將按稀釋后蛋白溶解液復(fù)性液=I 15配制復(fù)性液，透析袋水平放置且全部沒入復(fù)性液中，置于4°C搖床緩慢搖動(dòng)，復(fù)性過程中，前 12h，每4h換一次預(yù)冷的復(fù)性液，在12-24h過程中，每6h換一次復(fù)性液，在24h_72h中，每 12h換一次復(fù)性液，共復(fù)性72h，結(jié)束后，按與稀釋后蛋白溶解液體積比=I 1，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液逐步透析去除尿素，每2h換緩沖液一次，至少換6次，及時(shí)離心去除析出蛋白。從復(fù)性液取出透析袋，水平置于干凈玻璃器皿，用聚乙二醇20000 (購自國藥集團(tuán))于4°C透析濃縮，定時(shí)觀察，防止析干，透析袋內(nèi)存留液濃縮至原蛋白溶液體積1/10左右停止?jié)饪s， Iowary法測蛋白濃度。O. 22 μ m —次性濾器過濾除菌,4°C保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例六復(fù)性后蛋白pC2-C4與細(xì)胞表面CD4分子結(jié)合的功能鑒定
各接種IO8個(gè)Jurkat clone E6-1細(xì)胞和Hut78細(xì)胞于6cm培養(yǎng)皿，實(shí)驗(yàn)分以下四組
權(quán)利要求
1.一種重組的新型免疫調(diào)節(jié)蛋白，其特征為該重組蛋白藥物氨基酸片段優(yōu)選人類免疫缺陷病毒的被膜蛋白gpl20，其機(jī)理為促Treg (⑶4+⑶25+調(diào)控T細(xì)胞)活化。
2.如權(quán)利要求1所述的促Treg活化藥物，其靶向片段優(yōu)選gpl20的C2-C4區(qū)。
3.如權(quán)利要求1所述的促Treg活化藥物，其氨基酸序列與SEQID NO :1所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同源性。
4.如權(quán)利要求1所述的促Treg活化藥物，其氨基酸序列與SEQID NO :1所示的氨基酸序列具有至少95%的序列同源性。
5.如權(quán)利要求1所述的促Treg活化藥物，其氨基酸序列為SEQID NO :1所示。
6.—種編碼如權(quán)利要求書I所述的蛋白質(zhì)的核酸序列，其核苷酸序列SEQ ID N0:2具有至少90%的序列同源性。
7.一種編碼如權(quán)利要求書I所述的蛋白質(zhì)的核酸序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO 2 所示。
8.—種載體質(zhì)粒,攜帶有編碼如權(quán)利要求1所述的促treg活化藥物的核苷酸序列。
9.一種重組宿主系統(tǒng)，經(jīng)權(quán)利要求8所述的重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)得到，并用于表達(dá)如權(quán)利要求1所述的促Treg活化藥物。
10.如權(quán)利要求9所述的重組宿主系統(tǒng)可以是脊椎動(dòng)物、昆蟲、植物的細(xì)胞、酵母菌、細(xì)菌或病毒。
11.如權(quán)利要求10所述的重組宿主細(xì)胞，其中酵母菌可以是釀酒酵母、畢赤酵母、念珠菌酵母、漢遜酵母、克魯維亞酵母或裂殖酵母。
12.如權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其中細(xì)菌可以是大腸桿菌。
13.生產(chǎn)如權(quán)利要求1所述的促Treg活化蛋白的方法該方法包括下列步驟包括克隆構(gòu)建gp 120的C2-V3-C3-V4-C4區(qū)cDNA原核表達(dá)載體，在表達(dá)系統(tǒng)中獲得了以包涵體形式的高表達(dá)，并純化獲得純度大于90%的蛋白 PC2-C4。
14.一種藥物組合物，其含有如權(quán)利要求1所述的促Treg活化藥物。
15.如權(quán)利要求1-14所述的促Treg活化藥物，可以加工成凍干粉針或注射液以及其它可以接受的溶液劑型的制劑，可用于全身給藥，如肌注、靜脈點(diǎn)滴、靜脈推注，或者局部給藥，如皮下或病變部位注射；該蛋白也可用于體外細(xì)胞誘導(dǎo)。
16.如權(quán)利要求1-15所述的促Treg活化藥物，用于制備預(yù)防HIV感染、治療自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等免疫介導(dǎo)的相關(guān)疾病、防治腫瘤的藥物。
17.如權(quán)利要求16所述的自身免疫性疾病包括慢性淋巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)、胰島素依賴型糖尿病、重癥肌無力、炎性腸病、尋常天皰瘡、類天皰瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬變、多發(fā)性硬化、急性特發(fā)性多神經(jīng)炎等，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球腎炎、銀屑病、干燥綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、硬皮病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、Wegener肉芽腫病等。
18.如權(quán)利要求16所述的腫瘤包括CD4+的良性和惡性腫瘤，包括淋巴瘤、成人T細(xì)胞白血病、NK母細(xì)胞白血病等。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型免疫調(diào)節(jié)蛋白及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該蛋白為人類免疫缺陷病毒膜分子gp120功能域C2-C4部分的重組分子，本發(fā)明的pC2-C4能同細(xì)胞表面分子CD4分子相結(jié)合，激活和增強(qiáng)外周血靜止CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，為臨床治療自身免疫性疾病、移植相關(guān)疾病及相關(guān)腫瘤提供新的策略。
文檔編號(hào)A61P31/18GK102993277SQ201110266969
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者曾令宇, 徐開林, 曹江, 陳翀, 齊共健, 王東洋, 張倩, 張建軍, 李振宇, 程海, 閆志凌, 桑威, 李德鵬 申請人:徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院