專利名稱：用于治療眼新血管疾病的組合治療的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及眼科學和醫(yī)學領域。更具體地講，本發(fā)明涉及采用能抑制血小板衍生生長因子(PDGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的試劑的組合治療眼的新血管疾病。
背景技術：
血管發(fā)生，又被稱作新生血管形成，包括由現(xiàn)存的血管形成新枝(sprout)，以及它們侵入周圍的組織。一種相關的過程，血管發(fā)生(vasculogenesis)包括業(yè)已存在于整個組織中的內(nèi)皮細胞和成血管細胞的分化，以及它們隨后連接在一起以便形成血管。血管發(fā)生廣泛出現(xiàn)在發(fā)育期間，并且還出現(xiàn)在創(chuàng)傷愈合期間的健康身體內(nèi)，以便在損傷或傷害之后恢復血液流向組織。不過，血管發(fā)生也與癌和腫瘤形成相關。實際上， 腫瘤組織中血管的量是乳腺癌(Weidner 等，(1992) J. Natl. Cancer Inst. 84 :1875-1887)、 前列腺癌(Weidner 等，(1993) Am. J. Pathol. 143 :401-409)、腦腫瘤(Li 等，(1994) Lancet 344 :82-86)和黑素瘤 O7Oss 等，(1996)Cancer Res. 56 =2900-2903)的有力的消極預后指標。最近發(fā)現(xiàn)，血管發(fā)生與許多醫(yī)學領域的其他疾病狀態(tài)相關，包括風濕病學、皮膚病學、 心臟病學和眼科學。具體地講，不希望的或病理學組織特異性血管發(fā)生與某些特殊疾病狀態(tài)相關，包括類風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化和銀屑病(參見例如，F(xiàn)an等，(19%)Trends Pharmacol. Sci. 16 :57 ；和 Folkman(1995)Nature Med. 1 :27)。另外，血管通透性的改變被認為在正常和病理學生理過程中起著作用(Cullinan-Bove等，(1993)Endocrinol. 133 829;Senger 等，(1993) Cancer and Metastasis Reviews 12:303)。盡管血管生成過程在上述每一種疾病中都可能與發(fā)育血管發(fā)生和腫瘤血管發(fā)生共有很多特征，但是各自可能具有由于周圍細胞的影響產(chǎn)生的特殊的特征。若干眼疾病涉及血管發(fā)生的改變。例如，糖尿病性視網(wǎng)膜病，是導致成年人失明的第三大原因(在美國占失明人數(shù)的幾乎7%)，與廣泛的血管生成事件相關。非增殖性視網(wǎng)膜病伴隨著視網(wǎng)膜內(nèi)的周細胞的選擇性喪失，并且它們的喪失導致了相關毛細血管的擴張，并且導致了血流的增加。在擴張的毛細血管中，內(nèi)皮細胞增殖，并且形成外翻，它形成微動脈瘤，并且相鄰的毛細血管被阻塞，從而微動脈瘤周圍的視網(wǎng)膜區(qū)域沒有被灌注。最終， 支路血管出現(xiàn)在相鄰的微動脈瘤區(qū)域之間，并且可以看到具有微動脈瘤的早期糖尿病性視網(wǎng)膜病和無灌注的視網(wǎng)膜區(qū)域的臨床圖像。微動脈瘤泄漏，并且毛細血管可能出血，導致滲出物和出血。一旦確定了背景糖尿病性視網(wǎng)膜病的起始階段，所述狀況會發(fā)展數(shù)年時間段， 發(fā)展成增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病，并且導致大約5%的失明病例。當視網(wǎng)膜的某些區(qū)域持續(xù)喪失它們的毛細血管并變得不能灌注，從而導致在視網(wǎng)膜盤和其他地方出現(xiàn)新血管時，發(fā)生增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。這些新血管生長成玻璃體，并且容易出血，從而導致視網(wǎng)膜前出血。在晚期增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病中，大量的玻璃體出血可能填充玻璃體腔的大部分。 另外，新血管伴隨著纖維組織增殖，它可能導致牽引視網(wǎng)膜脫離。糖尿病性視網(wǎng)膜病主要與糖尿病的持續(xù)時間相關；因此，隨著人群年齡和糖尿病患者生活的更長，糖尿病性視網(wǎng)膜病的流行率將增加。激光治療目前被用于非增殖性和增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。黃斑區(qū)周圍的泄漏性微動脈瘤的病灶激光治療使患有臨床上顯著的黃斑水腫的患者視力的喪失降低了 50%。在增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病中，全視網(wǎng)膜光凝固導致了在整個視網(wǎng)膜上散布數(shù)千個微小的灼傷(避開黃斑區(qū))；這種治療能降低失明比例60%。黃斑水腫和增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病的早期治療能預防95%的患者在五年時間內(nèi)失明，而晚期治療只能防止50%的患者失明。因此，早期診斷和治療是重要的。涉及新生血管形成的另一種眼疾病是年齡相關性黃斑變性(AMD)，這是一種影響 65歲以上的大約1/10的美國人的疾病。AMD的特征是黃斑，即視網(wǎng)膜中心區(qū)的一系列病理學變化，這種變化伴隨著降低的視敏度，特別是影響中心視力。AMD涉及被稱為視網(wǎng)膜色素上皮的單層細胞，它緊位于感覺視網(wǎng)膜下面。這些細胞滋養(yǎng)并且支持與它們接觸的視網(wǎng)膜部分，即，包含視色素的感光細胞。視網(wǎng)膜色素上皮位于玻璃膜上，它是基底膜復合物，在 AMD患者中，它會增厚并且硬化。新血管可能從下脈絡膜穿透玻璃膜，它包括豐富的血管床。 這些血管可能會泄漏流體或者在視網(wǎng)膜色素上皮下面出血，并且還可能在視網(wǎng)膜色素上皮和感覺視網(wǎng)膜之間出血。隨后的纖維狀瘢痕形成會破壞感光細胞的營養(yǎng)，并且導致這些細胞死亡，從而導致中央視敏度的喪失。這種類型的年齡相關性黃斑病變被稱作“潮濕”類型的，這是因為泄漏的血管和視網(wǎng)膜下水腫或血液。潮濕類型只占年齡相關性黃斑病變病例的10%，但是導致了老年人中90%的病例因為黃斑變性而為法定盲?！案稍铩鳖愋偷哪挲g相關性黃斑病變涉及視網(wǎng)膜色素上皮的分解，以及上面感光細胞的喪失。干燥類型的病變會降低視力，但是通常只有20/50-20/100的水平。AMD伴隨著中心視力的失真，使目標變大或變小或直線出現(xiàn)扭曲、彎曲或沒有中心段。在潮濕類型的AMD中，在黃斑區(qū)可能注意到感覺視網(wǎng)膜的小的脫離，不過，視網(wǎng)膜下新生血管膜的最終診斷需要熒光素血管造影術。在所述干燥類型中，玻璃疣可能干擾黃斑區(qū)的色素沉著模式。玻璃疣是視網(wǎng)膜色素上皮的基底膜的贅疣，它能突出進入細胞，從而導致所述細胞前部膨脹；它們作為年齡相關性黃斑病變的危險因素的原因尚不清楚。目前還沒有用于治療干燥類型的年齡相關性黃斑病變的方法。激光治療被用于潮濕類型的年齡相關性黃斑病變，并且最初消除了新生血管膜，并且在18個月時阻止了大約50%患者的進一步視力喪失。不過，到60個月時，只有20%的患者仍然有顯著效果。業(yè)已鑒定了血管發(fā)生的多種分子介體，包括堿性和酸性成纖維細胞生長因子 (aFGF，bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α和β (TGFa，TGFβ )、血小板衍生生長因子(PDGF)、血管生成素、血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子(PD-ECGF)、白細胞介素-8 (IL-8)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。參與血管發(fā)生的其他刺激物包括血管生成素(angiopoietirO-LDel-l、 卵泡抑素(follistatin)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、肝細胞生長因子(HGF)、苗條蛋白、midkine、胎盤生長因子、多效蛋白(PTN)、progranulin、增殖蛋白和腫瘤壞死因子-a (TNF-a)。另外，血管發(fā)生的控制還可以通過由身體產(chǎn)生的血管發(fā)生的多種負調(diào)節(jié)劑介導，包括angioarrestin、血管抑素(血纖蛋白溶酶原片段)、抗血管生成抗凝血酶III、軟骨-衍生的抑制劑(⑶I)、⑶59補體片段、內(nèi)皮抑制素(endostatin)(膠原XVIII片段)、纖連蛋白片段、gro-β、肝素酶、肝素多聚己糖片段、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、干擾素α/ β/Υ、干擾素誘導型蛋白(ΙΡ-10)、白細胞介素-12、kringle 5 (血纖蛋白溶酶原片段)、金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)、2_甲氧雌留二醇、胎盤核糖核酸酶抑制劑、血纖蛋白溶酶原激活物抑制劑、血小板因子-4(PF4)、促乳素16kD片段、增殖蛋白-相關蛋白(PRP)、類視黃醇、 四氫皮質(zhì)醇-S、血小板反應蛋白-I(TSP-I)、脈管抑素(vasculostatin)和血管抑制因子 (vasostatin)(鈣網(wǎng)蛋白片段)。在上述血管生成調(diào)節(jié)劑中，VEGF似乎作為伴隨著腫瘤生長的異常血管發(fā)生的正調(diào)節(jié)劑發(fā)揮關鍵作用(綜述參見 Brown 等，(1996) Control of Angiogenesis (Goldberg and Rosen，eds.)Birkhauser,Basel，和 Thomas (1996) J. Biol. Chem. 271 :603-606)。另夕卜，最近業(yè)已研究了信號傳導分子的PDGF家族的PDGF-B成員的作用，因為它似乎在血管周圍細胞的形成、擴增和正常功能方面發(fā)揮作用，所述血管周圍細胞有時被稱作壁細胞，例如，血管平滑肌、腎小球膜細胞和周細胞。盡管對與發(fā)育、傷口愈合和腫瘤形成伴隨的血管發(fā)生或新生血管形成的了解較多，但仍然需要確定在血管發(fā)生和眼血管發(fā)生之間是否存在差異。很顯然，盡管伴隨著，例如，心臟上的側(cè)支血管形成的血管發(fā)生可能對生物有利并且適應生物，但伴隨著例如AMD的病理性眼新生血管形成沒有已知的好處，并且通常會導致失明(有關綜述參見 Campochiaro (2000) J. Cell. Physiol. 184 :301-10)。因此，盡管對伴隨新生血管形成的分子事件的理解業(yè)已取得了進展，但仍然需要利用這些理解去開發(fā)用于治療新血管疾病的其他方法，所述疾病包括眼新血管疾病和諸如與AMD和糖尿病性視網(wǎng)膜病伴隨出現(xiàn)的脈絡膜新生血管形成的疾病。發(fā)明概述業(yè)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，抗-VEGF和抗-PDGF劑的組合，在治療眼新血管疾病時能提供協(xié)同治療效果。因此，本發(fā)明特征在于用于治療被診斷患有或有危險發(fā)展為新血管疾病的患者的方法。該方法包括給所述患者施用抗-VEGF劑和抗-PDGF劑，作為主要或輔助治療。一方面，本發(fā)明提供了用于抑制有所述需要的患者的新血管疾病的方法，其通過同時或相互間隔約90天之內(nèi)給患者施用PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑來實現(xiàn)，使用量足以抑制所述患者的新血管疾病。另一方面，本發(fā)明提供了用于治療有所述需要的患者的方法，所述患者被診斷患有或有危險發(fā)展為新血管疾病，其通過同時或相互間隔90天之內(nèi)給患者施用PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑來實現(xiàn)，以足以治療患者的用量施用。在這些方面的特定實施方案中，本發(fā)明的方法包括在相互間隔大約10天內(nèi)施用 PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑。在本發(fā)明方法的另一種實施方案中，所述PDGF拮抗劑和VEGF 拮抗劑是在相互間隔5天內(nèi)施用的。在本發(fā)明方法的另一種實施方案中，所述PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是在相互間隔約M小時內(nèi)施用的。在本發(fā)明方法的特定實施方案中，所述 PDGF拮抗劑和所述VEGF拮抗劑是同時施用的。 在另一種實施方案中，本發(fā)明的方法包括施用PDGF拮抗劑，它是PDGF-B拮抗劑。在另一種實施方案中，本發(fā)明的方法包括施用VEGF拮抗劑，它是VEGF-A拮抗劑。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法包括施用PDGF拮抗劑，它是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體、抗體片段的結(jié)合片段、糖、聚合物或小有機化合物。在另一種實施方案中，本發(fā)明的方法包括施用VEGF拮抗劑，它是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體、抗體片段的結(jié)合片段、糖、聚合物或小有機化合物。在特定實施方案中，本發(fā)明的方法包括施用VEGF拮抗劑，它是適體，如EYE001適體。在另一種實施方案中，本發(fā)明的方法包括施用VEGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。在特定實施方案中，本發(fā)明的方法包括施用PDGF拮抗劑，它是適體、抗體或其結(jié)合片段。在另一種具體實施方案中，本發(fā)明的方法包括施用PDGF拮抗劑，它是反義寡核苷酸。在本發(fā)明這一方面的另一種實施方案中，所述PDGF拮抗劑和/或所述VEGF拮抗劑是前藥。在一種實施方案中，本發(fā)明的方法提供了用于抑制或治療眼新血管疾病的手段。 在某些實施方案中，適合通過本發(fā)明的方法治療或抑制的眼新血管疾病包括缺血性視網(wǎng)膜病、虹膜新生血管形成、眼內(nèi)新生血管形成、年齡相關性黃斑變性、角膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新生血管形成、脈絡膜新生血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜缺血或增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。 在另一種實施方案中，本發(fā)明的方法提供了用于抑制或治療有所述需要的患者或被診斷患有或有危險發(fā)展為這種疾病的患者的銀屑病或類風濕性關節(jié)炎的手段。本發(fā)明還提供了包括PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的，以及可以藥用的載體的藥用組合物。在這一方面，PDGF和VEGF拮抗劑的使用量都足以抑制所述患者的新血管疾病。在這一方面的一種實施方案中，所述藥用組合物包括PDGF拮抗劑，它是PDGF-B拮抗劑。在另一種實施方案中，所述藥用組合物包括VEGF拮抗劑，它是VEGF-A拮抗劑。在某些實施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括PDGF拮抗劑，它是核酸分子、適體、 反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體、抗體片段的結(jié)合片段、糖、聚合物或小有機化合物。在另一種實施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括VEGF拮抗劑，它是核酸分子、 適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體、抗體片段的結(jié)合片段、糖、聚合物或小有機化合物。在其他特定實施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括VEGF拮抗劑，它是適體，如 EYE001適體。在一種實施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括VEGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。在特定實施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括PDGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。在另一種具體實施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括PDGF拮抗劑，它是反義寡核苷酸。本發(fā)明的藥用組合物可以包括可以藥用的載體，它包括小球體或水凝膠制劑。在另一種實施方案中，所述PDGF拮抗劑和/或所述VEGF拮抗劑是前藥。在另一種實施方案中，本發(fā)明的藥用組合物提供了用于抑制或治療眼新血管疾病的手段。在某些實施方案中，適合通過本發(fā)明的藥用組合物治療或抑制的眼新血管疾病包括缺血性視網(wǎng)膜病、虹膜新生血管形成、眼內(nèi)新生血管形成、年齡相關性黃斑變性、角膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新生血管形成、脈絡膜新生血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜缺血或增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。在其他實施方案中，本發(fā)明的藥用組合物提供用于在有所述需要的患者， 或被診斷患有或有危險發(fā)展為這種疾病的患者中抑制或治療銀屑病或類風濕性關節(jié)炎的手段。本發(fā)明還提供了包括PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的藥物包(pharmaceutical pack)。在這一方面的一種實施方案中，所述藥物包包括PDGF拮抗劑，它是PDGF-B拮抗劑。 在這一方面的另一種實施方案中，所述藥物包包括VEGF拮抗劑，它是VEGF-A拮抗劑。在另一種實施方案中，所述藥物包的PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是分別且以單獨劑量形式制備的。在另一種實施方案中，所述藥物包的PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是一起制備的。在某些特定實施方案中，本發(fā)明的藥物包包括VEGF拮抗劑，它是適體，如EYE001 適體。在其他實施方案中，本發(fā)明的藥物包包括VEGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。在某些實施方案中，本發(fā)明的藥物包包括PDGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。 在其他特定實施方案中，本發(fā)明的藥物包包括PDGF拮抗劑，它是反義寡核苷酸。在這一方面的另一種實施方案中，所述PDGF拮抗劑和/或所述VEGF拮抗劑是前藥。附圖簡述圖 I(A)是人 PDGF-B 的核酸序列(GenBank 編號 X02811) (SEQ ID NO 1)的示意圖。圖 1 (B)是人 PDGF-B 的氨基酸序列(GenBank 編號 CAA^579) (SEQ ID NO 2)的示意圖。圖 I(C)是人 PDGF-A 的核酸序列(GenBank 編號 X06374) (SEQ ID NO 11)的示意圖。圖 I(D)是人 PDGF-A 的多肽序列(GenBank 編號 CAA29677) (SEQ ID NO 12)的示意圖。圖 2(A)是人 VEGF 的核酸序列(GenBank 編號NM_003376) (SEQ ID NO :3)的示意圖。圖 2(B)是人 VEGF 多肽氨基酸序列(GenBank 編號 NP_003367) (SEQ ID NO :4)的
示意圖。圖 3(A)是人 PDGFR-B 核酸序列(GenBank 編號 NM_002609) (SEQ ID NO 5)的示意圖。圖 3(B)是人 PDGFR-B 多肽序列(GenBank 編號 NP_002600) (SEQ ID NO :6)的示意圖。
3(C)是人 PDGFR-A 核酸序列(GenBank 編號 NM_006206) (SEQ ID NO :13)的示意圖。圖 3(D)是人 PDGFR-A 多肽序列(GenBank 編號 NP_006197) (SEQ ID NO :14)的示意圖。圖 4 (A)是人 VEGFR-I (Flt-I)核酸序列(GenBank 編號 AF063657) (SEQ ID NO 7) 的示意圖。圖4(B)是人 VEGFR-I (Flt-I)多肽序列(GenBank 編號)(SEQ ID NO 8)的示意圖。
圖 4 (C)是人VEGFR-2(KDR/Flk-1)核酸序列(GenBank編號 AFO!35121) (SEQ ID NO
9)的示意圖。圖 4 (D)是人VEGFR-2(KDR/Flk-1)多肽序列(GenBank編號 AAB88005) (SEQ ID NO
10)的示意圖。圖5是比較對照處理(cont) ,Gleevec處理(抗-PDGF劑)和Macugen 處理(即 pegaptanib處理，抗-VEGF劑)的角膜新生血管形成測定結(jié)果，與用Macugen 和Gleevec 的組合處理結(jié)果(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的圖示。圖6㈧是出現(xiàn)在對照(PEG-處理的)小鼠角膜上的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。圖6 (B)是出現(xiàn)在Gleevec-處理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。圖6(C)是出現(xiàn)在Macugen -處理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。圖6 (D)是出現(xiàn)在用Macugen 和Gleevec兩者處理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。圖7(A)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表示正常的角膜脈管系統(tǒng)不會受到施用 APB5 (PDGFR抗體，抗-PDGF劑)的影響。圖7(B)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表示正常的角膜脈管系統(tǒng)不受施用 Gleevec的影響。圖7(C)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表示正常的角膜脈管系統(tǒng)不受同時施用 Macugen (Mac)和 Gleevec 的影響。圖7(D)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表示正常的角膜脈管系統(tǒng)不受施用PEG的影響。圖8是激光誘導的脈絡膜新生血管形成測定結(jié)果的圖示，比較了對照處理 (cont) ,Gleevec 處理(抗-PDGF 劑)和 Macugen 處理(即 pegaptanib 處理，抗-VEGF 劑) 與用Macugen 和Gleevec組合處理的結(jié)果(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)。圖9是激光誘導的脈絡膜新生血管形成測定結(jié)果的圖示，比較了對照-處理的 (cont)、APB5-處理的(抗-PGFR抗體，它起著抗-PDGF劑的作用)和Macugen處理(即 pegaptanib處理，抗-VEGF適體)與用Macugen和APB5 (Mac+APB5)組合處理的結(jié)果。

圖10是視網(wǎng)膜發(fā)育模型結(jié)果的圖示，比較了對照處理(Cont)、ARC-127處理 (抗-PDGF 劑)和 Macugen 處理(即 pegaptanib 處理，抗-VEGF劑)與用 Macugen 和 ARC-127 組合處理(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的結(jié)果。圖11是角膜新生血管形成測定結(jié)果的圖示，比較了對照處理(cont)、ARC-127處理(抗-PDGF劑)和Macugen處理(即pegaptanib處理，抗-VEGF劑)與用Macugen和 ARC-127組合處理(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的結(jié)果。圖12(A)是出現(xiàn)在對照小鼠角膜中的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。圖12⑶是出現(xiàn)在ARC-127-處理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。
圖12(C)是出現(xiàn)在Macugen-處理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。圖12⑶是出現(xiàn)在用Macugen和ARC-127處理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。圖13是角膜新生血管形成測定結(jié)果的圖示，比較了對照處理(cont)、APB-5處理 (抗-PDGF 劑)和 Macugen 處理(即 pegaptanib 處理，抗-VEGF 劑)與用 Macugen 和 APB-5 組合處理(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的結(jié)果。圖14是角膜新生血管形成測定結(jié)果的圖示，比較了對照處理(cont)、APB-5處理 (抗-PDGF 劑)和 Macugen-處理(即 pegaptanib 處理，抗-VEGF 劑)與用 Macugen 和 APB_5 組合處理(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的結(jié)果。發(fā)明詳述在本說明書中所提到的所有文獻、專利和專利申請都被收作本文參考。^JL在本文中，以下術語和短語具有下面所具有的含義。除非另有說明，本文所使用的所有技術和科學術語具有本發(fā)明所屬技術領域普通技術人員所普遍了解的相同含義?！稗卓箘北硎灸懿糠只蛲耆种瓢蟹肿拥幕钚曰虍a(chǎn)生的試劑。具體地講，術語 “拮抗劑”，在本文中選擇性地使用時，表示能夠降低PDGF、PDGFR、VEGF或VEGFR基因表達水平、mRNA水平、蛋白水平或蛋白活性的試劑。拮抗劑的示例性形式包括，例如，蛋白、多肽、 肽(如環(huán)肽)、抗體或抗體片段、肽模擬物、核酸分子、反義分子、核酶、適體、RNAi分子和小有機分子。拮抗劑抑制VEGF/VEGFR和PDGF/PDGFR配體/受體靶的示例性的非限定性機制包括抑制配體合成和/或穩(wěn)定性(例如，使用靶定配體基因/核酸的反義、核酶或RNAi組合物)、阻斷配體與它的同源受體的結(jié)合(例如，使用抗-配體適體、抗體或可溶性引誘同源受體)、抑制受體合成和/或穩(wěn)定性(例如，使用靶定配體受體基因/核酸的反義、核酶或 RNAi組合物)、阻斷受體與它的同源受體的結(jié)合(例如，使用受體抗體)和阻斷受體被它的同源配體的激活(例如，使用受體酪氨酸激酶抑制劑)。另外，所述拮抗劑可以直接或間接抑制靶分子。在本文中，術語“抗體”意在包括完整的抗體，例如，任何同種型的抗體(IgG、IgA、 IgM、IgE等)，并且包括能夠識別并且還能與脊椎動物(例如，哺乳動物)蛋白、糖類等特異性起反應的它們的片段。抗體可以使用常規(guī)技術片段化，并且以上述完整抗體相同的方式篩選這些片段的用途。因此，該術語包括抗體分子的蛋白酶剪切的片段或重組制備的部分， 它能夠與某些蛋白選擇性地起反應。所述蛋白酶解和/或重組片段的非限定性例子包括 Fab, F(ab' )2、Fab'、Fv和單鏈抗體(scFv)，它包括通過肽接頭結(jié)合的V[L]和/或V[H] 結(jié)構(gòu)域。所述scFv' s可以共價或非共價連接，以便形成具有兩個或兩個以上結(jié)合位點的抗體。本發(fā)明包括多克隆抗體、單克隆抗體或抗體的其他純化制劑和重組抗體。在這里，術語“適體”，可以與術語“核酸配體”互換使用，它表示核酸，所述核酸通過它適應特殊的三維構(gòu)象的能力，能結(jié)合靶分子并且對它具有拮抗作用(即，抑制)。本發(fā)明的靶是PDGF或VEGF (或它們的同源受體PDGFR或VEGFR之一)，因此，使用了術語PDGF 適體或核酸配體或VEGF適體或核酸配體(或PDGFR適體或核酸配體或VEGFR適體或核酸配體)。所述適體對靶的抑制可以通過下述方式進行靶的結(jié)合，催化性改變靶，以修飾/改變靶或靶的功能活性的方式與靶起反應，作為自殺抑制劑與靶共價附著，促進靶和其他分子之間的反應。適體可以包括多個核糖核苷酸單位、脫氧核糖核苷酸單位或這兩種類型核苷酸殘基的混合物。適體還可以包括一個或多個修飾過的堿基、糖或磷酸酯主鏈單位，正如在本文中進一步描述的?！翱贵w拮抗劑”表示本文所定義的抗體分子，它能阻斷或顯著減弱靶PDGF或VEGF 的一種或多種活性。例如，VEGF抑制抗體可以抑制或減弱VEGF刺激血管發(fā)生的能力。如果兩個序列的每一個堿基都匹配，即能夠形成沃森-克里克(Watson Crick)堿基對，那么一種核苷酸序列就是與另一種核苷酸序列“互補的”。術語“互補鏈”在這里可以與術語“互補體”互換使用。核酸鏈的互補體可以是編碼鏈的互補體或非編碼鏈的互補體。短語“保守殘基”或“保守性氨基酸取代”表示基于某些共同特性的氨基酸分組。確定獨立氨基酸之間的共同特性的功能性途徑是分析同源生物的相應蛋白之間的氨基酸變化的歸一化頻率。根據(jù)所述分析，可以確定氨基酸的組，其中，一組中的氨基酸優(yōu)選能夠彼此交換，因此，它們在對總的蛋白結(jié)構(gòu)的影響上最彼此類似(Schulz，G.E.和 R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。以這禾中方式石角定的氨基酸組的例子包括⑴帶電荷的組，由Glu和Asp、Lys、Arg和His組成，(ii)帶正電荷的組，由Lys、Arg和His組成，(iii)帶負電荷的組，同Glu和Asp組成，(iv)芳族組，由 Phe、Tyr 和 Trp 組成，(ν)氮環(huán)組，由His和Trp組成，(vi)大的脂族非極性組，由Val、Leu和Ile組成，(vii)略微極性組，由Met和Cys組成，(viii)小殘基組，由 kr、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln 和 Pro 組成，(ix)脂族組，由 Val、Leu、lie、Met 和 Cys 組成，和
(χ)小羥基組，由Ser和Thr組成。除上面所列舉的組之外，每一種氨基酸殘基可以形成它自身的組，并且由單獨的氨基酸形成的組可以簡單地通過本領域常用的氨基酸的單字母和/或三字母的縮寫來在本文中，術語“相互作用”實際上表示包括分子之間的可檢測的關系或結(jié)合(例如，生物化學相互作用)，如蛋白-蛋白、蛋白-核酸、核酸-核酸和蛋白-小分子或核酸-小分子之間的相互作用。術語“相互作用的蛋白”表示能夠與目標蛋白相互作用、結(jié)合和/或以其他方式結(jié)合的蛋白，例如，PDGF或VEGF蛋白，或它們的相應的同源受體。在本文中，與核酸，如DNA或RNA相應的術語“分離的”，表示與存在于所述大分子天然來源中的其他DNAs或RNAs分別分離的分子。類似的，在本文中，與多肽相應的術語“分離的”表示與所述多肽的來源中存在的其他蛋白分離的蛋白分子。在本文中，術語分離的還表示在通過重組DNA技術生產(chǎn)時基本上不含細胞材料、病毒材料或培養(yǎng)基的核酸或肽，或者在通過化學合成時基本上不含化學前體或其他化學試劑?！胺蛛x的核酸”表示包括核酸片段，它不是作為片段天然存在的，并且不會以天然狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)。術語“分離的”在這里還用于表示多肽，它是從其他細胞蛋白中分離的，并且表示包括純化的和重組多肽兩者。在本文中，術語“標記”和“可檢測標記”表示能夠檢測的分子，包括，但不局限于， 放射性同位素、熒光團、化學發(fā)光部分、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、染料、金屬離子、配體(例如，生物素或半抗原)等。術語“熒光劑”表示能夠表現(xiàn)出可檢測范圍的熒光的物質(zhì)或它的部分?？梢栽诒景l(fā)明中使用的標記的具體例子包括熒光素、若丹明、丹酰、傘形酮、德克薩斯紅、魯米諾、NADPH、α-β-半乳糖苷酶和辣根過氧化物酶?！盎蛟诩毎械谋磉_水平”表示由所述細胞中的基因編碼的mRNA，以及前-mRNA 新生轉(zhuǎn)錄物，轉(zhuǎn)錄物加工中間物，成熟mRNA和降解產(chǎn)物的水平，以及由所述基因翻譯的蛋白的水平。在本文中，術語“核酸”表示多核苷酸，如脫氧核糖核酸(DNA)，且如果合適的話，還表示核糖核酸(RNA)。該術語還應當被理解成包括由核苷酸類似物制備的RNA或DNA類似物作為等同物，以及在用于所述實施方案時，單鏈(有義或反義)和雙鏈多核苷酸、ESTs、染色體、cDNAs、mRNAs和rRNAs是可以被稱作核酸的分子的代表性例子。術語“寡核苷酸”表示核苷酸或核苷單體的寡聚體或多聚體，它是由天然存在的堿基糖類和糖間(主鏈)鍵組成的。該術語還包括修飾過的或取代過的寡聚體，包括非天然存在的單體或它的部分，它們起著類似的作用。取代過的寡聚體的整合是基于多種因素的， 包括增強了的細胞攝取，或增強了的核酸酶抗性，并且是根據(jù)本領域公知方法選擇的。完整的寡核苷酸或者僅是它的一部分可以包括取代過的寡聚體。術語“百分比同一性”表示兩種氨基酸序列或兩種核苷酸序列之間的序列同一性。 同一性可以通過比較在每一種序列上的位置確定，它們可以是為了比較而進行比對的。當比較的序列上的相同位置被相同的堿基或氨基酸所占據(jù)時，所述分子在該位置上是相同的；當相同的位點被相同或類似的氨基酸殘基(例如，在空間和/或電子性質(zhì)方面類似) 所占據(jù)時，所述分子可以被稱作在該位置上是同源的(類似的)。同源性、相似性或同一性的百分比表示由比較序列所共有的位置上相同或相似氨基酸的數(shù)目的函數(shù)。可以使用各種比對算法和 / 或程序，包括 Hidden Markov Model (HMM)、FASTA 和 BLAST。HNiM、FASTA 禾口 BLAST 可以從以下機構(gòu)獲得the National Center for Biotechnology Information、 National Library of Medicine、National Institutes of Health,Bethesda, Md.禾口 the European Bioinformatic Institute EBI。在一種實施方案中，兩種序列的百分比同一性可以通過所述GCG程序確定，其缺口權重為1，例如，對每一個氨基酸缺口進行加權，就如同它是兩個序列之間的單個氨基酸或核苷酸錯配。用于比對的其他技術描述于以下文獻中:Methods in Enzymology, vol. 266 :Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co. ,San Diego，California，美國。如果需要的話，將允許序列中存在缺口的比對程序用于比對所述序列。Smith Waterman是一種類型的允許在序列比對中存在缺口的算法(參見(1997)Meth.Mol.Biol. 70 :173-187)。同樣，采用 Needleman 和 1Wunsch 比對方法的 GAP 程序可用于比對序列。包括使用HMM的更多的技術和算法描述于以下文獻中Sequence， Structure，and Databanks :A Practical Approach (2000),ed. Oxford University Press， Incorporated and in Bioinformatics :Databases and Systems (1999)ed. KluwerAcademic Publishers。另一種檢索策略使用了 MPSRCH軟件，該軟件在MASPAR計算機上運行。MPSRCH使用Smith-Watermnan算法在大量并行計算機上對序列進行評分。這種方法改善了挑選關系較遠的匹配的能力，并且特別能耐受小的缺口和核苷酸序列錯誤?？梢詫⒑怂峋幋a的氨基酸序列用于檢索蛋白和DNA數(shù)據(jù)庫。具有獨立序列的數(shù)據(jù)庫描述于以下文獻中Methods in Enzymology，ed. Doolittle，同上。數(shù)據(jù)庫包括 Genbank、EMBL 和日本的 DNA 數(shù)據(jù)庫(DDBJ)。“完全匹配的”在表示雙鏈體時，表示由形成所述雙鏈體的多核苷酸或寡核苷酸鏈彼此形成了雙鏈結(jié)構(gòu)，以便在每一條鏈上的每一個核苷酸都與另一條鏈上的核苷酸發(fā)生了沃森-克里克堿基配對。該術語還可以包含可以應用的核苷類似物的配對，如脫氧肌苷、具有2-氨基嘌呤堿基的核苷等。靶多核苷酸和寡核苷酸或多核苷酸之間的雙鏈體的錯配表示所述雙鏈體上的一對核苷酸不能進行沃森-克里克結(jié)合。在提到三鏈體時，該術語表示三鏈體由完全配對的雙鏈體和第三條鏈組成，其中，每一個核苷酸都與完全匹配的雙鏈體上的堿基對發(fā)生了 Hoogsteen或反向Hoogsteen結(jié)合。術語“RNA干擾”、“RNAi”或“siRNA”都表示通過將一個或多個雙鏈RNAs導入靶細胞中來減弱基因或基因產(chǎn)物的表達的任何方法，所述RNA與目標基因同源(特別是與目標基因，例如，PDGF或VEGF的信使RNA同源)。多態(tài)變體還可以包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNPs)，其中，所述多核苷酸序列有一個堿基的改變(例如，在PDGF或VEGF中的一個堿基的改變)。SNPs的存在可以是，例如，某些群體、疾病狀態(tài)或出現(xiàn)疾病狀態(tài)的傾向的指標。異?！疤卣?profile) ”，例如，腫瘤細胞的生物學狀態(tài)表示因為疾病狀態(tài)而改變的細胞的各種成分的含量。細胞成分包括RNA水平、蛋白豐度水平或蛋白活性水平。在這里，術語“蛋白”可以與術語“肽”和“多肽”互換使用。術語“重組蛋白”表示通過重組DNA技術生產(chǎn)的本發(fā)明的的蛋白，其中，一般將編碼表達的蛋白或RNA的DNA插入合適的表達載體，該表達載體又被用于轉(zhuǎn)化宿主細胞，以便產(chǎn)生異源蛋白或RNA。另外，短語 “源于”，在關于編碼重組蛋白的重組基因時，是指在“重組蛋白”的含義內(nèi)，包括具有天然蛋白的氨基酸序列，或與它類似的通過突變產(chǎn)生的氨基酸序列的蛋白，所述突變包括天然存在的蛋白的取代和缺失。在本文中，術語“轉(zhuǎn)基因”表示核酸序列(編碼例如，靶核酸之一，或它的反義轉(zhuǎn)錄物)，業(yè)已將所述核酸序列導入了細胞。對于導入了它的轉(zhuǎn)基因動物或細胞來說，轉(zhuǎn)基因可以是部分或完全異源的，即，外源的，或者與導入了它的轉(zhuǎn)基因動物或細胞的內(nèi)源基因同源，不過，它們被設計成或已經(jīng)以這樣的方式插入所述動物的基因組，以便改變插入了它的細胞的基因組(例如，它被插入的位置不同于天然基因的位置，或者它的插入導致了敲除)。轉(zhuǎn)基因還能夠以附加體的形式存在于細胞中。轉(zhuǎn)基因可以包括一個或多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，以及任何其他核酸，如內(nèi)含子，它們可能是所選核酸的最佳表達所必需的?！靶卵芗膊　北硎疽愿淖兞说幕虿皇苷{(diào)控的血管發(fā)生為特征的疾病，其中伴隨著致癌性或致瘤性轉(zhuǎn)化的疾病，即，癌癥除外。新血管疾病的例子包括銀屑病、類風濕性關節(jié)炎和眼新血管疾病，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病和年齡相關性黃斑變性。在本文中，術語“新生血管形成”和“血管發(fā)生”可以互換使用。新生血管形成和血管發(fā)生表示產(chǎn)生新血管進入細胞、組織或器官。血管發(fā)生的控制通常在某些疾病狀態(tài)中發(fā)生改變，并且，在很多場合下，與所述疾病相關的病理學損傷與改變了的、不受調(diào)控的或不受控制的血管發(fā)生相關。持久的、不受調(diào)控的血管發(fā)生出現(xiàn)在多種疾病狀態(tài)中，包括以內(nèi)皮細胞異常生長為特征的疾病，并且支持在這些狀況中出現(xiàn)的病理學損傷，包括血管的泄漏和通透性?！把坌卵芗膊　笔且曰颊哐壑懈淖兞说幕虿皇苷{(diào)控的血管發(fā)生為特征的疾病。實例性的眼新血管疾病包括視神經(jīng)盤新生血管形成、虹膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新生血管形成、脈絡膜新生血管形成、角膜新生血管形成、玻璃體新生血管形成、綠內(nèi)障、血管翳、翼狀胬肉、黃斑水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性黃斑水腫、血管原性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜變性、 葡萄膜炎、視網(wǎng)膜炎性疾病和增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變。術語“治療”受試者的新血管疾病或“治療”患有新血管疾病的受試者表示讓所述受試者接受藥物治療，例如，施用藥物，以便減弱新血管疾病的至少一種癥狀。因此，在本文中，術語“治療”意在包括治愈和改善新血管狀況或疾病的至少一種癥狀。因此，在本文中， “治療”包括施用或開處藥用組合物，用于治療或預防眼新血管疾病?！盎颊摺北硎救魏蝿游?。術語“動物”包括哺乳動物，包括，但不局限于人和其他靈長類。該術語還包括家畜，如牛、豬、羊、馬、狗和貓?！癙DGF”或“血小板衍生生長因子”表示能影響血管發(fā)生或血管生成過程的哺乳動物血小板衍生生長因子。在本文中，術語“PDGF”包括PDGF的各種亞型，包括PDGF-B (參見圖 I(A)和(B))和PDGF-A(參見圖I(C)和(D))。另夕卜，在本文中，術語“PDGF”表示PDGF-相關的血管生成因子，如PDGF-C和PDGF-D，它們通過同源PDGF受體起作用，刺激血管發(fā)生或血管生成過程。具體地講，術語“PDGF”表示生長因子種類的任何成員，它能夠(i)與諸如 PDGFR-B (參見圖3 (A)和(B))或PDGFR-A (參見圖3 (C)和(D))的PDGF受體結(jié)合；(ii)激活與VEGF受體相關的酪氨酸激酶活性；和(iii)從而影響血管發(fā)生或血管生成過程。在本文中，術語“PDGF” 一般表示生長因子種類的以下成員，它能通過結(jié)合并且激活反應性細胞類型上的血小板衍生生長因子細胞表面受體(即，PDGFR)來誘導DNA合成和有絲分裂發(fā)生。PDGFs能實現(xiàn)的特殊生物學作用包括，例如定向細胞遷移(趨化性)和細胞激活；磷脂酶激活；增強了的磷脂酰肌醇周轉(zhuǎn)和前列腺素代謝；刺激反應性細胞的膠原和膠原酶合成；改變細胞代謝活性，包括基質(zhì)合成，細胞因子產(chǎn)生，和脂蛋白吸收；在缺少PDGF受體的細胞中增殖性反應的間接誘導；和有效的血管收縮活性。術語“PDGF”表示包括“PDGF”多肽及其相應的“PDGF”編碼基因或核酸。"PDGF-A"表示PDGF的A鏈多肽及其相應的編碼基因或核酸?！癙DGF-B“表示PDGF的B鏈多肽及其相應的編碼基因或核酸。“VEGF”或“血管內(nèi)皮生長因子”表示能影響血管發(fā)生或血管生成過程的哺乳動物血管內(nèi)皮生長因子。在本文中，術語“VEGF”包括VEGF的各種亞型(又被稱作血管通透因子 (VPF)和VEGF-A)(參見圖2(A)和(B))，它們是通過例如，VEGF-A/VPF基因的可變剪接產(chǎn)生的，包括VEGF121、VEGF165和VEGF189。另外，在本文中，術語“VEGF”表示VEGF-相關的血管生成因子，如PIGF (胎盤生長因子)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E，它們通過同源VETO 受體起作用，刺激血管發(fā)生或血管生成過程。具體地講，術語“VEGF”表示生長因子種類的任何成員，它能⑴與諸如 VEGFR-I (Flt-I)(參見圖 4(A)和(B))、VEGFR-2 (KDR/Flk-1)(參見圖4 (C)和(D))或VEGFR-3 (FLT-4)的VEGF受體結(jié)合；(ii)激活與VEGF受體相關的酪氨
1酸激酶活性；和(iii)從而影響血管發(fā)生或血管生成過程。術語“VEGF”意在包括“VEGF” 多肽及其相應的“VEGF”編碼基因或核酸。"PDGF拮抗劑”表示能夠部分或完全減弱，或抑制PDGF活性或產(chǎn)生的試劑。PDGF 拮抗劑能夠直接或間接減少或抑制特殊的PDGF，如PDGF-B。另外，與上述“拮抗劑”的定義一致的“PDGF拮抗劑”可以包括能夠作用于PDGF配體或它的同源受體，從而減弱或抑制 PDGF-相關的受體信號的試劑。因此，所述“PDGF拮抗劑”的例子包括，例如靶定PDGF核酸的反義、核酶或RNAi組合物；抗-PDGF適體、抗-PDGF抗體或可溶性PDGF受體誘餌，其能防止PDGF與它的同源受體結(jié)合；靶定同源PDGF受體(PDGFR)核酸的反義、核酶或RNAi組合物；抗-PDGFR適體或抗-PDGFR抗體，其能結(jié)合同源PDGFR受體；和PDGFR酪氨酸激酶抑制劑。"VEGF拮抗劑”表示能部分或完全減弱或抑制VEGF活性或產(chǎn)生的試劑。VEGF拮抗劑能夠直接或間接減弱或抑制特殊的VEGF，如VEGF165。另外，與上述“拮抗劑”定義一致的 "VEGF拮抗劑”可以包括能夠作用于VEGF配體或它的同源受體，從而減弱或抑制VEGF-相關的受體信號的試劑。因此，所述“VEGF拮抗劑”的例子包括，例如靴定VEGF核酸的反義、 核酶或RNAi組合物；抗-VEGF適體、抗-VEGF抗體或可溶性VEGF受體誘餌，其能防止VEGF 與它的同源受體結(jié)合；靶定同源VEGF受體(VEGFR)核酸的反義、核酶或RNAi組合物；能結(jié)合同源VEGFR受體的抗-VEGFR適體或抗-VEGFR抗體；和VEGFR酪氨酸激酶抑制劑。“足以抑制新血管疾病的量”表示在本發(fā)明組合中用于治療或預防新形成疾病或它的癥狀所必需的拮抗劑的有效量。用于實施本發(fā)明用來治療性治療由新血管疾病導致或造成所述新血管疾病的狀況的活性拮抗劑的“有效量”根據(jù)施用方式、新血管疾病的解剖學部位、患者的年齡、體重和一般健康狀況而改變。最后，醫(yī)生或獸醫(yī)決定合適的量和劑量方案。所述量被稱作足以抑制新血管疾病的量。通過以下詳細說明和權利要求書，可以了解本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點。多肽X的“變體”表示具有肽X的氨基酸序列的多肽，其中，有一個或多個氨基酸殘基發(fā)生了改變。所述變體可以具有“保守性”改變，其中，取代的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)或化學特性(例如，用異亮氨酸取代亮氨酸)。更罕見的是，變體可能具有“非保守性”改變 (例如，用色氨酸取代甘氨酸)。類似的微小變化還可以包括氨基酸缺失或插入，或這兩者。 決定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或缺失而又不消除生物學或免疫學活性的指南可以使用本領域所熟知的計算機程序發(fā)現(xiàn)，例如，LASERGENE軟件(DNASTAR)。術語“變體”，在用于表示多核苷酸序列時，可以包括與基因或它的編碼序列相關的多核苷酸序列。該定義還可以包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物種”或“多態(tài)”變體。 剪接變體可以與參考分子具有顯著同一性。不過，由于在mRNA加工期間外顯子的可變剪接，一般具有更多或更小數(shù)目的多核苷酸。相應的多肽可以具有額外的功能結(jié)構(gòu)域，或者缺少所述結(jié)構(gòu)域。物種變體是在物種之間不同的多核苷酸序列。一般，所得到的多肽彼此具有顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體是特定物種的個體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。術語“載體”表示能夠轉(zhuǎn)運與它連接的其他核酸的核酸分子。一種類型的有用的載體是附加體，即，能夠進行染色體外復制的核酸。有用的載體是能夠自主復制和/或表達與它連接的核酸的載體。能夠指導可操作地與它連接的基因的表達的載體在本文中被稱作 “表達載體”。一般，可用于重組DNA技術中的表達載體通常是“質(zhì)?！毙问降?，它一般表示環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，在它們的載體形式中，它們不與染色體結(jié)合。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因為質(zhì)粒是載體的最常使用的形式。不過，本發(fā)明意在包括這樣的其他形式的表達載體，它們發(fā)揮等同的功能，并且它們隨后為本領域所公知。組合治療本發(fā)明部分基于VEGF和PDGF活性的特殊抑制作用，其中使用合適的生長因子拮抗劑作為有效的治療手段，用于治療患有新血管疾病的患者。PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合施用，提供了治療眼新血管疾病的比單獨施用任意一種拮抗劑更高的治療益處。鑒于證明這兩種因子在刺激視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞系統(tǒng)的血管發(fā)生方面沒有表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用的研究，抗-VEGF和抗-PDGF劑的組合作用是出乎意料的(參見Castellon等，(2001) Exp. Eye Res. 74 :523-35)。PDGF和VEGF是新血管在身體，特別是在眼中生長的重要刺激物。為了抑制PDGF 和VEGF生物學活性而進行的組合治療提供了用于治療或預防新血管疾病的方法。因此，本發(fā)明涉及使用組合治療抑制新血管疾病的方法和組合物。具體地講，本發(fā)明利用在血管細胞中起作用的兩種不同的細胞間通訊信號傳導途徑，即PDGF和VEGF信號傳導，作為新血管疾病，如眼新血管疾病的治療靶。這種組合方法特別可用于治療任何數(shù)目的以眼新生血管形成的發(fā)展為標志的眼科學疾病或病癥，包括，但不局限于，視神經(jīng)盤新生血管形成、虹膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新生血管形成、脈絡膜新生血管形成、角膜新生血管形成、玻璃體新生血管形成、綠內(nèi)障、血管翳、翼狀胬肉、黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫、血管原性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜變性、黃斑變性、葡萄膜炎、視網(wǎng)膜炎性疾病和增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變。所述組合治療，由抑制PDGF(如PDGF-B)和VEGF(如VEGF-A)信號傳導的拮抗劑組成，與單獨使用這兩種治療相比，產(chǎn)生了增強了的治療功效。盡管在下面討論的例子，描述了單一 PDGF拮抗劑和單一 VEGF拮抗劑的組合，但可以理解的是，多種拮抗劑的組合可能是所需的。根據(jù)本發(fā)明的抗-PDGF和抗-VEGF組合治療可以單獨進行，或者與其他治療組合進行，并且可以在家庭、醫(yī)務室、診所、醫(yī)院門診室或醫(yī)院提供。治療一般在醫(yī)院開始，從而醫(yī)生能夠密切觀察治療效果，并且進行任何需要的調(diào)整。組合治療持續(xù)時間取決于接受治療的新血管疾病的類型、患者的年齡和狀況、患者疾病的階段和類型以及患者對治療的反應。另外，有發(fā)展為新血管疾病的較大風險的人(例如，糖尿病患者)可以接受治療，以抑制或延緩癥狀的發(fā)作。本發(fā)明所提供的一個顯著優(yōu)點是，將PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合用于治療新血管疾病，使得能夠施用低劑量的每一種拮抗劑，和較少的總的活性拮抗劑， 因此以較低的毒性和副作用以及低成本提供了相似的功效。所述組合的每一種成分的施用劑量和頻率可以獨立地控制。例如，一種拮抗劑可以每天施用三次，而第二種拮抗劑可以每天施用一次。組合治療能夠以斷斷續(xù)續(xù)的循環(huán)形式提供，它包括靜止時間段，以便患者身體有機會從任何尚無法預料的副作用中恢復。所述拮抗劑還可以一起制備，以便一次施用能夠送遞兩種拮抗劑。PDGF和VEGF拮抗劑靶PDGF最初是從血小板裂解物分離的，并且被確定為存在于血清而不是血漿中的主要生長促進活性。首先顯示PDGF的促有絲分裂活性作用在結(jié)締組織細胞上，如成纖維細胞和平滑肌細胞，并且存在于培養(yǎng)物中的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中。業(yè)已鑒定了兩種同源PDGF同工型，PDGF A和B，它們是由獨立的基因(位于7號和22號染色體上)編碼的。來自血小板的最主要的種類是AB異源二聚體，盡管所有三種可能的二聚體(AA、AB和BB)都是天然存在的。在翻譯之后，PDGF 二聚體被加工成大約30kDa的分泌蛋白。業(yè)已鑒定了以高親和力結(jié)合PDGF的兩種細胞表面蛋白，α和β (Heldin等， (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78 3664 ；WilIiams 等，(1981)Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79 :5867)。這兩個種類都包括五個免疫球蛋白-樣細胞外結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是由激酶插入結(jié)構(gòu)域隔開的。在過去幾年中，業(yè)已闡明了三種PDGF同工型對三種受體二聚體(α/α、α/β和β/β)的特異性。α -受體同源二聚體能以高的親和力結(jié)合所有三種PDGF同工型，β -受體同源二聚體只能以高的親和力結(jié)合PDGF BB,而結(jié)合PDGF AB的親和力低大約10倍，并且α / β -受體異源二聚體能夠以高親和力結(jié)合 PDGF BB 禾口 PDGF AB (Westermark & Heldin (1993)Acta Oncologica 32 101)。所述特異性模式似乎是由于A-鏈只能結(jié)合α-受體，而B-鏈能以高親和力結(jié)合α 和β-受體亞基兩者的能力造成的?？偟膩碚f，本發(fā)明提供了能夠抑制一種或多種PDGF活性的試劑。這些PDGF-抑制劑，或PDGF拮抗劑能夠作用于一種或多種形式的所述PDGF配體。血小板衍生生長因子包括A-鏈(PDGF-A)和B-鏈(PDGF-B)的同源或異源二聚體，它們通過結(jié)合兩種相關的受體酪氨酸激酶，[α ]-受體(PDGFR- [ α ])和[β ]-受體(PDGFR- [β])并且使其二聚化發(fā)揮作用。另外，業(yè)已鑒定了所述PDGFR復合物的兩種新的蛋白酶激活配體，PDGF-C和PDGF-D (參見 Li 等，(2000)Nat. Cell. Biol. 2 :302-9 ；Bergsten 等，(2001)Nat. Cell. Biol. 3 :512-6 ； 和Uutele等，Q001) Circulation 103 :2242-47) 由于所述PDGFRs的不同的配體結(jié)合特異性，已知 PDGFR-[α ] [α ]能結(jié)合 PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB 和 PDGF-CC ； PDGFR-[β ] [β ]能結(jié)合 PDGF-BB 和 PDGF-DD ；而 PDGFR-[ α ] [β ]能結(jié)合 PDGF_AB、PDGF-BB、PDGF_CC 和 PDGF-DD (參見 Betsholtz 等，Q001)BioEssays 23 :494-507)。VEGF是分泌的二硫鍵連接的同源二聚體，它能選擇性地刺激內(nèi)皮細胞增殖，遷移，并且產(chǎn)生基質(zhì)降解酶(Conn 等，(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)87 1323-1327)； Ferrara禾口 Henzel (1989) Biochem.Biophys. Res. Commun. 161 :851-858) ；P印per 等，(1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181 :902-906 ；Unemori 等，(1992) J. Cell. Physiol. 153 557-562)，它們都是形成新血管所需要的過程。VEGF以四種形式(VEGF-121、VEGF-165、 VEGF-189, VEGF-206)存在，這是由于VEGF基因的可變剪接產(chǎn)生的(Houck等，(1991)Mol. Endocrinol. 5 :1806-1814 ;Tischer 等，(1991) J. Biol. Chem. 266 :11947-11954) 兩種較小的形式是可擴散的，而較大的兩種形式保持主要位于細胞膜上，這是它們對肝素高親和力的結(jié)果。VEGF-165還能與肝素結(jié)合，并且是最豐富的形式。VEGF-121，即不能與肝素結(jié)合的唯一形式，似乎對VEGF受體具有較低的親和力(Gitay-Goren等，(1996) J.Biol. Chem. 271 =5519-5523)以及較低的促有絲分裂效力(Keyt 等，(1996) J. Biol. Chem. 271 7788-77卯)。VEGF的生物學作用是由兩種酪氨酸激酶受體(Flt-I和Flk-1/KDR)介導的，它們的表達在很大程度上局限于內(nèi)皮來源的細胞(de Vries等，(1992)SCienCe 255 :989-991 ；Millauer 等，(1993)Cell 72 :835-846 ；Terman 等，(1991)Oncogene 6 519-524)。盡管兩種功能性受體的表達都是高親和力結(jié)合所必需的，但內(nèi)皮細胞內(nèi)的趨化性和促有絲分裂信號傳導似乎主要是通過KDR受體進行的(Park等，(1994) J.Biol.Chem.269 :25646-25654 ；Seetharam 等，(1995)Oncogene 10 :135-147 ；Waltenberger 等，(1994)J. Biol. Chem. 26988-26995)。最近業(yè)已在缺少VEGF基因的單個等位基因 (Carmeliet 等，(1996)Nature 380 :435-439 ；Ferrara 等，(1996)Nature 380 :439-442)或 Flt-I 的兩個等位基因(Fong 等，(1995) Nature 376 :66-70)或 Flk-I 基因(Shalaby 等， (1995) Nature 376 :62-66)的小鼠體內(nèi)證實了 VEGF和VEGF受體對血管發(fā)育的重要性。在每一種場合下，都發(fā)現(xiàn)血管形成的明顯的異常導致了胚胎致死?，F(xiàn)在已知由組織缺氧誘導的補償性血管生成是通過VEGF介導的(Levy等，(1996) J. Biol. Chem. 2746-2753) ；Shweiki 等，(1992)Nature 359:843-845)。在人類中所做的研究業(yè)已表明，在血管生成性視網(wǎng)膜疾病的玻璃體中存在高濃度的VEGF，但是在無活性的或非-新生血管形成疾病狀態(tài)中不存在所述高濃度的VEGF。在實驗黃斑下手術之后切斷的人類脈絡膜組織同樣表現(xiàn)出高的VEGF水平。除了是唯一的已知內(nèi)皮細胞特異性有絲分裂原之外，VEGF是血管生成生長因子中獨特的，表現(xiàn)在它在誘導血管對大分子的通透性瞬時增加的能力方面(因此，它的最初的和替代的名稱是血管通透因子，VPF)(參見Dvorak等，(1979) J. Immunol. 122 :166-174 ； Senger 等，(1983) Science 219 :983-985 ;Senger 等，(1986) Cancer Res. 46 :5629-5632) 增加了的血管通透性和所導致的血漿蛋白在血管外間隙的沉積，有助于通過提供內(nèi)皮細胞遷移的臨時基質(zhì)形成新血管(Dvorak等，(1995) Am. J. Pathol. 146 =1029-1039)。通透性過高確實是新血管的特有特征，包括與腫瘤相關的血管。PDGF 和 VEGF 拮抗劑概要本發(fā)明提供了一起用于新血管疾病的組合治療的PDGF和VEGF的拮抗劑(即，抑制劑)。特異性PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑為本領域所公知，并且簡單地描述于以下部分。 現(xiàn)在或者已經(jīng)是技術人員能夠得到的其他PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑包括抗體、適體、反義寡聚體、核酶和RNAi組合物，它們能夠通過本領域的常規(guī)實踐結(jié)合本說明書的教導和指導鑒定和生產(chǎn)，包括在下面進一步提供的部分。PDGF 拮抗劑一般，PDGF(例如，PDGF-B)的抑制可以通過多種方式實現(xiàn)。例如，可以獲得能抑制 PDGF的活性或產(chǎn)生的多種PDGF拮抗劑，并且可將其用于本發(fā)明的方法。示例性的PDGF拮抗劑包括PDGF的核酸配體或適體，如在下文中所描述的。另外，所述PDGF拮抗劑可以是， 例如，抗-PDGF抗體或抗體片段。因此，通過抑制它與受體的結(jié)合可以使所述PDGF分子失活。另外，能在核酸水平上抑制PDGF表達的諸如反義RNA、核酶和RNAi分子的核酸分子可用作本發(fā)明的拮抗劑。其他PDGF拮抗劑包括肽、蛋白、環(huán)肽或小有機化合物。另外，通過破壞它的下游信號傳導，能夠抑制PDGF的信號傳導活性，例如，通過使用多種小分子酪氨酸激酶抑制性拮抗劑，包括下面所描述的拮抗劑?；衔锘蛟噭┢鹬鳳DGF拮抗劑作用的能力可以按照本領域已知的方法確定，且另夕卜，可以參見以下文獻，例如，Dai等，(2001)Genes & Dev. 15 :1913-25 ;Zippel，等，(1989) Eur. J. Cell Biol. 50(2) :428-34 ；和 Zwiller，等， (1991)Oncogene 6 :219_21。本發(fā)明還包括本領域所公知的PDGF拮抗劑，以及下文所支持的，以及屬于普通技術人員知識范圍內(nèi)的任何和所有等同試劑。例如，抗PDGF的抑制性抗體為本領域所公知，例如，描述于美國專利號 5，976，534,5, 833，986,5, 817，310,5, 882，644,5, 662，904、 5，620，687、5，468，468和PCT WO 2003/025019中的那些，所述文獻內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。另外，本發(fā)明包括N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，它是PDGF拮抗劑，例如公開于美國專利號 5，521，184 和 W02003/01354U WO 2003/078404、WO 2003/099771、WO 2003/015282和WO 2004/05282中的那些，所述文獻被以全文形式收作本文參考。能阻斷PDGF作用的小分子為本領域所公知，例如，描述于美國專利號 6，528，526 (PDGFR酪氨酸激酶抑制劑)、6，524，347 (PDGFR酪氨酸激酶抑制劑)、 6，482，834 (PDGFR酪氨酸激酶抑制劑)、6，472，391 (PDGFR酪氨酸激酶抑制劑)、6，696，434、 6，331，555,6, 251，905,6, 245，760,6, 207，667,5, 990，141,5, 700，822,5, 618，837 和 5，731，326中的那些，所述文獻內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。能阻斷PDGF作用的蛋白和多肽為本領域所公知，例如，描述于美國專利號 6，350，731 (PDGF肽類似物)、5，952，304中的那些，所述文獻內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。能抑制EGF和/或PDGF受體酪氨酸激酶的雙單-和雙環(huán)芳基和雜芳基化合物為本領域所公知，例如，描述于例如美國專利號5，476，851,5, 480，883,5, 656，643,5, 795，889 和6，057，320中的那些，所述文獻內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。用于抑制PDGF的反義寡核苷酸為本領域所公知，例如，描述于美國專利號 5，869，462和5，821，234中的那些，每一份文獻的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。用于抑制PDGF的適體(又被稱作核酸配體)為本領域所公知，例如，描述于例如美國專利號 6，582，918,6, 229，002,6, 207，816,5, 668，264,5, 674，685 和 5，723，594 中的那些，每一份文獻的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。本領域所公知的用于抑制PDGF的其他化合物包括，描述于美國專利號 5，238，950,5，418，135,5，674，892,5，693，610,5，700，822,5，700，823,5，728，726, 5，795，910,5，817，310,5，872，218,5，932，580,5，932，602,5，958，959,5，990，141, 6，358，954,6, 537，988和6，673，798中的那些，每一份文獻的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。VEGF 拮抗劑VEGF(例如，VEGF-A)的抑制是通過多種方式實現(xiàn)的。例如，能抑制VEGF活性或產(chǎn)生的多種VEGF拮抗劑，包括核酸分子，如適體、反義RNA、核酶、RNAi分子和VEGF抗體可以獲得，并且能夠用于本發(fā)明的方法中。示例性的VEGF拮抗劑包括VEGF的核酸配體或適體，正如下文所描述的。對VEGF-A的特別有用的拮抗劑是EYE001 (以前稱為NX1838)，它是修飾過的、PEG化的適體，它能以高的和特異性親和力結(jié)合主要的可溶性人VEGF同工型 (參見，美國專利號6,011, 020 ；6, 051，698 ；和6，147，204)。所述適體能夠以與針對VEGF的高親和力抗體類似的方式結(jié)合并且使VEGF失活。另一種有用的VEGF適體是EYE001，它是非-PEG化的形式的。另外，所述VEGF拮抗劑可以是，例如，抗-VEGF抗體或抗體片段。因此，通過抑制它與受體結(jié)合使VEGF分子失活。另外，能在核酸水平上抑制VEGF表達或RNA 穩(wěn)定性的諸如反義RNA、核酶和RNAi分子的核酸分子可用作本發(fā)明的方法和組合物中的拮抗劑。其他VEGF拮抗劑包括肽、蛋白、環(huán)肽和小有機化合物。例如，能結(jié)合VEGF受體而又無伴隨的信號傳導活性的可溶性截短形式的VEGF也可用作拮抗劑。另外，VEGF的信號傳導活性可以通過破壞它的下游信號傳導抑制，例如，通過使用多種拮抗劑，包括VEGF受體酪氨酸激酶活性的小分子抑制劑，正如下文所進一步描述的?；衔锘蛟噭┢鹬鳹EGF拮抗劑作用的能力，可以按照本領域所熟知的多種標準方法確定。例如，VEGF的生物學活性之一是通過與血管內(nèi)皮細胞上的受體結(jié)合來增強血管通透性。所述相互作用導致了緊密的內(nèi)皮連接的松弛，其后果是造成血管流體的泄漏。通過VEGF誘導的血管泄漏可以在體內(nèi)測量，其通過跟蹤由于皮內(nèi)注射VEGF導致的伊文思藍染料從豚鼠脈管系統(tǒng)的泄漏來進行(Dvorak等，in Vascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor, Microvascular HyperpermeabiIity, and AngiogenesisJP (1995) Am. J. Pathol. 146 :1029)。類似地，可以將所述測定方法用于測量拮抗劑阻斷VEGF的這種生物學活性的能力。在血管通透性測定的有用的例子中，VEGF165Q0-30nM)與ΕΥΕ001 (30ηΜ_1 μ Μ)或候選VEGF拮抗劑離體(ex vivo)預混合，并且隨后通過皮內(nèi)注射施用到豚鼠背部的剔毛的皮膚中。在注射之后30分鐘，按照標準方法對注射部位周圍的伊文思藍染料泄漏進行定量，其通過使用計算機化的形態(tài)度量分析系統(tǒng)實現(xiàn)。能抑制VEGF-誘導的指示染料從脈管系統(tǒng)中泄漏的化合物被認為是本發(fā)明的方法和組合物的有用拮抗劑。用于確定化合物是否是VEGF拮抗劑的另一種測定方法是所謂的角膜血管發(fā)生測定。在該測定方法中，將含有VEGF165(3pmol)的methacyrate聚合物沉淀植入大鼠的角膜基質(zhì)中，以誘導血管生長進入正常的無血管角膜。然后將候選VEGF拮抗劑通過靜脈內(nèi)途徑施用到大鼠體內(nèi)，劑量為lmg/kg、3mg/kg和10mg/kg，每天一次或兩次，施用5天時間。在治療時間段結(jié)束時，對所有個體的角膜進行顯微照相。新血管在角膜組織中發(fā)育的程度，以及候選化合物對它們的抑制作用，隨后通過顯微照片的標準化形態(tài)度量分析進行定量。與用磷酸緩沖鹽水(PBQ處理相比，能抑制角膜中VEGF-依賴型血管發(fā)生的化合物被認為是本發(fā)明的方法和組合物的有用的拮抗劑。還使用早熟性視網(wǎng)膜病的小鼠模型鑒定了候選VEGF拮抗劑。在一個有用的例子中，分別將9、8、8、7和7只小鼠同窩崽放置在室內(nèi)空氣中或者增加含氧量，并且通過腹膜內(nèi)用磷酸緩沖鹽水(PBS)或候選VEGF拮抗劑進行處理(例如，以lmg/kg、3mg/kg或10mg/kg/ 天進行處理)。然后通過在來自所有處理過的和對照小鼠的每只眼的20個組織學切片中進行顯微鏡鑒定和新血管芽計數(shù)來估計測定終點，即新毛細血管通過角膜的內(nèi)界膜長出到玻璃體液中。相對未處理過的對照而言處理過的小鼠的視網(wǎng)膜新脈管系統(tǒng)的減少被確定為鑒定有用的VEGF拮抗劑。在另一種示例性的篩選測定方法中，使用體內(nèi)人類腫瘤異種移植測定鑒定候選 VEGF拮抗劑。在這種篩選測定中，在植入裸鼠中的人類腫瘤異種移植物(A673橫紋肌肉瘤和Wilms腫瘤)中檢測候選VEGF拮抗劑的體內(nèi)功效。然后用候選VEGF拮抗劑處理小鼠 (例如，10mg/kg，每天腹膜內(nèi)施用一次，然后發(fā)展為確定的腫瘤QOOmg))。用對照試劑處理對照組。被確定為相對對照而言能抑制A673橫紋肌肉瘤生長和Wilms腫瘤的候選化合物被認為是本發(fā)明的方法和組合物的有用的拮抗劑。測定VEGF拮抗劑活性的其他方法為本領域所公知，并且在下文進一步描述。本發(fā)明還包括本領域所公知的VEGF拮抗劑，以及下面所支持的那些，和普通技術人員知識范圍內(nèi)的任何和所有等同試劑。例如，針對VEGF的抑制抗體為本領域所公知，例如，描述于美國專利號 6，524，583,6, 451，764(VRP 抗體)、6，448，077,6, 416，758、 6，403，088 (針對 VEGF-C)、6，383，484(針對 VEGF-D)、6，342，221(抗-VEGF 抗體)、 6，342，219,6, 331，301 (VEGF-B 抗體)和 5，730，977，和 PCT
發(fā)明者A·P·亞當米斯, D·施馬, P·卡利亞斯 申請人:奧普索特克公司