專(zhuān)利名稱(chēng)：以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及乙肝治療性疫苗，特別涉及以HBeAg蛋白和/ 或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗。
背景技術(shù)：
慢性乙肝是危害人類(lèi)健康的全球性問(wèn)題，對(duì)人類(lèi)健康和世界經(jīng)濟(jì)造成極大影響。 乙肝治療性疫苗已成為本世紀(jì)慢性乙肝治療研究的熱點(diǎn)，未來(lái)治療性乙肝疫苗的國(guó)內(nèi)市場(chǎng)有望達(dá)到30億人民幣，且以年15%的速度持續(xù)增長(zhǎng)。因此，發(fā)展乙肝治療性疫苗的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究具有重大的科學(xué)意義和巨大的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效益。目前，國(guó)際上，正在研制的乙肝治療性疫苗主要有大劑量基因工程乙肝疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、免疫復(fù)合物疫苗、抗體化抗原疫苗等。在國(guó)內(nèi)，熊思東、吳玉章研究小組分別研制的乙肝治療性疫苗均已完成或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，并顯現(xiàn)出顯著治療效果，但是， 現(xiàn)有乙肝治療性疫苗大多仍處于研究階段，仍然面臨許多問(wèn)題(1)現(xiàn)有的治療性疫苗臨床研究多集中于利用前S抗原和S抗原，并通過(guò)以免疫原性極強(qiáng)的HBcAg為載體來(lái)激活T、B細(xì)胞應(yīng)答，存在一定的局限性，對(duì)部分患者的治療效果并不滿(mǎn)意；(2)乙肝患者宿主機(jī)體免疫耐受狀態(tài)使得疫苗設(shè)計(jì)難度顯著增加，現(xiàn)有治療性疫苗并不能直接實(shí)現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換，取得滿(mǎn)意治療效果；(3)治療性疫苗的安全性和標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題尚待深入研究。因此，未來(lái)乙肝治療性疫苗的研究應(yīng)綜合分析慢性乙肝患者疾病轉(zhuǎn)歸規(guī)律和免疫耐受機(jī)制、篩選新的免疫原提高乙肝治療性疫苗的免疫原性，優(yōu)化乙肝治療性疫苗設(shè)計(jì)策略及免疫程序、選擇適當(dāng)?shù)淖魟?，合理輔助使用細(xì)胞因子或抗病毒藥，以利于恢復(fù)慢性HBV 感染者的免疫系統(tǒng)的反應(yīng)性、打破機(jī)體的免疫耐受狀態(tài)、實(shí)現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)換、獲得保護(hù)性抗-HBs抗體，成為當(dāng)前乙肝治療性疫苗研究的首要問(wèn)題。完整乙型肝炎病毒即Dane顆粒，由外膜、核衣殼組成。核衣殼內(nèi)含有一個(gè)環(huán)狀的 DNA分子、DNA多聚酶、具有蛋白激酶活性的DNA結(jié)合蛋白。外膜攜帶乙肝表面抗原(HBsAg)， 核殼攜帶乙肝核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)。HBV基因組有S、C、X、P、前-前-S和前-X 6個(gè)基因。HBeAg和HBcAg均由HBV的0RF-C編碼。HBcAg具有極強(qiáng)免疫原性和抗原性(既是B細(xì)胞依賴(lài)抗原，也是T細(xì)胞非依賴(lài)抗原)，其抗原性較HBeAg強(qiáng)100倍，是唯一能引發(fā)顯著免疫反應(yīng)的HBV抗原，能誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL，并輔助保護(hù)性抗原(如S、M、L抗原)產(chǎn)生體液免疫和增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，幾乎所有HBV感染者均會(huì)出現(xiàn)抗-HBc抗體。血清HBeAg是分泌性非顆粒狀病毒衣殼蛋白，與HBcAg約75 %氨基酸序列相同，較 HBcAg在羧基端少了 34個(gè)氨基酸，以Val 149為羧基末端，位于前C區(qū)-7位的半胱氨酸與C區(qū)中61位的半胱氨酸形成的二硫鍵是HBeAg區(qū)別于HBcAg的獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)，也是使HBeAg具有與HBcAg完全不同的抗原表位和免疫反應(yīng)性的原因。HBeAg是乙肝病毒特有的免疫耐受因子，通過(guò)下調(diào)TLR2表達(dá)引起宿主免疫耐受 (Stephen Locarnini)。此外，HBeAg還能能阻斷CTL，抑制宿主T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，將免疫攻擊從感染的肝細(xì)胞移開(kāi)，從而形成對(duì)HBV感染的免疫耐受。而乙肝患者的免疫耐受被認(rèn)為是慢性乙肝遷延不愈、并出現(xiàn)不良結(jié)局的重要原因之一，也是治療上最難解決的問(wèn)題。 以HBeAg陽(yáng)性、HBVDNA滴度高為特征的圍產(chǎn)期野生型C基因型HBV感染患者仍是我國(guó)慢性乙肝的主要患者群體。HBV感染后的自然病程和治療過(guò)程中，其病程可分為潛伏期、癥狀期、清除期、免疫期四個(gè)階段，其轉(zhuǎn)歸與病毒的基因型、易突變性、是否整合，宿主性別、營(yíng)養(yǎng)、免疫力、感染年齡、是否合并其他嗜肝病毒感染或酗酒，是否接受抗病毒治療、免疫調(diào)節(jié)治療等多種因素有關(guān)。一旦出現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換，機(jī)體產(chǎn)生抗-HBe抗體，就意味著宿主免疫反應(yīng)增強(qiáng)，病程進(jìn)入清除期，病毒復(fù)制停止。在此基礎(chǔ)上，如果出現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)換(血清HBsAg轉(zhuǎn)陰)，則說(shuō)明病程進(jìn)入免疫期，產(chǎn)生保護(hù)性抗-HBs抗體，體內(nèi)病毒被徹底清除?？梢?jiàn)，HBeAg血清轉(zhuǎn)換已經(jīng)成為乙肝患者良好轉(zhuǎn)歸的里程碑事件，HBeAg血清轉(zhuǎn)換，并產(chǎn)生抗-HBe抗體是判斷病情發(fā)展趨勢(shì)和藥物療效的一個(gè)重要指標(biāo)，是最終徹底清除 HBV、根治乙肝的基礎(chǔ)，也是慢性乙肝治療的中期目標(biāo)。因此，阻斷HBeAg的免疫耐受作用， 打破機(jī)體的免疫耐受狀態(tài)，有可能成為慢性乙肝治療之關(guān)鍵和新靶點(diǎn)。所以，實(shí)現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換應(yīng)該作為乙肝治療性疫苗設(shè)計(jì)的首要目標(biāo)，而以HBeAg作為免疫原制備乙肝治療性疫苗應(yīng)該是實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的直接途徑。與此同時(shí)，伴隨抗原組學(xué)、抗原表位組學(xué)、免疫組學(xué)、晶體X線衍射、低溫電子顯微鏡技術(shù)的迅猛發(fā)展和推廣，為深入研究HBeAg空間結(jié)構(gòu)、分析其抗原表位、提供了有力的技術(shù)支撐。納米技術(shù)是20世紀(jì)80年代末興起的科學(xué)技術(shù)。特別是近十多年來(lái)，快速發(fā)展的納米技術(shù)以其超乎想象的影響力向各個(gè)領(lǐng)域滲透，在醫(yī)藥研究領(lǐng)域顯示出了出人意料的應(yīng)用潛力和作用。納米疫苗已經(jīng)作為一種新型疫苗制備技術(shù)在研發(fā)預(yù)防和治療疫苗領(lǐng)域也受到關(guān)注，在提升疫苗免疫原性方面顯示出巨大的應(yīng)用前景。近年多種不同形式的納米疫苗已經(jīng)出現(xiàn)。例如，口服疫苗采用生物可降解納米顆粒來(lái)靶向特殊樹(shù)突細(xì)胞受體的特定抗原。 Nanomed公司最近采用它的專(zhuān)利納米模板工程技術(shù)開(kāi)發(fā)靶向樹(shù)突細(xì)胞的治療疫苗，以產(chǎn)生對(duì)艾滋病病毒-1 (HIV-I)的免疫應(yīng)答。初步數(shù)據(jù)提示，用新納米顆粒輸送蛋白質(zhì)可以明顯增強(qiáng)免疫應(yīng)答。此外，一些納米顆粒似乎可起佐劑作用，提高疫苗的療效。Biosante公司于2007年7月報(bào)告，它的磷酸鈣(CaP)納米顆?；魟〣iovant有助于開(kāi)發(fā)新的抗H5W 流感株疫苗。嚙齒動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)顯示，其免疫應(yīng)答比單獨(dú)用H5W抗原大4倍。一種新型納米乙肝疫苗也已經(jīng)在美國(guó)問(wèn)世。顯然，納米技術(shù)的發(fā)展也為新型乙肝治療性疫苗的研究提供新的技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于將HBeAg血清轉(zhuǎn)換作為乙肝治療性疫苗設(shè)計(jì)的目標(biāo)，提供以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗，該疫苗能夠誘發(fā)針對(duì)HBeAg 蛋白或其抗原表位的抗體。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗，是由作為免疫原的HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽，與輔料混合而制成；所述的HBeAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；所述的HBeAg抗原表位多肽為SEQ ID NO :2 SEQ ID NO :11所示的一種或幾種。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗，是將HBeAg 蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽與其質(zhì)量0. 1 10倍的AL(OH)3,在pH6. 8的磷酸鹽緩沖液中混勻，再加入AL(OH)3質(zhì)量0. 1 2倍的甘露醇、蔗糖、白蛋白、水解明膠、乳糖或山梨醇混勻。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗，是將HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽通過(guò)雙乳液體系吸附于聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)， 形成粒徑為0. 5 10 μ m的納米微球，聚乳酸-聚乙二醇共聚物載藥量大于15 %、包封率大于 80%。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗，是HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽吸附于粒徑為50 IOOnm的納米Al (OH)3溶膠當(dāng)中，HBeAg 蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽納米Al (OH)3溶膠的質(zhì)量比=10 20 μ g Img,納米 Al (OH) 3溶膠的吸附率大于10 μ g/lmg。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗，是HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽分散于油相中，然后制成粒徑為10 30nm的油包水型納米顆粒，油相與水相的體積比為1 3 5 ；油相為Span-20 poloxamer 188 大豆油= 80 180 100的質(zhì)量比混合，水相為雙蒸水；HBeAg蛋白與油相的質(zhì)量比為1 200 300。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗，是HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽與聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)按照1 20 50的質(zhì)量比在有機(jī)溶劑中攪拌乳化，形成水包油包水型復(fù)乳，然后室溫下去除有機(jī)溶劑，再用水洗滌之后冷凍干燥所得到的粒徑為100 400nm的微球，包封率大于40. 0%。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗，是HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽吸附于殼聚糖顆粒中，形成粒徑為100 200nm的納米顆粒， HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽殼聚糖的質(zhì)量比1 3 5。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗，是HBeAg抗原表位多肽偶聯(lián)于鑰孔帽貝血藍(lán)蛋白，HBeAg抗原表位多肽鑰孔帽貝血藍(lán)蛋白的質(zhì)量比 1 3000 2 30 ；HBeAg抗原表位多肽為SEQ ID NO 2 11中的一種或幾種。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果通過(guò)系統(tǒng)分析慢性肝炎患者機(jī)體免疫耐受機(jī)制和治療現(xiàn)狀，本發(fā)明提出直接以 HBeAg為免疫原，應(yīng)用納米技術(shù)制備乙肝治療性HBeAg納米疫苗的制備，以提高HBeAg的免疫原性和免疫效果，這是實(shí)現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換的最佳策略和直接途徑。本發(fā)明采用真核表達(dá)系統(tǒng)或非真核表達(dá)系統(tǒng)制備HBeAg蛋白、采用人工合成法， 優(yōu)選Fmoc固相合成法人工合成HBeAg抗原表位多肽，直接將HBeAg蛋白和(或)HBeAg抗原表位多肽單獨(dú)和(或)混合作為主要免疫原用于乙肝治療性疫苗的制備。該乙肝治療性疫苗既可是蛋白疫苗、多肽疫苗，也可是新型納米疫苗。本發(fā)明提供的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗能夠誘發(fā)BALB/c小鼠產(chǎn)生高效價(jià)抗-HBe抗體?？贵w效價(jià)從免疫后3周即開(kāi)始升高，此后所免疫次數(shù)增加而繼續(xù)升高。在進(jìn)行4次免疫之后，小鼠已經(jīng)可以產(chǎn)生效價(jià)較高的抗體，這樣就有利于實(shí)現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。實(shí)施例1HBeAg蛋白的表達(dá)和純化1. 1重組pcDNA-HBeAg真核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)HBeAg基因序列(1871-2347基因序列，全長(zhǎng)477bp)和pcDNA3. 1真核表達(dá)載體設(shè)計(jì)引物，在上游引物Pl中引入EcoR V酶切位點(diǎn)，在下游引物P2中引入Xho I酶切位點(diǎn)，所設(shè)計(jì)的引物具體序列為Jliit弓L Pl :cagatatcca gggaatggtg tccaagctgt gccttgggtg g41 ；下游弓丨物 P2 :gactcgagcg ttaaacaaca gtagtttccg g31;以乙肝“大三陽(yáng)”病人血清中分離的HBV病毒的DNA為模板，用上述引物PCR擴(kuò)增 HBeAg基因序列，測(cè)序正確后將上述基因產(chǎn)物通過(guò)EcoRV和Xho I酶切位點(diǎn)克隆入pcDNA3. 1 真核表達(dá)載體，構(gòu)建得到pcDNA-HBeAg重組表達(dá)載體；并用EcoRV/Xho I雙酶切、PCR及基因測(cè)序證實(shí)重組載體構(gòu)建正確。1. 2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞用含10%胎牛血清的RP2MI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前2周進(jìn)行G418 最小致死濃度試驗(yàn)。于轉(zhuǎn)染前18h，將處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞均按每孔約為2X IO5個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，至細(xì)胞密度大約為60%時(shí)，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用無(wú)血清RP2MI1640 培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，用Cellfectin進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過(guò)程具體為配置以下溶液A液(5 μ 1重組的pcDNA-HBeAg質(zhì)粒加入95 μ 1滅菌去離子水)與 B液(6 μ 1 Cellfectin加入94 μ 1滅菌去離子水)輕輕混勻，室溫放置30min ；用無(wú)血清、 無(wú)抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次后，逐滴加入AB混合液，培養(yǎng)IOh后更換完全培養(yǎng)基共培養(yǎng)3天(具體方法參照invitrogen公司eelIfectin操作手冊(cè))。免疫印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)分別檢測(cè)培養(yǎng)上清和CHO細(xì)胞中HBeAg的表達(dá) (一抗為鼠抗-HBe單克隆抗體)。1.2. 1免疫組化檢測(cè)HBeAg的表達(dá)收集pcDNA-HBeAg重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，常規(guī)方法制備細(xì)胞爬片， 4%多聚甲醛固定，5%過(guò)氧化氫孵，10%兔血清封閉，滴加1 100稀釋抗-HBe單克隆抗體，4 °C過(guò)夜，滴加40 μ 1生物素標(biāo)記的二抗(羊抗鼠)，37 °C孵育30miη，滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物40μ 1，37°C孵育20min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片；光學(xué)顯微鏡觀察融合蛋白的表達(dá)和亞細(xì)胞定位。1. 2. 2 Western blot 檢測(cè) HBeAg 蛋白的表達(dá)
Dffestern blot檢測(cè)培養(yǎng)上清中HBeAg蛋白的表達(dá)分別收集培養(yǎng)上清熱變性后，取10 μ 1上清行SDS-PAGE電泳，利用Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶室溫封閉，1 200稀釋的抗-HBeAg單克隆抗體孵育，1 1000 稀釋的HRP-IgG孵育，TBST洗膜，DAB顯色。2) Western blot檢測(cè)CHO細(xì)胞中HBeAg蛋白的表達(dá)選擇篩選獲得的陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞(密度為IO6個(gè)/ml)和24h 表達(dá)上清各25 μ 1，加入等量2 X SDS凝膠加樣緩沖液，行SDS-PAGE電泳，利用Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶室溫封閉，1 200稀釋的抗-HBeAg單克隆抗體孵育，1 1000 稀釋的HRP-IgG孵育，TBST洗膜，DAB顯色。1. 3穩(wěn)定表達(dá)HBeAg的CHO細(xì)胞的篩選確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后，根據(jù)G418最小致死濃度試驗(yàn)，用含800mg/mL G418的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，3-4d后當(dāng)對(duì)照組細(xì)胞大部分死亡時(shí)，改用含600mg/mLG418的選擇培養(yǎng)基篩選，每 2-3d換液傳代，經(jīng)過(guò)14d培養(yǎng)后，采用有限稀釋法，將CHO細(xì)胞移入培養(yǎng)板內(nèi)，用G418持續(xù)篩選，適時(shí)更換培養(yǎng)液并傳代。直至檢測(cè)出穩(wěn)定表達(dá)HBeAg的CHO細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并傳代培養(yǎng)。1. 4重組HBeAg蛋白的純化采用純化的天然抗-HBe抗體，利用SPA標(biāo)記的磁珠免疫共沉淀法分離，收集重組 CHO細(xì)胞表達(dá)的HBeAg蛋白；并用SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白純度，BCA法測(cè)定蛋白濃度，分裝凍存 (_80°C冰箱)。實(shí)施例2. HBeAg蛋白抗原表位肽的體外合成和純化SEQ ID NO :2 11所示的HBeAg抗原表位多肽為長(zhǎng)度為8 32個(gè)氨基酸殘基的多肽，采用Fmoc固相多肽技術(shù)來(lái)完成其制備(也可委托專(zhuān)門(mén)的合成公司來(lái)完成)采用Fmoc固相多肽合成技術(shù)，在PS3全自動(dòng)固相多肽合成儀上，以Ν_ α -Fmoc保護(hù)的氨基酸為原料，Rink氨基樹(shù)脂為載體，20 %哌啶DMF溶液為脫保護(hù)劑，HBTU為肽鍵縮合劑，按已知序列從C端到N端的順序依次偶聯(lián)合成。合成結(jié)束后從多肽合成儀PS3上取下反應(yīng)瓶，放到通風(fēng)櫥中。用DMF將反應(yīng)瓶中的肽-樹(shù)脂全部沖到Poly-Pr印層析柱中。用甲醇沖洗樹(shù)脂8次，除去DMF。氮?dú)獯蹈珊笥昧呀庖?TFA 苯甲硫醚苯甲醚二巰基乙烷的體積比為90 5 2 3)將合成多肽從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，同時(shí)脫去所有保護(hù)基團(tuán)。收集溶有合成肽的裂解液，用氮?dú)庑⌒拇等チ呀庖褐械腡FA直至殘余裂解液體積到2mL左右，然后用-20°C的無(wú)水乙醚使抗原肽沉淀，離心收集沉淀，用氮?dú)獯等ヒ颐?，即得合成肽粗品。合成肽粗品?jīng)高壓液相反相層析柱C18分離純化，收集主峰，冷凍干燥后，得到純化的合成肽。對(duì)合成的蛋白多肽進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，然后將質(zhì)譜分析的荷質(zhì)比與預(yù)測(cè)的理論分子量進(jìn)行比較。合成肽再經(jīng)反相高效液相色譜分析其純度，色譜條件如下色譜柱Jupiter Proteo (250mmX 4. 6mm，4IU)，流動(dòng)相 A :0. 1% TFA/水流動(dòng)相 B :0. 1% TFA/ 乙腈；線性梯度15% B — 40% B，25min ；柱溫:35°C ；流速1. Omol/min ；檢測(cè)波長(zhǎng):220nm。實(shí)施例3鋁佐劑-HBeAg蛋白疫苗的制備取質(zhì)量濃度為5%的硫酸鋁溶液250ml，在強(qiáng)烈攪拌下加入5%氫氧化鈉溶液100ml，用生理鹽水離心洗滌沉淀2次，再將沉淀懸入生理鹽水中使總體積達(dá)250ml。(也可直接采用市售鋁佐劑(AL(OH)3)。取HBeAg蛋白(20 μ g/mL) 5 100 μ g作為免疫原，加入等體積含鋁佐劑 AL(0H)3(2mg/ml)的磷酸鹽緩沖液中(pH6. 8)，4°C攪拌混勻2 3h，再加入AL(OH)3質(zhì)量 0. 1 2倍的甘露醇、蔗糖、白蛋白、水解明膠、乳糖或山梨醇中的至少一種而制備成乙肝治療性蛋白疫苗。實(shí)施例4. PLEG-HBeAg疫苗的制備采用雙乳液(W1/0/W2)體系溶劑抽提法在無(wú)菌條件下，將聚乳酸一聚乙二醇共聚物(PLA-PEG copolymers, PLEG)共聚物溶于二氯甲烷，然后加入HBeAgOffieAg與PLEG的質(zhì)量比為1 1.5 3 4. 5)并用超聲波乳化成乳液，得到初乳(W1/0)；再將初乳加入0.3%聚乙烯醇水性溶液中，機(jī)械快速攪拌12h得到穩(wěn)定乳液(W1/0/W2)。在室溫下高速攪拌直至二氯甲烷完全揮發(fā)，然后用微孔濾膜抽濾，分離離心，用蒸餾水洗滌3次，冷凍干燥。也可用異丙醇水溶液溶解有機(jī)溶劑(二氯甲烷)，分層之后離心分離除去，冷凍干燥得到微球(即聚乳酸一聚乙二醇共聚物包裹的HBeAg蛋白)。應(yīng)用掃描電子顯微鏡觀察微球表面形態(tài)，并通過(guò)檢測(cè)蛋白含量推算封包率，聚乳酸-聚乙二醇共聚物載藥量應(yīng)大于15%、包封率大于80%。實(shí)施例5 納米鋁佐劑-HBeAg疫苗的制備1)納米鋁佐劑的化學(xué)制備取質(zhì)量比為1 1 1 4的苯扎溴銨、正辛醇、環(huán)己烷于燒杯中，在25°C、磁力攪拌下，再加入等體積的lmol/L A1C13溶液攪拌lOmin，形成苯扎溴銨-正辛醇-環(huán)己烷-A1C13溶液體系，然后用高速分散均質(zhì)機(jī)攪拌，使其乳化成為微乳液。然后將微乳液倒入有蓋的反應(yīng)瓶加熱攪拌，緩慢逐滴加入過(guò)量氨水保持體系的PH 值在8 10，蓋上蓋子，反應(yīng)2 3h后，加入丙酮破乳，離心棄上清液，用950g/kg的無(wú)水乙醇和去離子水共洗滌沉淀3次，最后采用冷凍干燥法(-70°C )或真空干燥法(4°C )，將沉淀干燥后得到膨松的納米Al (OH) 3干凝膠。然后將納米Al (OH) 3干凝膠溶解在水中，并用超聲波分散，在水溶液中呈分散狀態(tài)；電子顯微鏡觀察測(cè)量的方法測(cè)定納米粒經(jīng)，獲得粒徑為50 IOOnm納米的鋁佐劑。2)納米鋁佐劑疫苗的制備以水為溶劑，配成濃度為1 5mg/ml的納米鋁佐劑溶劑，超聲波分散納米鋁佐劑溶液20min之后，再與等體積的濃度為20yg/mL的HBeAg蛋白溶液(用蒸餾水稀釋)混合， 4°C條件下吸附一周，再以15000r/min離心30min，所得到的沉淀即為納米鋁佐劑-HBeAg 疫苗；采用蛋白定量法檢測(cè)上清中蛋白濃度，封包率大于90%，納米Al (0H)3溶膠的吸附率大于 10 μ g/lmg。實(shí)施例6 油包水型HBeAg納米疫苗的制備1)采用磁力超聲法制備油包水型HBeAg納米疫苗將HBeAg蛋白1.0mg、80g/L Span-20 (司盤(pán)-20，山梨醇酐單月桂酸酯)、180g/L poloxamer 188 (泊洛沙姆188)和0. 6mL大豆油，雙蒸水調(diào)整體積為2. 5mL,混合均勻得到油相；在3000r/min磁力攪拌下，將油相逐滴加入7. 5mL雙蒸水水相中混合；再將混合物移至真空高速剪切乳化機(jī)上，在0. 7kpa真空下，23，OOOr/min，高速剪切40min，溫度控制在80°C 以下；冰浴下40kHz超聲5min，反復(fù)3次使混合物完全乳化，即得到油包水型HBeAg納米疫苗(0. lg/L)。0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌后，于4°C保存。2) HBeAg納乳滴的性質(zhì)鑒定將制成的納米乳滴稀釋于生理鹽水中，取100 μ L滴于400目銅網(wǎng)上，磷鎢酸染色， 透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)，將采集的圖象經(jīng)計(jì)算機(jī)圖象分析求得納米乳滴的平均粒徑為 10 30nm。3)包裹率、載藥量及穩(wěn)定性測(cè)定采用S印hedex-GlOO凝膠層析法，收集游離的HBeAg用分光光度計(jì)測(cè)定A280值。 同時(shí)制備不同濃度的HBeAg標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品，用分光光度計(jì)測(cè)定其光度值，并繪制濃度與光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線為依據(jù)，計(jì)算出納米顆粒中游離HBeAg的含量。包裹率按公式計(jì)算包裹率=(W總-W游)/W總X 100 %。其中W總為制備時(shí)所用HBeAg的總量，W游為游離的復(fù)合抗原的量。結(jié)果顯示包裹率大于80%，于4°C放置6個(gè)月或3000r/min IOmin離心，無(wú)分層和沉淀現(xiàn)象。4)油包水型HBeAg納米疫苗生物安全性檢測(cè)將所制備的疫苗肌肉注射免疫小鼠后，在自然狀態(tài)下，觀察免疫小鼠疫苗吸收時(shí)間，有無(wú)局部反應(yīng)或全身不良反應(yīng)，注射部位肌肉損傷情況。要求無(wú)肌肉壞死、肉芽腫、潰爛等損傷性反應(yīng)。實(shí)施例7 =PLGA-HBeAg納米疫苗的制備具體采用物理方法制備，其具體步驟為取50mg聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)微球(LA GA = 50 50，相對(duì)分子質(zhì)量 15000)溶于ImL 二氯甲烷(DCM)中，然后加入ImL HBeAg蛋白溶液(lmg/mL)，超聲Imin (功率為100W)，可見(jiàn)乳白色油包水(W1/0)型初乳形成；再加入2g/L聚乙烯醇(PVA)溶液2mL， 在冰浴條件下再次超聲5 20min(功率為55W)，形成水包油包水(W1/0/W2)型復(fù)乳，然后將此復(fù)乳轉(zhuǎn)移至50mL去離子水(pH4.6)中，室溫下攪拌4h使有機(jī)溶劑完全揮發(fā)，10000 X g 離心20min，并收集沉淀。將所得到沉淀用雙蒸水重新洗滌、分散，置于低溫冷凍干燥機(jī)中 (-800C )干燥40h，收集干燥的粉末(大小為100 400nm的微球，包封率大于40. 0% )，得到PLGA-HBeAg納米疫苗，4°C保存。參照實(shí)施例6進(jìn)行納米粒子形態(tài)、大小、載藥量，生物安全性的檢測(cè)。實(shí)施例8 殼聚糖-HBeAg納米疫苗的制備88. 5%脫乙酰度殼聚糖與生理鹽水配成10g/L的溶液，再經(jīng)超聲(輸出功率80Hz) 處理2次，每次5min，間隔lmin，以50 X g離心IOmin后取其上清，并以400目網(wǎng)篩過(guò)濾，再以1400Xg離心IOmin后收集其沉淀物，即為殼聚糖小顆粒。取質(zhì)量濃度為的殼聚糖的生理鹽水溶液(β - (1-4)2-氨基2-脫氧-D-葡聚糖，CTS)，用0. lmol/L的NaAC-HAC緩沖液稀釋至0. 2 %待用，再將殼聚糖溶液經(jīng)0. 22 μ m濾膜過(guò)濾，取IOmL于干燥試管中待用。取3mL HBeAg蛋白原液(濃度為20μ g/mL)與3mL Na2S04溶液(濃度為50mmol/ L)混勻；在混懸振動(dòng)器震動(dòng)下，向裝有IOmL 0. 2%的殼聚糖溶液中加入3mLNa2S04混合后的疫苗稀釋液，再逐滴加入三聚磷酸鈉550 μ L，此時(shí)溶液呈現(xiàn)懸濁狀；室溫?cái)嚢鐸Omin后，進(jìn)行超聲(輸出頻率80Hz)處理2次，每次5min，間隔lmin，)處理后，以10000r/min的速度高速離心20min，所得沉淀為殼聚糖-HBeAg納米疫苗(粒徑為100 200nm)。將其用 0.9% NaCl溶液重懸備用，參照實(shí)施例6進(jìn)行納米粒子形態(tài)、大小，載藥量，生物安全性檢測(cè)。在上述實(shí)施例3 8當(dāng)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠?qū)⑵渲械腍BeAg蛋白替換為 HBeAg抗原表位多肽，以制備各種相應(yīng)的HBeAg抗原表位多肽疫苗。實(shí)施例9 =KLH-HBeAg抗原表位多肽疫苗的制備HBeAg抗原表位多肽與載體蛋白的偶聯(lián)A液15mg鑰孔帽貝血藍(lán)蛋白(KLH)溶于2ml甘油；B液5 100 μ g HBeAg抗原表位多肽(SEQ ID NO :2 11的一種，或者幾種的任意比例混合)溶于Iml 二甲基亞砜；將A液和B液混合后加入偶聯(lián)劑碳二亞胺(EDS)5mg振蕩Ih后，置于磁力攪拌器上攪拌過(guò)夜，次日層析分離純化KLH偶聯(lián)的HBeAg抗原表位多肽，收集合并含蛋白的洗脫液， 測(cè)定蛋白濃度，按照5 100μ g/ml的抗原濃度，Iml劑量分裝，置_20°C保存。疫苗的免疫效果本發(fā)明獲得的HBeAg蛋白(SEQ ID NO 1)和HBeAg抗原表位多肽(SEQ ID N0: 2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、 SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11)作為免疫原并采用上述實(shí)施方案中適宜的疫苗制備方法或其他方法制備乙肝治療性疫苗，該疫苗用于HBeAg陽(yáng)性乙肝患者的生物免疫治療，能夠誘發(fā)患者產(chǎn)生抗-HBe抗體，現(xiàn)實(shí)乙肝患者HBeAg血清轉(zhuǎn)換，達(dá)到最終治愈乙肝的目的。上述實(shí)施例描述的方法制備的乙肝治療性HBeAg蛋白/多肽疫苗的免疫效果，其中以CHO細(xì)胞表達(dá)并純化的HBeAg蛋白(SEQ ID NO 1)為抗原檢測(cè)實(shí)施例3_9描述的方法制備的乙肝治療性HBeAg蛋白(多肽)疫苗的免疫效果，具體方法如下1)動(dòng)物免疫BALB/c小鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組(每個(gè)疫苗可分為1組)和對(duì)照組，每組4只，采用背部皮下多點(diǎn)注射方式免疫動(dòng)物，每次注射100 μ L，疫苗當(dāng)中所包含的免疫原總量為5 μ g， 對(duì)照組接種含相應(yīng)佐劑的PBS溶液。第1次接種后，2周后加強(qiáng)1次；以后每4周接種1次，共接種4次。從第2次接種開(kāi)始，每次接種后1周尾靜脈取血，第4次免疫接種后1周眼球后靜脈采血，觀察抗體含量的變化。2) ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)常規(guī)方法分離血清，倍比稀釋后加入已包被HBeAg蛋白的96孔ELISA板(采用常規(guī)方法以實(shí)施例1所述的方法制備純化的HBeAg蛋白為抗原，包被ELISA板)。37°C孵育 2h后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(l 2000)，37°C孵育lh，充分洗滌后加入TMB液反應(yīng)5min，2mol/LH2S04終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)490nm下測(cè)定每孔A值。通過(guò)與對(duì)照組比較，計(jì)算抗體效價(jià)，結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示采用上述實(shí)施例所提供的方法制備的以HeAg蛋白或HBeAg抗原表位肽為免疫原的乙肝治療性疫苗能夠誘發(fā) BALB/c小鼠產(chǎn)生高效價(jià)抗-HBe抗體。抗體效價(jià)從免疫后3周即開(kāi)始升高，此后所免疫次數(shù)增加而繼續(xù)升高，第4次免疫后一周，血清抗-HBe抗體效價(jià)ELISA檢測(cè)結(jié)果如表1所示?？梢钥闯鲈谶M(jìn)行4次免疫之后，小鼠已經(jīng)可以產(chǎn)生效價(jià)較高的抗體，這樣就有利于實(shí)現(xiàn)HBeAg 血清轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生保護(hù)性抗-HBs抗體。表1 HBeAg蛋白/多肽疫苗免疫之后的血清抗體效價(jià)
HBeAg蛋白/多肽疫苗類(lèi)型
抗原
劑量 (昭/只/次)
第4次免疫后血清抗-HBe抗體效價(jià)最低效價(jià)最高效價(jià)
鋁佐劑-HBeAg蛋白疫苗 PLEG-HBeAg 疫苗納米鋁佐劑-HBeAg疫苗油包水型HBeAg納米疫苗 PLGA-HBeAg納米疫苗殼聚糖-HBeAg納米疫苗
KLH-HBeAg多肽疫苗
HBeAg蛋白 HBeAg蛋白 HBeAg蛋白 HBeAg蛋白 HBeAg蛋白 HBeAg蛋白 HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN02) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN03) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN04) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN05) HBeAg抗原表位多肽
(SEQTDN06) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN07) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN08) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN09) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDNOilO) HBeAg抗原表位多肽 (SEQIDNO:ll)
4000 8000 8000 8000 8000 8000
16000 32000 32000 32000 32000 32000
1:8000 >1:16000
1:8000 >1:16000
1:8000 >1:16000
1:8000 >1:16000
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權(quán)利要求
1.以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗，其特征在于，是由作為免疫原的HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽，與輔料混合而制成；所述的HBeAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO=I所示；所述的HBeAg抗原表位多肽為SEQ ID NO 2 SEQ ID NO 11所示的一種或幾種。
2.如權(quán)利要求1所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗， 其特征在于，是將HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽與其質(zhì)量0. 1 10倍的AL (OH)3, 在pH6. 8的磷酸鹽緩沖液中混勻，再加入AL(OH)3質(zhì)量0. 1 2倍的甘露醇、蔗糖、白蛋白、 水解明膠、乳糖或山梨醇混勻。
3.如權(quán)利要求1所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗， 其特征在于，是將HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽通過(guò)雙乳液體系吸附于聚乳酸_聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)，形成粒徑為0. 5 10 μ m的納米微球，聚乳酸-聚乙二醇共聚物載藥量大于15%、包封率大于80%。
4.如權(quán)利要求1所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗， 其特征在于，是HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽吸附于粒徑為50 IOOnm的納米 Al (OH)3溶膠當(dāng)中，HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽納米Al (OH) 3溶膠的質(zhì)量比= 10 20 μ g 11^，納米々1(0!1)3溶膠的吸附率大于1(^8/11^。
5.如權(quán)利要求1所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗，其特征在于，是HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽分散于油相中，然后制成粒徑為10 30nm的油包水型納米顆粒，油相與水相的體積比為1 3 5;油相為 Span-20 poloxamer 188 大豆油=80 180 100的質(zhì)量比混合，水相為雙蒸水； HBeAg蛋白與油相的質(zhì)量比為1 200 300。
6.如權(quán)利要求1所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗， 其特征在于，是HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽與聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA) 按照1 20 50的質(zhì)量比在有機(jī)溶劑中攪拌乳化，形成水包油包水型復(fù)乳，然后室溫下去除有機(jī)溶劑，再用水洗滌之后冷凍干燥所得到的粒徑為100 400nm的微球，包封率大于 40. 0%。
7.如權(quán)利要求1所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗， 其特征在于，是HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽吸附于殼聚糖顆粒中，形成粒徑為 100 200nm的納米顆粒，HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽殼聚糖的質(zhì)量比1 3 5。
8.如權(quán)利要求1所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗， 其特征在于，是HBeAg抗原表位多肽偶聯(lián)于鑰孔帽貝血藍(lán)蛋白，HBeAg抗原表位多肽鑰孔帽貝血藍(lán)蛋白的質(zhì)量比1 3000 2 30 ；HBeAg抗原表位多肽為SEQ ID NO :2 11中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作為免疫原的疫苗，是由作為免疫原的HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽，與輔料混合而制成。本發(fā)明提出直接以HBeAg為免疫原，應(yīng)用納米技術(shù)制備乙肝治療性HBeAg納米疫苗的制備，以提高HBeAg的免疫原性和免疫效果，是實(shí)現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換的最佳策略和直接途徑。
文檔編號(hào)A61P31/20GK102327611SQ201110269710
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者劉紅利, 李宗芳, 楊軍, 蘇寶山, 陳曉黎 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)