專利名稱：一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，尤其是一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的純化、濃縮工藝的設(shè)計(jì)方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬細(xì)小病毒(PPV)能夠引起母豬繁殖障礙疾病，導(dǎo)致母豬產(chǎn)死胎、木乃伊胎、早期胚胎死亡和母豬不育等。目前該病已呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。德國(guó)學(xué)者M(jìn)ayr首次最早發(fā)現(xiàn)了 PPV，我國(guó)學(xué)者潘雪珠等1983年成功實(shí)現(xiàn)該病毒的分離。目前PPV疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因工程活病毒載體疫苗等，其中滅活疫苗具有安全性好、產(chǎn)生抗體時(shí)間長(zhǎng)、不需要低溫保存的優(yōu)點(diǎn)；弱毒疫苗免疫效力較強(qiáng)、產(chǎn)生抗體快、用量少、成本低，但安全性較差；基因工程亞單位疫苗免疫源性較好，但成本和技術(shù)要求都比較高；基因工程活病毒載體疫苗可以同時(shí)預(yù)防兩種病或多種病的、能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，但生產(chǎn)技術(shù)復(fù)雜、成本較高；基因疫苗生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、免疫劑量小、成本低廉、可構(gòu)建多基因或多價(jià)疫苗，但其安全性受到廣泛關(guān)注。由于滅活疫苗的存在上述優(yōu)點(diǎn)，因此該方法得到了廣泛的應(yīng)用。我國(guó)均普遍使用豬細(xì)小病毒滅活疫苗,使用的主要滅活劑有福爾馬林、￠-丙內(nèi)酯(^-PL) ,N-乙酰乙烯亞胺(AEI)、二乙烯亞胺(BEI)等。有試驗(yàn)表明，豬細(xì)小病毒用福爾馬林滅活后制成疫苗的保護(hù)效果不如用N-乙酰乙烯亞胺滅活后制成疫苗的保護(hù)效果好；用^-丙內(nèi)酯滅活疫苗的保護(hù)力較好。免疫佐劑也是影響豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效果的重要因素，但幾種佐劑的混合物，如油佐劑、SDS、L-121、氫氧化鋁和油乳劑的混合物以及SDS、氫氧化鋁的混合物作佐劑的疫苗產(chǎn)生的抗體滴度均較低。目前經(jīng)常采用的佐劑是蜂膠、氫氧化鋁和油水乳劑。豬細(xì)小病毒滅活多聯(lián)疫苗的使用較為廣泛，主要有豬細(xì)小病毒-豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒-乙腦病毒等二聯(lián)苗，因?yàn)槌素i細(xì)小病毒外，豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征障礙病毒(PRRSV)、乙腦病毒(JEV)等均能引起母豬的繁殖障礙，而且多聯(lián)苗的使用可以簡(jiǎn)化免疫程序，降低臨床應(yīng)激反應(yīng)，適合規(guī)?；B(yǎng)豬。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種解決豬細(xì)小病毒的濃縮、純化及滅活的工藝設(shè)計(jì)問題；提供一種安全可行的疫苗生產(chǎn)方法，使該疫苗的生產(chǎn)能夠不再依賴傳統(tǒng)工藝從而生產(chǎn)出高滴度的毒液，提高抗原含量，滿足免疫生產(chǎn)要求。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟(I)將豬細(xì)小病毒液從原料罐中放入微濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾，得到滲透液及濃縮液，所述滲透液中不含有細(xì)菌及細(xì)胞碎片雜質(zhì)，所述濃縮液返回原料罐，當(dāng)豬細(xì)小病毒液固含量大于或等于lg/L后，將豬細(xì)小病毒液排出；(2)將通過步驟(I)處理的滲透液，進(jìn)行超濾處理，進(jìn)一步濃縮毒液，直到病毒血凝價(jià)達(dá)到到28 213時(shí)停止?jié)饪s，得到濃縮液；(3)將步驟(2)處理完的濃縮液用微濾系統(tǒng)再過濾，處理完后得到血凝價(jià)為28 213的細(xì)小病毒毒液；(4)將步驟(3)得到的細(xì)小病毒毒液滅活及將濃縮及滅活后病毒液制備成疫苗產(chǎn)品。血凝實(shí)驗(yàn)(HA)是指病毒的血凝素，能選擇性地使某種或某幾種動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象成為血凝，也稱為直接雪凝反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)稱血凝實(shí)驗(yàn)，病毒血凝價(jià)是指血凝試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果。固含量，又叫“不揮發(fā)份含量”，是乳液或涂料在規(guī)定條件下烘干后剩余部分占總 量的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。進(jìn)一步，所述微濾膜孔徑為IOOnm 220nm，超濾膜孔徑為5KD 200KD。進(jìn)一步，所述的微濾和超濾膜分離材料可以是有機(jī)膜材料也可以是無機(jī)膜材料。主要包括陶瓷材料、金屬材料及有機(jī)高分子材料。其中有機(jī)高分子主要有醋酸纖維素、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚酰胺、聚乙烯醇或聚哌嗪酰胺；無機(jī)氧化物材料主要有氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯以及氧化鉿。進(jìn)一步，所述微濾及超濾的操作條件為溫度5 50°C，壓力0. 01 0. 5MPa，膜面流速I 5m/ s。進(jìn)一步，在步驟(4)中，所述細(xì)小病毒毒液的滅活包括收集步驟(3)得到的細(xì)小病毒毒液，采用二乙烯亞胺作為滅活劑，滅活劑濃度為0. I % I %，滅活溫度為25 38°C，滅活時(shí)間為24 120小時(shí)。進(jìn)一步，在步驟(4)中，所述將濃縮及滅活后病毒液制備成疫苗產(chǎn)品的具體步驟為(I)油相制備取注射用白油90 98份，加硬脂酸鋁I 3份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司本-804 8份，混合后，在壓強(qiáng)為0. IMP 0. 15MP、溫度為115 130°C的條件下，滅菌備用；(2)水相制備取濃縮后滅活的病毒液90 98份，加入滅菌的吐溫-802 8份，充分搖動(dòng)，直到吐溫-80完全溶解；(3)乳化取油相2 4份置于乳化罐中，攪拌的同時(shí)緩慢加入水相I份，持續(xù)攪拌30 70分鐘，攪拌速度600 1200r/min，后通過剪切機(jī)2 3次剪切，剪切速度3000 5000r/min,即制成豬細(xì)小病毒滅活疫苗。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的技術(shù)方案用于豬細(xì)小病毒滅活疫苗的純化、濃縮工藝設(shè)計(jì)，提高了疫苗的抗原含量、去除了雜蛋白，改善了疫苗的免疫效果，同時(shí)減少了注射疫苗時(shí)動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)；使動(dòng)物在獲得疫病保護(hù)的同時(shí)不影響相關(guān)生產(chǎn)性能，增加了養(yǎng)殖戶的收益，具有廣泛的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例I本實(shí)施案例說明豬細(xì) 小病毒毒液制備的方法I、細(xì)胞制備從液氮罐中取出細(xì)胞置37°C水浴中快速融化，將細(xì)胞移入裝有10%胎牛血清細(xì)胞生長(zhǎng)液的細(xì)胞瓶中，37°C培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)成良好單層時(shí)用胰酶消化液消化細(xì)胞，按I 2傳代逐級(jí)擴(kuò)大。將擴(kuò)大培養(yǎng)的種子細(xì)胞接種到15000ml毫升轉(zhuǎn)瓶中，每瓶加IOOOml含10%新生牛血清的細(xì)胞生長(zhǎng)液，37°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶速度為6 12轉(zhuǎn)/小時(shí)，待長(zhǎng)成良好單層后，用胰酶消化液消化細(xì)胞，按I : 3分瓶傳代。2、病毒繁殖取F13代BJ-2株P(guān)PV生產(chǎn)種毒，按2%接種量接種于生長(zhǎng)良好的ST細(xì)胞，同時(shí)加入含2%胎牛血清的細(xì)胞維持液，37°C培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)情況。3、收獲與保存接毒后每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和病變(CPE)的情況，并做好詳細(xì)記錄。培養(yǎng)至72 96小時(shí)，當(dāng)CPE達(dá)到70-80%時(shí)收獲培養(yǎng)物，反復(fù)凍融2 3次，_20°C以下保存?zhèn)溆?，時(shí)間不超過6個(gè)月。實(shí)施例2本實(shí)施案例說明豬細(xì)小病毒純化、濃縮的方法取血凝價(jià)為28的豬細(xì)小病毒液20000毫升，進(jìn)行純化、濃縮，測(cè)定血凝價(jià)，比較其濃縮前后的差異。具體步驟如下(I)將原料液加入孔徑為0. 22微米的微濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾，濃縮液返回原料罐，大約10分鐘后將原料液排出；收集滲透壓，此時(shí)觀察滲透液、清澈、明亮，既已除去細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，進(jìn)入下一步超濾濃縮步驟。(2)細(xì)小病毒毒液的超濾濃縮將已預(yù)處理的滲透液，用lm2的截留分子量為30KD的聚醚砜平板膜包濃縮，進(jìn)一
步濃縮毒液，濃縮參數(shù)見下表
權(quán)利要求
1.一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于，其制備步驟具體如下 (1)將豬細(xì)小病毒液從原料罐中放入微濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾，得到滲透液及濃縮液，所述滲透液中不含有細(xì)菌及細(xì)胞碎片雜質(zhì)，所述濃縮液返回原料罐，當(dāng)豬細(xì)小病毒液固含量大于或等于lg/L后，將豬細(xì)小病毒液排出； (2)將通過步驟(I)處理的滲透液，進(jìn)行超濾處理，進(jìn)ー步濃縮毒液，直到病毒血凝價(jià)達(dá)到到28 213時(shí)停止?jié)饪s，得到濃縮液； (3)將步驟(2)處理完的濃縮液用微濾系統(tǒng)再過濾，處理完后得到血凝價(jià)為28 213的細(xì)小病毒毒液； (4)將步驟(3)得到的細(xì)小病毒毒液滅活及將濃縮及滅活后病毒液制備成疫苗產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述微濾膜孔徑為IOOnm 220nm，超濾膜孔徑為5KD 200KD。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的微濾和超濾的膜為陶瓷材料、金屬材料、有機(jī)高分子材料、無機(jī)氧化物材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述有機(jī)高分子材料為醋酸纖維素、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚酰胺、聚こ烯醇或聚哌嗪酰胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述無機(jī)氧化物材料為氧化鋁、氧化鈦、氧化錯(cuò)、氧化鉿。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述微濾及超濾的操作條件為溫度5 50°C，壓カO. 01 O. 5MPa，膜面流速I 5m/s。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述細(xì)小病毒毒液的滅活包括收集步驟(3)得到的細(xì)小病毒毒液，采用ニこ烯亞胺作為滅活劑，滅活劑濃度為O.1% 1%，滅活溫度為25 38°C，滅活時(shí)間為24 120小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述將濃縮及滅活后病毒液制備成疫苗產(chǎn)品的具體步驟為 (1)油相制備取注射用白油90 98份，加硬脂酸鋁I 3份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司本-80 4 8份，混合后，在壓強(qiáng)為O. IMP O. 15MP、溫度為115 130°C的條件下，滅菌備用； (2)水相制備取濃縮后滅活的病毒液90 98份，加入滅菌的吐溫-802 8份，充分搖動(dòng)，直到吐溫-80完全溶解； (3)乳化取油相2 4份置于乳化罐中，攪拌的同時(shí)緩慢加入水相I份，持續(xù)攪拌30 70分鐘，攪拌速度600 1200r/min，后通過剪切機(jī)2 3次剪切，剪切速度3000 5000r/min,即制成豬細(xì)小病毒滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，其制備步驟具體如下(1)將豬細(xì)小病毒液從原料罐中放入微濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾，得到滲透液及濃縮液，所述濃縮液返回原料罐，當(dāng)豬細(xì)小病毒液固含量大于或等于1g/L后，將豬細(xì)小病毒液排出；(2)將滲透液進(jìn)行超濾處理，進(jìn)一步濃縮毒液，直到病毒血凝價(jià)達(dá)到到28～213時(shí)停止?jié)饪s，得到濃縮液；(3)將濃縮液用微濾系統(tǒng)再過濾，處理完后得到血凝價(jià)為28～213的細(xì)小病毒毒液；(4)將細(xì)小病毒毒液滅活及將濃縮及滅活后病毒液制備成疫苗產(chǎn)品。本發(fā)明提供一種安全可行的疫苗生產(chǎn)方法，使該疫苗的生產(chǎn)能夠不再依賴傳統(tǒng)工藝從而生產(chǎn)出高滴度的毒液，提高抗原含量，滿足免疫生產(chǎn)要求。
文檔編號(hào)A61P31/20GK102688485SQ20111027610
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者傅元華, 沈明君, 潘杰, 范娟, 錢鐘 申請(qǐng)人:揚(yáng)州優(yōu)邦生物制藥有限公司