專利名稱：用于預(yù)防和治療輻射損傷的rx31肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種自由基清除肽及其在預(yù)防和治療輻射損傷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們與各種輻射接觸的機(jī)會(huì)越來越多。在日常生活中，手機(jī)、電腦、微波爐等家用電器，已經(jīng)成為人們身邊各種輻射的主要來源。自日本“3. 11”大地震以來，核污染和核設(shè)施泄漏等突發(fā)性事故也備受人們的關(guān)注。機(jī)體受到輻射損害，會(huì)導(dǎo)致患惡性腫瘤幾率增加、生殖細(xì)胞和胎兒損傷、生長發(fā)育遲緩等嚴(yán)重后果；作為惡性腫瘤的主要治療手段，放療對(duì)機(jī)體正常組織的損傷也不容忽視，如何在放療過程中保護(hù)瘤旁和遠(yuǎn)端正常組織，亦是放射醫(yī)學(xué)和腫瘤治療關(guān)注的熱點(diǎn)。輻射對(duì)機(jī)體的損傷主要來自兩方面一是輻射能量傳遞的直接作用，二是間接作用即通過水在輻射反應(yīng)中產(chǎn)生自由基引起的損傷。對(duì)于輻射直接作用，除機(jī)械屏蔽別無更佳選擇。因此抗輻射藥物研究主要應(yīng)從緩解或阻斷輻射間接作用上探尋有效途徑。目前抗輻射藥物主要包括細(xì)胞因子、激素及中藥復(fù)方等，它們大都通過促進(jìn)機(jī)體免疫和造血功能恢復(fù)而間接達(dá)到減輕輻射損傷目的，尚缺乏功能明確、可直接阻斷輻射損傷作用環(huán)節(jié)的藥物；而被證明有效的含硫抗氧化劑代表阿米福汀(氨磷汀)，又因明顯的毒性反應(yīng)而使其應(yīng)用受到限制。鑒此，研制結(jié)構(gòu)新穎、機(jī)制明確、安全有效，特別是能夠直接阻斷輻射損傷環(huán)節(jié)的新一代抗輻射藥物勢在必行。研究已證實(shí)自由基在輻射間接損傷中扮演中心角色，研究者也致力于通過清除自由基這一途徑尋找有效的抗輻射藥物。但是，迄今尚無外源性抗氧化劑(如S0D，GSH)可達(dá)理想的清除自由基、阻斷輻射損傷作用。究其根本，這些抗氧化劑不能進(jìn)入細(xì)胞，只能部分緩解自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷，而無法阻斷胞內(nèi)質(zhì)膜與細(xì)胞器的損傷。特別是對(duì)輻射損傷的中心環(huán)節(jié)——線粒體，缺乏根本的保護(hù)作用。輻射條件下，細(xì)胞內(nèi)自由基的重要來源為線粒體，其內(nèi)膜上的呼吸鏈中有
的氧可經(jīng)旁路反應(yīng)形成活性氧(ROS)自由基。而線粒體特殊的雙層膜結(jié)構(gòu)和裸露的 DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)決定其更容易受到ROS的損害。線粒體損傷導(dǎo)致氧化磷酸化功能降低，能量耗竭，又會(huì)產(chǎn)生大量的R0S，從而進(jìn)入惡性循環(huán)，最終觸發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死。因此，線粒體是電離輻射“由內(nèi)而外”損傷的中心環(huán)節(jié)，而進(jìn)入線粒體內(nèi)部俘獲并清除 R0S，從而保護(hù)線粒體及整個(gè)細(xì)胞，是新型抗輻射藥物研究的重要切入點(diǎn)。本發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)制備得到了靶向線粒體，并能有效清除活性氧自由基，從而減輕輻射對(duì)細(xì)胞及計(jì)提損傷的新型肽類化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于預(yù)防或治療輻射損傷的藥物。本發(fā)明提供了一種肽類化合物，所述肽類化合物是一種由4個(gè)氨基酸殘基組成的
3寡肽，在本發(fā)明中命名為RX31肽，其序列為D-Arg-Dmt-LyS-Phe-NH2，其中Dmt為二甲基酪氨酸。此外，本發(fā)明提供了一種藥用藥物組合物，其中包含所述RX31肽和藥物學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，RX31組合物的劑型為注射劑，使用的藥物學(xué)上可接受的載體為生理鹽水或PBS。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述RX31肽的給藥劑量為 8 32mg/kg。本發(fā)明提供的寡肽適用于預(yù)防和治療輻射引起的機(jī)體損傷。早期研究顯示，RX31肽有良好的水溶性，能夠非電壓依賴性穿過質(zhì)膜進(jìn)入線粒體， 靶向定位于線粒體內(nèi)膜并清除自由基；在局部缺血_再灌注損傷模型中，RX31肽能有效減少梗阻器官的壞死。ADME/T研究表明，RX31肽穩(wěn)定性良好，能通過血腦屏障，并有較高的生物利用度。初步的毒性實(shí)驗(yàn)顯示，RX31肽高效低毒，具有良好的藥用前景。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，RX31肽能在低濃度下有效保護(hù)細(xì)胞的增殖活性，且呈一定劑量效應(yīng)關(guān)系。其作用機(jī)制是清除由輻射產(chǎn)生的R0S，保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，從而阻斷由線粒體功能障礙引起的細(xì)胞壞死。本發(fā)明提供的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，RX31肽能有效提高小鼠致死劑量照射后的生存率，延長生存時(shí)間，并減緩體重下降，提升外周血象。RX31肽的此種保護(hù)作用，源于藥物減少照射引起的免疫造血系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)的ROS蓄積，保護(hù)線粒體并增加存活細(xì)胞比例，從而增加骨髓干細(xì)胞集落形成能力，并阻止淋巴細(xì)胞枯竭。另一方面，本發(fā)明提供了所述的肽類化合物在制備用于預(yù)防或治療輻射損傷的藥物中的用途。其中所述的輻射為放射輻射，優(yōu)選為核輻射或6tlCo γ射線輻射。所述藥物可以在輻射前，也可以在輻射后施用。另一方面，本發(fā)明提供了所述的肽類化合物在制備細(xì)胞增殖活性保護(hù)劑中的用途。另一方面，本發(fā)明提供了所述的肽類化合物在制備細(xì)胞凋亡抑制劑中的用途。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明所述的肽能有效進(jìn)入細(xì)胞，對(duì)輻射后細(xì)胞線粒體和細(xì)胞都有顯著的保護(hù)作用；2. RX31肽不僅照射前應(yīng)用能夠提供輻射保護(hù)，而且在照射后給藥對(duì)輻射損傷也有治療作用。3. RX31肽皮下注射給藥的輻射損傷防護(hù)效果優(yōu)于腹腔注射給藥，單次給藥就可達(dá)到最佳療效，使用方便快捷。


圖1為MTS法檢測本發(fā)明所述肽對(duì)輻射后細(xì)胞的增殖活性影響；圖2a為本發(fā)明所述肽對(duì)輻射后細(xì)胞內(nèi)02_產(chǎn)生的影響情況；圖2b為本發(fā)明所述肽對(duì)輻射后細(xì)胞內(nèi)H2O2產(chǎn)生的影響情況；圖3為本發(fā)明所述肽對(duì)輻射后細(xì)胞生存情況的影響；圖4為本發(fā)明所述肽對(duì)輻射后細(xì)胞周期的影響；圖5為本發(fā)明所述肽對(duì)輻射后細(xì)胞線粒體膜電位的保護(hù)作用；圖6為本發(fā)明所述肽對(duì)輻射后小鼠30d生存率的影響；
圖7為本發(fā)明所述肽對(duì)輻射后小鼠30d平均生存時(shí)間的影響；圖8為本發(fā)明所述肽對(duì)輻射后小鼠30d平均體重改變的影響；圖9為本發(fā)明所述肽對(duì)輻射后小鼠外周血像的影響；圖10為本發(fā)明所述肽對(duì)輻射后小鼠骨髓干細(xì)胞集落形成能力影響；圖11為本發(fā)明所述肽對(duì)輻射后小鼠脾和胸腺器官指數(shù)的影響；圖12為本發(fā)明所述肽對(duì)輻射后脾淋巴細(xì)胞生存狀態(tài)的影響。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而絕不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。除另有說明外，本申請(qǐng)中的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。本申請(qǐng)中引用的任一專利、專利申請(qǐng)和出版物在此引入作為參考。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常采用常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的方法。
實(shí)施例實(shí)施例1RX31肽的制備RX31肽(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)用固相合成法制備。通過質(zhì)譜確證其化學(xué)結(jié)構(gòu)， 紫外檢測器測定其純度> 98%，用無菌PBS配制溶液備用。實(shí)施例2RX31對(duì)輻射后細(xì)胞增殖活性的保護(hù)中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，常規(guī)培養(yǎng)，傳代3 5代后消化收集，細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)并稀釋到6*104/mL，與不同濃度RX31共同孵育15 20min。之后用6tlCo γ射線照射，總劑量7. 5Gy，將照射后的細(xì)胞鋪板。照射后48小時(shí)，MTS法檢測細(xì)胞增殖活性，并與空白對(duì)照 (正常組)和陰性對(duì)照(照射損傷組)相比較。結(jié)果見圖1。結(jié)果可見，RX31對(duì)細(xì)胞有顯著保護(hù)作用，并在給藥濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出一定的劑量_效應(yīng)關(guān)系。具體表現(xiàn)為隨給藥濃度增加，細(xì)胞增殖活性損傷越小，且與陰性對(duì)照有顯著差異(附圖中 * :p < 0. 05，** :p < 0. 01，*** :p < 0. 001)。實(shí)施例3RX31對(duì)輻射后細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量影響的測定細(xì)胞與RX31孵育15 20min后照射，照后不同時(shí)間點(diǎn)分別用DHE和DCF探針(購自Sigma)標(biāo)記胞內(nèi)的O2 -和H2O2，流式細(xì)胞術(shù)檢測平均熒光強(qiáng)度，并與空白對(duì)照(正常組) 和陰性對(duì)照(照射損傷組)相比較。具體結(jié)果如表1，表2及圖2所示(附表及附圖中
ρ < 0. 05, ** :p < 0. 01，:p < 0. 001)。表1RX31對(duì)胞內(nèi)0廠產(chǎn)生的影響(平均熒光強(qiáng)度，mean士SD，η = 3)
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防或治療輻射損傷的藥物組合物，其中含有肽類化合物和藥物學(xué)上可接受的載體，所述肽類化合物由4個(gè)氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)式為D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2，其中 Dmt為二甲基酪氨酸。
2.權(quán)利要求1所述的藥物組合物，該組合物為注射劑，其中所述的藥物學(xué)上可接受的載體為PBS或生理鹽水。
3.權(quán)利要求1所述的肽類化合物在制備用于預(yù)防或治療輻射損傷的藥物中的用途。
4.權(quán)利要求3所述的用途，其中所述的輻射為放射輻射。
5.權(quán)利要求4所述的用途，其中所述的放射輻射為核輻射。
6.權(quán)利要求4所述的用途，其中所述的放射輻射為6tlCoγ射線輻射。
7.權(quán)利要求3至6中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述藥物為在輻射前或輻射后施用。
8.權(quán)利要求1所述的肽類化合物在制備細(xì)胞增殖活性保護(hù)劑中的用途。
9.權(quán)利要求1所述的肽類化合物在制備細(xì)胞凋亡抑制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種化學(xué)合成肽及其在預(yù)防和治療輻射損傷中的應(yīng)用。所述化學(xué)合成肽可有效降低輻射后的細(xì)胞內(nèi)活性氧含量，減輕自由基對(duì)線粒體的損傷，并能顯著減少輻射導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和壞死，增加細(xì)胞存活比例；并可通過對(duì)輻射后小鼠的免疫造血系統(tǒng)的保護(hù)，從而顯著提高致死劑量輻射小鼠的生存率，延長平均生存時(shí)間，改善生存質(zhì)量。
文檔編號(hào)A61P39/06GK102327600SQ20111027185
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者付潔, 向慎思, 宋海峰, 歐倫, 王清清, 董立厚, 鄒佳, 陳方, 高新 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所