專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于ezrin磷酸化的物質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于ezrin磷酸化的物質(zhì)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞腫瘤是東南亞人民一種主要的健康威脅。尤其在中國(guó)境內(nèi)，其發(fā)病率同死亡率在所有惡性腫瘤中排名第三，占了全世界總病患數(shù)的42. 5%。盡管經(jīng)過(guò)了許多年不懈的努力，當(dāng)前治療策略的長(zhǎng)期療效仍不甚理想。其在肝組織內(nèi)的高復(fù)發(fā)率和癌組織對(duì)遠(yuǎn)病灶組織的高轉(zhuǎn)移率均導(dǎo)致了治愈率的大大降低。因此，針對(duì)肝細(xì)胞腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的研究，尋求其有效的治療手段是最首要的任務(wù)。在腫瘤治療過(guò)程中，當(dāng)今的絕大部分治療方案都是抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是臨床腫瘤學(xué)上的一個(gè)重要難題是一旦腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，任何抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物均告無(wú)效。因此，肝癌臨床治療的預(yù)后以及抑制或預(yù)防腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方案在臨床腫瘤治療學(xué)中具有更為重要的作用。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的生物學(xué)過(guò)程，包括了癌細(xì)胞從原始癌灶解離，侵入血管或者淋巴組織，經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，從血管浸出以及在目標(biāo)器官中的增殖等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抑制Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的物質(zhì)在制備具有抑制腫瘤功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了抑制ferin第567位蘇氨酸磷酸化的物質(zhì)在制備具有抑制腫瘤功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述抑制ferin第567位蘇氨酸磷酸化的物質(zhì)為如下1)或2~)中任意一種1)如下所述蛋白或所述編碼基因或所述重組載體或重組腺病毒載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組腺病毒；2)抑制介導(dǎo)Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的信號(hào)通路的物質(zhì)。所述抑制介導(dǎo)Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的信號(hào)通路的物質(zhì)為抑制Mio激酶表達(dá)/或活性的物質(zhì)。所述抑制他0激酶表達(dá)和/或活性的物質(zhì)為如下A)或B)A) Rho 激酶抑制劑 Y27632 ；B) Rho激酶SiRNA，所述siRNA的一條鏈的核苷酸序列為序列表中的序列1。所述抑制腫瘤為抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和/或擴(kuò)散。所述腫瘤為肝癌。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種具有抑制腫瘤功能的產(chǎn)品。本發(fā)明提供的具有抑制腫瘤功能的產(chǎn)品，其活性成分為抑制Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的物質(zhì)。所述抑制ferin第567位蘇氨酸磷酸化的物質(zhì)為如下1)或2~)中任意一種1)如下所述所述蛋白或所述編碼基因或所述重組載體或重組腺病毒載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組腺病毒；2)抑制介導(dǎo)Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的信號(hào)通路的物質(zhì)。所述抑制他0激酶表達(dá)/或活性的物質(zhì)為如下A)或B)A) Rho 激酶抑制劑 Y27632 ；B) Rho激酶SiRNA，所述siRNA的一條鏈的核苷酸序列為序列表中的序列1。Rho激酶的抑制劑Y27632購(gòu)自美國(guó)Milipore公司，編號(hào)SCM075。所述抑制腫瘤為抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和/或擴(kuò)散。所述腫瘤為肝癌；所述產(chǎn)品為藥物。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種蛋白。本發(fā)明提供的蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；幻將序列表中序列2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。所述蛋白的編碼基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述編碼基因?yàn)?)、2)或3)1)序列表中的序列3所示的DNA分子；2)與1)限定的DNA序列至少具有80%同源性且具有相同功能蛋白的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且具有相同功能蛋白的DNA分子。含有所述編碼基因的重組載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組腺病毒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述重組載體具體為1)或2)1)所示的重組載體為將所述編碼基因插入pShuttleCMV載體的Mil和NotI酶切位點(diǎn)間得到的載體；2)所示的重組載體為將含有所述編碼基因的片段插入pShuttleCMV載體的MlI 和NotI酶切位點(diǎn)間得到的載體；2)所示的重組載體具體按如下方法制備以序列6和序列7所示的DNA作為引物， 以CFP-Ezrin質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)末端平端化和加磷處理后，進(jìn)行自連接，產(chǎn)物再通過(guò)Mll+Notl酶切下5738bp片段，將該片段與同樣酶切得到的pShuttleCMV載體大片段連接，得到質(zhì)粒 pShuttleCMV-CFP-Ezrin567A。所述重組腺病毒載體具體為將所述重組載體與pAdeasy-Ι載體同源重組得到的載體；所述重組腺病毒具體為重組腺病毒載體與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)，裝配得到的腺病 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一個(gè)在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，對(duì)其轉(zhuǎn)移和/ 或擴(kuò)散進(jìn)行診斷的標(biāo)志，即伴隨肝癌轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的Ezrin第567位蘇氨酸的磷酸化。在高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞系中，具有可明顯檢測(cè)到的顯著區(qū)別于低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系的ferinThr567磷酸化的發(fā)生。因而可以將Ezrin第567位蘇氨酸的磷酸化水平作為診斷肝癌轉(zhuǎn)移/擴(kuò)散發(fā)生的標(biāo)志。同時(shí)，本發(fā)明還證實(shí)，在肝癌轉(zhuǎn)移中相伴發(fā)生的ferin第567位蘇氨酸的磷酸化受Mio激酶(ROCK)調(diào)控，敲除該激酶或者抑制其活性均可以減少肝癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生；另外，外源引入的ferin第567位蘇氨酸不可磷酸化的突變體也可以競(jìng)爭(zhēng)性的降低肝癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因此，可以通過(guò)抑制ROCK的活性或者利用腺病毒等外源轉(zhuǎn)入過(guò)量的方法制備抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物，在醫(yī)學(xué)及制藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。


圖1為原位肝癌組織和轉(zhuǎn)移灶癌組織樣品的雙向雙色電泳展示圖2為肝癌組織中ferinT567磷酸化水平的免疫染色分析圖3為ferinT567磷酸化水平對(duì)肝癌細(xì)胞侵染能力的分析圖4為他0激酶水平對(duì)肝癌細(xì)胞侵染能力的分析圖5為小鼠肝癌轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ferinT567磷酸化水平對(duì)其肝腫瘤侵染能力的影響
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所用引物及DNA序列均由上海hvitrogen公司合成。
實(shí)施例1、肝癌組織中Ezrin磷酸化水平的檢測(cè)一、肝組織雙向雙色電泳展示1、肝組織樣品制備原位癌或者轉(zhuǎn)移灶的肝臟組織樣品(自第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院獲得，患者對(duì)研究知情。)分別標(biāo)記Cy3和Cy5 (參見(jiàn)美國(guó)Amersham公司的Ktan DIGE試劑盒的使用說(shuō)明，貨號(hào)11-0033-64)。將標(biāo)記好的樣品混合，用85%的乙醇沉淀并用裂解緩沖液(7M 尿素，2M 硫化尿素，4% CHAPS, 2% DTT, 2% IPG buffer, pH4_7，ImM benzamidine, 2 μ g/ml pepstatin-A, 20 μ g/ml leupeptin, 10 μ g/ml aprotinin, ImM IJi 酸 內(nèi)，ΙμΜ microcystin-LR)重溶，IOOOOOg超高速離心20分鐘，以澄清樣品，取上清液。2、雙向雙色電泳展示在ReadyMrip，pH3_10 的膠條 IPG Strips (購(gòu)自美國(guó) Bio-fcid 公司，貨號(hào) 163-2035)中加入100 μ g上述上清液，并于室溫(25°C )溶脹18個(gè)小時(shí)。設(shè)定等電點(diǎn)聚焦的程序?yàn)閷?duì)膠條加以由300-3500V的梯度后保持穩(wěn)定的3500V運(yùn)行至總共達(dá)到80000Vh。 將膠條在平衡緩沖液(6M尿素，2%SDS，0. 375M Tris，pH8. 8，37%甘油，先用65mM DTT還原再用M3mM碘乙酰胺烷基化)平衡15分鐘。將平衡好的膠條插入梯度SDS-PAGE膠(6-16% 梯度，8X10cm)進(jìn)行電泳。2D分離的蛋白膠譜由Wiospholmager軟件進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示，圖IA為原位灶及轉(zhuǎn)移灶的肝癌樣本蛋白雙相電泳圖，原位癌細(xì)胞的蛋白標(biāo)記了 Cy3 (紅色)，而轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞的蛋白則標(biāo)記了 Cy5 (綠色)。兩色重疊的圖片展示出來(lái)自?xún)山M樣本的總蛋白譜基本類(lèi)似。但是也存在一些很明顯的差異區(qū)域。例如，圖中圈出區(qū)域標(biāo)記的ferin不同修飾亞型，在轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞中表現(xiàn)為向偏酸性端的偏移。圖IB為在轉(zhuǎn)移灶癌栓蛋白樣品中ferin的亞型，可以看出，箭頭所示(中間一圖中兩個(gè)箭頭)，原位癌細(xì)胞中主要的堿性位置(0，pi約6. 7)，在轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞中有明顯的熒光密度的減弱，并且隨著向酸性端的偏移(l，2，3，4，5;pl逐步從6.6降為62)而增強(qiáng)。這提示在轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞中Ezrin可能具有較高的磷酸化程度。Ezrin包含多種酸性亞型(圖中約八個(gè)點(diǎn)所示)，其中四個(gè)偏堿性端的點(diǎn)同原位癌樣本重合。取發(fā)生等電遷移的蛋白點(diǎn)切下用于質(zhì)譜鑒定，所得數(shù)據(jù)用加州大學(xué)舊金山分校質(zhì)譜中心開(kāi)發(fā)的MS-Fit和MS-Tag兩種軟件(prospector, ucsf. edu)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析顯示這些酸性的ferin亞型中主要包含了 567 位蘇氨酸的磷酸化。上述分析表明肝細(xì)胞肝癌的轉(zhuǎn)移可能與ezrin的磷酸化水平相關(guān)。通過(guò)雙向電泳展示了在肝細(xì)胞肝癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的過(guò)程中ezrin的磷酸化水平的變化。將經(jīng)雙向電泳分離的靶蛋白質(zhì)樣本條帶切割成約Imm3小塊，經(jīng)清洗、脫色、干燥后，用胰蛋白酶(購(gòu)自！Iomega公司，編號(hào)為V511A) 37 °C消化4小時(shí)；依次用50 %乙腈加 5%甲酸混合溶液抽提20分鐘，75%乙腈加5%甲酸抽提10分鐘，95%乙腈加上5%甲酸抽提10分鐘；每次抽提后，將溶液轉(zhuǎn)移到同一個(gè)離心管中；加熱真空干燥至溶液體積減少到 5-10 μ 1 ；最后按照說(shuō)明書(shū)用C18zip-tip(購(gòu)自Millipore公司，編號(hào)為Ζ720054)純化。將經(jīng)胰酶消化的肽段溶液與a-氰-4-羥基肉桂酸共結(jié)晶，然后在基質(zhì)輔助激光解理-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀中進(jìn)行測(cè)定和分析。測(cè)定時(shí)質(zhì)譜儀設(shè)定為正電模式，并且所得到的的數(shù)據(jù)都用標(biāo)準(zhǔn)肽段混合物進(jìn)行校正。利用MS-Fit程序?qū)﹄闹讣y譜信息進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索以確定原樣品中的蛋白成分。肽段的源后衰減數(shù)據(jù)通過(guò)MS-Tag程序處理分析，最后得到肽段的序列信息。這兩個(gè)程序由加州大學(xué)舊金山分校的質(zhì)譜學(xué)部研發(fā)，可登陸prospector, ucsf. edu.使用。數(shù)據(jù)搜索所用數(shù)據(jù)庫(kù)有NCBI網(wǎng)站提供的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss-Pot數(shù)據(jù)庫(kù)。在搜索時(shí)，蛋白分子量和肽段分子量的容忍度參數(shù)設(shè)定為100-200ppm (Parts/million)，經(jīng)鑒定結(jié)果為ezrin 磷酸化的位點(diǎn)主要為567位。圖IC來(lái)自癌旁正常組織、原位灶、轉(zhuǎn)移灶的樣本蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)膜做 western blot實(shí)驗(yàn)，分別用ezrin抗體(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，編號(hào)sc-32758)，Actin 抗體(購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，編號(hào)4967)，以及ferin Thr567磷酸化特異性抗體 (購(gòu)自Cell Signaling公司，貨號(hào)3141)，展示在轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞中，Ezrin 567位蘇氨酸發(fā)生
高度磷酸化。圖ID為轉(zhuǎn)移性癌栓蛋白樣本經(jīng)雙相電泳分離后轉(zhuǎn)膜做免疫印跡實(shí)驗(yàn)圖，從圖中看出，分別用ezrin單抗及ezrin Thr567磷酸化特異性抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)2號(hào)及3號(hào)斑點(diǎn)發(fā)生 Thr567的磷酸化，在分離所得的5個(gè)斑點(diǎn)中，2號(hào)斑磷酸化程度最高。上面的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)是7 組樣本的平均值士S. E.，2號(hào)及3號(hào)斑點(diǎn)的磷酸化水平較高，以2號(hào)為最(ρ < 0. 001)。為了鑒定同轉(zhuǎn)移相關(guān)的磷酸化殘基，將上述轉(zhuǎn)移灶樣本中的酸性點(diǎn)從膠上切下， 利用膠內(nèi)酶切技術(shù)取得肽段，以原位樣本相應(yīng)區(qū)域?yàn)閷?duì)照，利用MALDI-T0F質(zhì)譜鑒定技術(shù)鑒定磷酸化肽段。這些點(diǎn)所表示的蛋白均為ferin，而具有不同的修飾。鑒定出在腫瘤轉(zhuǎn)移中可能包含的最典型的磷酸化修飾發(fā)生在567位的蘇氨酸。隨后利用特異識(shí)別磷酸化的氨基酸殘基(絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸等)的抗體， 通過(guò)免疫印跡法對(duì)轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞中ferin的磷酸化水平做了進(jìn)一步的鑒定。如圖1C、D所示，利用特異性識(shí)別位蘇氨酸磷酸化的抗體(購(gòu)自Cell Signaling公司，貨號(hào) 3141)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移癌栓中有大量的ezrin發(fā)生了 Thr567的磷酸化，原位癌中僅有少量 ezrin發(fā)生了 567位蘇氨酸的磷酸化，而正常組織中則沒(méi)有檢測(cè)到發(fā)生567位蘇氨酸磷酸化的 ezririo二、肝癌組織中ferinT567磷酸化水平的免疫染色分析1、肝癌組織的免疫組化分析收集正常肝組織和原位肝癌以及轉(zhuǎn)移灶組織樣品(自第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院獲得)進(jìn)行免疫組化分析。首先進(jìn)行冰凍切片4 8mm，25°C放置30分鐘后，加入4°C丙酮固定 10 分鐘，PBS (pH7. 4，8g/LNaCl、0. 2g/LKCl、l. 44g/LNa2P04、0. 24g/LKH2P04)洗 3 遍后用3% (體積百分含量)過(guò)氧化氫孵育5 10分鐘，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。然后使用5%正常山羊血清(購(gòu)自Abcam公司，產(chǎn)品號(hào)ab7481) (PBS稀釋)封閉，25°C孵育20 分鐘。傾去血清，滴加稀釋后的一抗工作液(含有適當(dāng)稀釋濃度的ferin 567位蘇氨酸磷酸化特異性抗體(購(gòu)自Cell Signaling公司，貨號(hào)3141)的PBS緩沖液)，37°C孵育2小時(shí)或4°C過(guò)夜，PBS沖洗3遍后，依次滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(購(gòu)自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，編號(hào) 705-065-003) (1% BSA-PBS 稀釋)和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(購(gòu)自 Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，編號(hào) 200-032-211) (PBS稀釋)，均在37°C下孵育30分鐘后PBS沖洗3次。最后使用顯色劑顯色，再進(jìn)行復(fù)染， 封片，并使用電鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖2A所示，為癌旁正常組織樣本(a)，原位肝癌組織樣本(b)以及轉(zhuǎn)移性癌栓組織樣本(c)經(jīng)免疫組化分析，用ezrin Thr567磷酸化特異性抗體檢測(cè)。從圖中看出， 免疫組化中黃色或棕色表征的是樣本的陽(yáng)性程度，顏色越深表明陽(yáng)性程度越高，在正常肝組織中(a)，基本沒(méi)有磷酸化抗體著色；原位灶可見(jiàn)少量磷酸化抗體染色(b)；轉(zhuǎn)移灶中大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)磷酸化抗體強(qiáng)陽(yáng)性染色(c)，圖距=30 μ m.在正常肝上皮組織中，幾乎沒(méi)有ferin的567位磷酸化信號(hào)；原位癌組織中則有較弱的磷酸化信號(hào)；而如預(yù)期的一樣，轉(zhuǎn)移灶癌組織中檢測(cè)到很強(qiáng)的567位磷酸化的信號(hào)。這也與免疫印跡的結(jié)果相一致。特別的是，這些567位磷酸化的信號(hào)主要定位在肝癌細(xì)胞或者血管內(nèi)皮細(xì)胞的質(zhì)膜上。由于ferin的蛋白表達(dá)水平在原位癌和轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞中基本一致 (圖1C)，因此可以得出，Ezrin的567位的磷酸化同肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)。2、利用免疫熒光檢測(cè)肝癌組織中ferin567位蘇氨酸磷酸化情況收集正常肝組織和原位肝癌以及轉(zhuǎn)移灶組織樣品(自第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院獲得，患者知情)，分別鋪入M孔板的孔內(nèi)(含有載玻片)，附著后用預(yù)冷的PBS緩沖液洗一遍。棄去溶液，迅速用新鮮配制的2%的甲醛(溶解于PBS中)固定細(xì)胞5分鐘，固定后用PBS緩沖液洗三遍，每次5分鐘。對(duì)其中一個(gè)蓋玻片用含有0.1% (體積百分含量) Triton X-100的PBS緩沖液處理2分鐘使細(xì)胞膜穿孔以利于抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，另一個(gè)則不處理。接下來(lái)，用(質(zhì)量體積比)BSA(溶解于TBST緩沖液)在25°C下封閉30分鐘。用適當(dāng)稀釋的一抗ferin 567位蘇氨酸磷酸化特異性抗體在25°C孵育細(xì)胞/蓋玻片60分鐘。 加100 μ 1 1% BSA (溶解于TBST緩沖液)至蓋玻片上以洗去非特異性結(jié)合的抗體，洗三次， 每次5分鐘。然后將帶有FITC偶聯(lián)的二抗(購(gòu)自Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.產(chǎn)品號(hào)711-095-152兔)加在蓋玻片上，室溫孵育30分鐘。重復(fù)上述步驟，而將一抗改為全ferin抗體(購(gòu)自美國(guó)&mta Cruz公司，編號(hào)sc-32758)，二抗改為Rhodamine偶聯(lián)的抗鼠的二抗(購(gòu)自 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.產(chǎn)品號(hào) 715-025-150)。 用100 μ 1 PBS洗滌三次，每次5分鐘。最后，在載玻片上加適量(5 μ 1)的熒光抗淬滅封片劑，輕輕地將蓋玻片蓋下(生長(zhǎng)細(xì)胞的一面朝下)，用指甲油封片。使用Zeiss公司的激光共聚焦顯微鏡LSM510觀察染好的片子，并用photoshop處理。結(jié)果如圖2B和2C所示，圖2B為不同來(lái)源的組織樣本分別經(jīng)ezrin單抗及ezrin Thr567磷酸化特異性抗體孵育并用不同顏色熒光二抗染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。圖2C為以轉(zhuǎn)移的肝癌組織樣本中細(xì)胞的ezrin磷酸化信號(hào)與ezrin信號(hào)之比設(shè)定為100%，對(duì)其他組織樣本的磷酸化熒光強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到各組織發(fā)生磷酸化的百分比率。圖中數(shù)據(jù)分別為5個(gè)不同樣本中至少250個(gè)不同細(xì)胞計(jì)所得到的平均值士S. Ε. (ρ < 0. 001)。從圖中看出，相對(duì)于正常肝組織和原位癌組織，轉(zhuǎn)移灶肝癌組織中，Ezrin第567 位的磷酸化明顯提高。對(duì)結(jié)果進(jìn)行光密度分析后可見(jiàn)，如圖2C，以磷酸化的Ezrin信號(hào)與全 Ezrin信號(hào)的比率作比較，也證實(shí)上述結(jié)論。實(shí)施例2、Ezrin磷酸化物質(zhì)對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響—、侵染實(shí)驗(yàn)評(píng)估磷酸化對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響1、ezrin及突變體病毒的獲得CFP(購(gòu)自美國(guó)Clontech公司的pECFP載體，編號(hào)6900-1)載體通過(guò)&ilI+NotI 酶切下得到3971bp的片段(包含可表達(dá)CFP的基因片段)，將該片段與同樣酶切得到的 PShuttleCMV載體(購(gòu)自美國(guó)Mratagene公司，編號(hào)M0007)大片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子，挑取抗kana的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，利用kana抗性進(jìn)行篩選獲得正確的穿梭質(zhì)?？寺?，將該質(zhì)粒命名為pShuttleCMV-CFP。CFP-Ezrin (Zhou, R. ，Cao, X. ，Watson, C. ，Miao, Y. ，Guo, Ζ. ，F(xiàn)orte, J. G.， and Yao, Χ. (2003) J. Biol. Chem. 278，；35651_；35659，公眾可從中國(guó)科技大學(xué)獲得。)，通過(guò) Sall+NotI酶切得到5738bp的片段(包含可表達(dá)CFP-Ezrin的基因片段)，將該片段與同樣酶切得到的PShuttleCMV載體大片的連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子，挑取抗 kana的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，利用kana抗性進(jìn)行篩選獲得正確的穿梭質(zhì)?？寺?，將該質(zhì)粒命名為 pShuttleCMV-CFP-Ezrin。模擬567位不可磷酸化的突變體CFP-Ezrin567A (含有將ferin的第567位蘇氨酸突變?yōu)楸彼岬耐蛔兊鞍椎木幋a基因，該突變蛋白的氨基酸序列為序列表的序列2，核苷酸序列為序列表中的序列3)，具體如下以序列6和序列7所示的DNA作為引物，以上述 CFP-Ezrin質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)末端平端化和加磷處理后，進(jìn)行自連接，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序得到正確突變的產(chǎn)物，再通過(guò)Mll+Notl酶切下5738bp片段(包含可表達(dá)CFP-Ezrin567A 的基因片段)，將該片段與同樣酶切得到的PShuttleCMV載體大片段連接，得到連接產(chǎn)物， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子，挑取抗kana的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將包含可表達(dá)CFP-Ezrin56 的基因片段(含有序列表序列幻插入pShuttleCMV 載體的Mil和NotI位點(diǎn)間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為pShuttleCMV-CFP-Ezrin56 。模擬567位磷酸化的突變體CFP-Ezrin56 (含有將ferin的第567位蘇氨酸突變?yōu)樘於彼岬耐蛔兊鞍椎木幋a基因，該突變蛋白的氨基酸序列為序列表的序列5，核苷酸序列為序列4)，具體如下以序列6和序列8所示的DNA作為引物，以上述CFP-Ezrin質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)末端平端化和加磷處理后，進(jìn)行自連接，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序得到正確突變的產(chǎn)物，再通過(guò)Mll+Notl酶切下5738bp片段(包含可表達(dá)CFP-Ezrin56 的基因片段)，將該片段與同樣酶切得到的PShuttleCMV載體大片段連接，得到連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入
9大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子，挑取抗kana的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將包含可表達(dá)CFP-Ezrin56711的基因片段(含有序列表序列4)插入pShuttleCMV載體的MlI和 NotI位點(diǎn)間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為pShuttleCMV-CFP-Ezrin56 。用限制性?xún)?nèi)切酶PmeI 將上述 paiuttleCMV-CFP_Ezrin567A、 pShuttleCMV-CFP-Ezrin567D、pShuttleCMV-CFP、pShuttleCMV-CFP-Ezrin 線(xiàn)性化，并用膠回收的方法回收上述4種線(xiàn)性化穿梭質(zhì)粒。制備BJ5183(購(gòu)自美國(guó)Mratagene公司，編號(hào)200154)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)，用電轉(zhuǎn)化儀將線(xiàn)性化的穿梭質(zhì)粒paiuttleCMV-CFP-Ezrin5fm^npAdeasy-l載體(購(gòu)自美國(guó)Mratagene 公司，編號(hào)240009)共轉(zhuǎn)化到BJ5183電轉(zhuǎn)化感受態(tài)中，得到轉(zhuǎn)化子，提取抗Amp的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，進(jìn)行 PCR(弓丨物為 5，-atgccgaaaccaatcaat-3，禾口 5，_cagggcctcgaactc_3，)，得到 1758bp的片段為正確質(zhì)粒1。將正確質(zhì)粒1轉(zhuǎn)入DH5ci感受態(tài)，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定， 弓丨物為 5，-atgccgaaaccaatcaat-3，禾口 5，_cagggcctcgaactc_3，，得到 1758bp 的片段為正確質(zhì)粒2。將PCR鑒定正確的質(zhì)粒2用I^acI酶切進(jìn)行鑒定，得到1758bp的片段為正確質(zhì)粒 3，將其送去測(cè)序，結(jié)果該質(zhì)粒為將包含可表達(dá)CFP-Ezrin56w的基因片段(含有序列表序列 3)與pAdeasy-Ι同源重組得到的載體，將該質(zhì)粒命名為pAdeasy-CFP-Ezrin5·。通過(guò)乙醇沉淀法回收I^cI線(xiàn)性化的質(zhì)粒pAdeasy-CFP-Ezrin56、通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將線(xiàn)性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)入培養(yǎng)好的HEK293細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC，編號(hào)CRL-1573)，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，編號(hào)10091-148)的DMEM(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司， 編號(hào)12100046)培養(yǎng)基中，于5% C02，37°C環(huán)境中培養(yǎng)，10天后，至細(xì)胞大部分都漂浮起來(lái)時(shí)，收集細(xì)胞，并用反復(fù)凍融的方法，破碎細(xì)胞使病毒釋放到溶液中，收集上清液，得到重組病毒，命名為 Ad-CFP-Ezrin567A。設(shè)定一定梯度檢測(cè)病毒滴度，具體如下在96孔板中以1*104/孔的細(xì)胞量鋪三個(gè)孔的HEK293細(xì)胞，分別加入10μ 1、1μ 1、0. 1μ 1的病毒懸液，用熒光檢測(cè)感染的細(xì)胞數(shù)，計(jì)量病毒的滴度，結(jié)果為Ad-CFP-Ezrin567A滴度為3. 6*106/ml。以上述同樣的方法再次利用HEK293細(xì)胞對(duì)病毒進(jìn)行擴(kuò)增，提高其滴度(與上述同樣的檢測(cè)方法)，使Ad-CFP-Ezrin5·滴度達(dá)到5. 2*108/ml，分裝并保存于_80°C備用。采用上述的方法，將pShuttleCMV-CFP-Ezrin56 、pShuttleCMV-CFP、 pShuttleCMV-CFP-Ezrin分別與pAdeasy-Ι載體同源重組，分別得到 pAdeasy-CFP-Ezrin56 、pAdeasy-CFP、pAdeasy-CFP-Ezrin ；再分別導(dǎo)入昍以93 細(xì)胞中， 組裝得到重組病毒Ad-CFP-Ezrin56 、Ad-CFP, Ad-CFP-Ezrin。采用同樣的方法檢測(cè)， Ad-CFP-Ezrin567D、Ad-CFP, Ad-CFP-Ezrin 的滴度分別為 6. 5*108/ml、6. 4*108/ml、4. 8*108/ ml ο利用免疫印跡法檢測(cè)Ad-CFP-Ezrin567A、Ad-CFP-Ezrin56 和 Ad-CFP-Ezrin 中 ezrin的表達(dá)(ezrin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，編號(hào)sc-32758)，結(jié)果如圖3A所示， 3A 為 H印G2 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染 pAdeasy-CFP-Ezrin (CFP-Ezrin),pAdeasy-CFP-Ezrin567A(CFP -Ezrin567A)和 pAdeasy-CFP-Ezrin567A(CFP-Ezrin567A)的裂解液，轉(zhuǎn)染 30-36 小時(shí)后，收集細(xì)胞并裂解蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后蛋白印跡法檢測(cè)外源轉(zhuǎn)染的ezrin及突變體的表達(dá)水平， 結(jié)果顯示ezrin及其突變體的外源表達(dá)水平基本相似。
2、ezrin及突變體病毒侵染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性將H印G2細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC，編號(hào)HB-8065)鋪在8 μ m小孔的BioCoat Matrigel invasion chambers (購(gòu)自美國(guó) BD Biosciences 公司，編號(hào)；354480)中，于 37°C 的 DMEM 中培養(yǎng)60分鐘，按照說(shuō)明書(shū)的指導(dǎo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。HepG2分別被Ad-CFP-Ezrin567A、Ad-CFP-Ezrin567D、 Ad-CFP和Ad-CFP-Ezrin感染后(質(zhì)粒上均連有CFP，以便在顯微鏡下能很容易的觀察到感染的細(xì)胞穿過(guò)人工基底膜)，得到H印G2/Ad-CFP-Ezrin567A、H印G2/Ad-CFP-Ezrin567D、H印G2/ Ad-CFP 和 H印G2/Ad-CFP-Ezrin。分別在共聚焦顯微鏡下對(duì)穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)并比較。結(jié)果如圖3B 所示，3B 中，a 為 HepG2/Ad-CFP-Ezrin (野生型 CFP-Ezrin)、 b為H印G2/Ad-CFP-Ezrin56 (模擬磷酸化狀態(tài)的突變體CFP-Ezrin56 )、c為H印G2/ Ad-CFP-Ezrin567A(模擬非磷酸化狀態(tài)的突變體 CFP_Ezrin567A)、d 為 H印G2/Ad_CFP(CFP)。 觀察通過(guò)人工基底膜的細(xì)胞并記數(shù)比較ezrin及其突變體對(duì)!fepG2細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力的影響。標(biāo)尺代表20 μ m。圖像代表了至少4個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)組。隨著ezrin的磷酸化，!fepG2的遷移能力極大提高0fepG2/Ad-CFP-EZrin567A)。Ezrin及其突變體在H印G2細(xì)胞中的定位基本類(lèi)似，但感染了在H印G2/Ad-CFP-Ezrin56 細(xì)胞表現(xiàn)為穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)顯著增多(圖!3B，b，箭頭)。相反，在H印G2/Ad-CFP-EZrin5OTA細(xì)胞僅有很少幾個(gè)穿過(guò)人工基底膜 (圖3B，c，箭頭)。定量分析感染了 CFP-eZrinT567D的!fepG2細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力的變化，在上述侵染實(shí)驗(yàn)中分別選取大小相同的4-5個(gè)區(qū)域，對(duì)通過(guò)人工基底膜的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取平均值后， 計(jì)算與野生型ezrin處理組的結(jié)果的比例，進(jìn)行柱狀圖比較，設(shè)定H印G2/Ad-EZrin的遷移能力為100% (以細(xì)胞侵染效率可以表征細(xì)胞遷移能力的高低)，其他各組分別與該組做比較，結(jié)果如圖3C所示，圖C設(shè)定感染ezrin野生型的HepG2細(xì)胞的遷移能力為100%，其他各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移能力分別與該組做比較，平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算來(lái)自至少四組相對(duì)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)(#P < 0. 01，*P > 0. 01)。Ezrin0fepG2/Ad-CFP-Ezrin)的遷移能力為100(以野生型處理組為100)；T567A (HepG2/Ad-CFP-Ezrin567A)的遷移能力為 16. 5 士 2. 5 ；T567D(HepG2/Ad-CFP-Ezrin567D)的遷移能力為 2Ol. 6士9· 8 ；CFP tag(HepG2/Ad-CFP)的遷移能力為 17. 3 士 3. 3 ；ROCK siRNA處理組(在H印G2細(xì)胞中預(yù)先轉(zhuǎn)染過(guò)ROCK SiRNA)的遷移能力為 15. 2 士 5. 5 ；ROCK siR+Ezrin 處理(在 H印G 細(xì)胞中預(yù)先轉(zhuǎn)染過(guò) ROCK SiRNA, ROCK SiRNA 的一條RNA的序列為序列表中的序列1，然后再用Ad-CFP-Ezrin病毒感染)組的遷移能力為 17. 1 士 2. 3 ；ROCK siR+T567D(在H印G細(xì)胞中預(yù)先轉(zhuǎn)染過(guò)ROCK的SiRNA，然后再用 Ad-CFP-Ezrin567D病毒感染)的遷移能力為197. 6 士 5. 7 ；Parental處理組(未進(jìn)行任何處理)的遷移能力為10. 8 士 1. 6 ；通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于H印G2/Ad-CFP-Ezrin (ezrin野生型)，H印G2/ Ad-CFP-Ezrin56 (ezrin Thr567 非磷酸化)遷移能力提高了 2 倍(P < 0. 01，η = 10)。相反，H印G2/Ad-CFP基本不能穿過(guò)人工基底膜(圖3B，d)。因此，認(rèn)為ezrin Thr567磷酸化促進(jìn)了 ifepG2細(xì)胞的遷移。圖3D補(bǔ)充驗(yàn)證了 Iiho激酶對(duì)ezrin Thr567的磷酸化作用。用western-blot檢測(cè)各對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組ezrin磷酸化的水平，設(shè)定感染表達(dá)CFP-ezrin的實(shí)驗(yàn)組的磷酸化水平為100%，其他各組包括轉(zhuǎn)染ROCK SiRNA的母細(xì)胞(ROCK Si)實(shí)驗(yàn)組、感染表達(dá)CFP-ezrin 并轉(zhuǎn)染ROCK SiRNA實(shí)驗(yàn)組(ezrin+ROCK Si)和感染表達(dá)CFP-ezrin T567A實(shí)驗(yàn)組。相對(duì)于對(duì)照組，其ezrin Thr567磷酸化水平均降低到極低的水平{依次為只有(1 士0. 5)
(5 士 2) %和(0. 8 士 0. 6) % } ο二、檢測(cè)Iih0激酶的抑制對(duì)肝癌細(xì)胞H印G2轉(zhuǎn)移的影響一些研究顯示Iih0激酶信號(hào)通路在腫瘤中發(fā)生異常的上調(diào)，并且對(duì)癌癥細(xì)胞的侵染和轉(zhuǎn)移具有重要作用。而ferin的567位蘇氨酸也是Mio激酶的底物之一，嘗試了利用 Rho激酶的抑制劑Y27632(購(gòu)自美國(guó)Milipore公司，編號(hào)SCM07Q檢測(cè)Iiho激酶對(duì)!fepG2 細(xì)胞侵染性的作用。采用與圖3C同樣的方法檢測(cè)，以溶劑DMSO處理組為對(duì)照組設(shè)為100， 結(jié)果如圖4A所示，分別用不同濃度的Y27632處理!fepG2/Ad-CFP-EZrin (ezrin野生型)，侵染效率以占僅用溶劑處理組(DMSO)的侵染能力的百分比來(lái)計(jì)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)自三組獨(dú)立的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。Iu M Y27632組(用終濃度IuM的Y27632加入細(xì)胞培養(yǎng)基中后再進(jìn)行侵染實(shí)驗(yàn)) 侵染效率為96. 2 士4. 2;5u M Y27632組(用終濃度5uM的Y27632加入細(xì)胞培養(yǎng)基中后再進(jìn)行侵染實(shí)驗(yàn)) 侵染效率為66. 4士 2. 8;IOuM Y27632組(用終濃度IOuM的Y27632加入細(xì)胞培養(yǎng)基中后再進(jìn)行侵染實(shí)驗(yàn)) 侵染效率為12. 9 士 3.9 ；ROCK SiR組(在H印G2細(xì)胞中預(yù)先轉(zhuǎn)染過(guò)ROCK的SiRNA)侵染效率為11. 1 士9. 9 ；Ctri siR組(在!fepG2細(xì)胞中預(yù)先轉(zhuǎn)染過(guò)對(duì)照SiRNA)侵染效率為94. 2士5. 7 ；結(jié)果顯示H印G2細(xì)胞運(yùn)動(dòng)力下降，其下降程度表現(xiàn)為對(duì)Y27632的劑量依賴(lài)(黑色)。藍(lán)色顯示的是H印G2細(xì)胞經(jīng)ROCK激酶特異性SiRNA處理后，其遷移能力與對(duì)照組相比顯著下降。(P <0.01)用Y27632抑制了 I^ho激酶活性后，產(chǎn)生一種劑量依賴(lài)的對(duì)IfepG2細(xì)胞侵染性的抑制作用。這與早先的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，在SCID小鼠中引入Y27632可以阻止人源的肝細(xì)胞腫瘤在鼠肝臟內(nèi)的轉(zhuǎn)移作用結(jié)果一致。通過(guò)侵染實(shí)驗(yàn)的測(cè)定，對(duì)IfepG2的侵染能力的最大抑制作用來(lái)源于濃度為IOuM的Y27632。如果ferin的567位蘇氨酸是Iiho激酶的一個(gè)底物，那么利用Y27632對(duì)!fepG2細(xì)胞的處理應(yīng)當(dāng)可以抑制567位的磷酸化。等量的!fepG2細(xì)胞分別在1uM、5uM、10uM Y27632孵育處理后(分別加入各種終濃度的Y27632后，于37°C、5%的(X)2濃度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)若干小時(shí))，細(xì)胞裂解液經(jīng) SDS-PAGE分離通過(guò)蛋白印跡技術(shù)轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，用特異性ezrinThr567磷酸化抗體 (購(gòu)自Cell Signaling公司，貨號(hào)3141)檢測(cè)，結(jié)果如圖4B所示，!fepG2細(xì)胞用不同濃度的 Y27632處理后，經(jīng)SDS-PAGE分離后用免疫印跡對(duì)其ferin蛋白水平以及Thr567的磷酸化的水平進(jìn)行檢測(cè)。ezrin的磷酸化水平隨著加入的Y27632的劑量增加而逐漸降低，細(xì)胞表現(xiàn)出一種劑量依賴(lài)的對(duì)ferin的磷酸化作用的抑制現(xiàn)象。
利用特異性Iih0激酶SiRNA通過(guò)下調(diào)Iih0激酶的胞內(nèi)水平進(jìn)一步評(píng)估ezrin Thr567磷酸化與HepG2細(xì)胞的遷移能力的相關(guān)性(分別在兩份等量的HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 ROCK的SiRNA和對(duì)照SiRNA，37°C培養(yǎng)兩天，收取細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫印跡，檢測(cè)ROCK、總 ezrin和567位蘇氨酸磷酸化的ezrin的信號(hào)，ROCK SiRNA的一條RNA的序列為序列表中的序列1)，結(jié)果如圖4C，!fepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)入ROCK激酶特異的siRNA(25nM)或者對(duì)照SiRNA (SiRNA 的一條RNA的編碼序列5 ‘ GCTAGACTCATTACAACTA 3 ‘)，樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后做免疫印跡分析，分別檢測(cè)ROCK激酶水平，Ezrin水平以及ezrin Thr567的磷酸化水平。Iih0表達(dá)水平在轉(zhuǎn)入SiRNA以后明顯下調(diào)，并且Mio表達(dá)水平的下調(diào)并沒(méi)有影響ezrin在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，卻減少了 ezrin的Thr567磷酸化水平。更重要的是，發(fā)現(xiàn)Iih0激酶SiRNA處理的!fepG2細(xì)胞原本減弱的遷移能力可以通過(guò)轉(zhuǎn)染CFP-ezrinT567D而得到逆轉(zhuǎn)(如圖3C黑色柱狀圖部分，)。因此，Rho激酶通過(guò)磷酸化eZrinThr567從而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵染能力。為了進(jìn)一步解析ezrinThr567磷酸化促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移所涉及的分子機(jī)制，對(duì)細(xì)胞骨架組分 actin 進(jìn)行了免疫熒光分析。H印 G2/Ad-CFP-Ezrin567A、H印 G2/Ad-CFP-Ezrin567D、 HepG2/Ad-CFP和H印G2/Ad-CFP_Ezrin，經(jīng)固定后，用Alexa 488偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記 actin骨架(購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司，編號(hào)A12379)，觀察其在ezrin不同磷酸化狀態(tài)下的變化。結(jié)果如圖 4D 所示，H印G2/Ad-CFP (a)、HepG2/Ad-CFP-Ezrin (b)、H印G2/ Ad-CFP-Ezrin567A(c) ,HepG2/Ad-CFP-Ezrin567D (d)，用 FITC 偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記 actin 微絲骨架?？勺⒁獾絜zrinT567D能刺激細(xì)胞膜產(chǎn)生皺褶(d，箭頭所示)。選圖來(lái)自4個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表達(dá)模擬磷酸化突變體的H印G2細(xì)胞0fepG2/Ad-CFP-EZrin56 )有大量增多的褶皺產(chǎn)生，而表達(dá)模擬不可磷酸化狀態(tài)的突變體0fepG2/Ad-CFP-Ezrin567A)及CFP載體 (HepG2/Ad-CFP)均沒(méi)有這樣的現(xiàn)象。研究表明ezrinThr567的磷酸化能引起細(xì)胞骨架重排，而膜皺褶正是細(xì)胞遷移相關(guān)的膜可塑性變化的表現(xiàn)。因此推斷Mio激酶對(duì)ezrinThr567 的磷酸化促進(jìn)了 actin骨架動(dòng)態(tài)性變化，并為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移提供膜骨架物質(zhì)基礎(chǔ)。三、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ferin磷酸化對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的影響將肝癌細(xì)胞MHCC97-H(購(gòu)自上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司)細(xì)胞以每Iml體積培養(yǎng)液 5X107 的濃度，分別用 Ad-CFP-Ezrin567A、Ad-CFP-Ezrin567D、Ad-CFP、Ad-CFP-Ezrin 腺病毒感染細(xì)胞，得到 MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567A、MHCC97-H/Ad-CFP_Ezrin567D、MHCC97-H/ Ad-CFP,MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin。隨后將感染上病毒的上述細(xì)胞MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567A、MHCC97-H/ Ad-CFP-Ezrin567\MHCC97-H/Ad-CFP,MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin 分別植入 6 周大小雌性 NOD/ SCID小鼠(購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司)的肝區(qū)(每組取10只小鼠)。觀察移植瘤的生長(zhǎng)情況，每隔2天測(cè)量腫瘤大小，按照公式V = π a2b/6計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)體積。10 周后處死裸鼠，取出腫瘤，并切取肝組織，用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切成4-5um的切片。組織切片均行經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色。結(jié)果如圖5A所示，皮下注射不同實(shí)驗(yàn)組包括CFP對(duì)照組(MHCC97-H/Ad-CFP，C)、 ezrin 野生型(MHCC97-H/Ad-CFP_Ezrin，WT)、ezrinT567A (MHCC97-H/Ad-CFP_Ezrin567A，ΤΑ) 及 ezrinT567D(MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin56 ，TD)等的小鼠肝組織照片。TD (MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567D)的移植瘤導(dǎo)致了大量的小鼠肝內(nèi)組織轉(zhuǎn)移。
蘇木精-伊紅染色結(jié)果如圖5B所示(圖5B為腫瘤邊緣切片組化分析(左欄， 放大100倍)，相對(duì)與表達(dá)eZrinT567A及野生型，表達(dá)ferinT567D的移植瘤導(dǎo)致小鼠肝內(nèi)大量的轉(zhuǎn)移(右欄放大400倍))，可以看出，相對(duì)于野生型(WT)和CFP-Ezrinra7A(TA)， CFP-EzrinT567D(TD)的表達(dá)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞在裸鼠肝臟內(nèi)的轉(zhuǎn)移。對(duì)小鼠中肝轉(zhuǎn)移節(jié)點(diǎn)的計(jì)數(shù)，對(duì)比每組一個(gè)低倍鏡視野下可見(jiàn)的結(jié)節(jié)數(shù)總和，結(jié)果如圖 5C，Vector (MHCC97-H/Ad-CFP)的肝轉(zhuǎn)移節(jié)點(diǎn)數(shù)位 27，WT (MHCC97-H/Ad-CFP_Ezrin) 的肝轉(zhuǎn)移節(jié)點(diǎn)數(shù)位61，T567A(MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567A)的肝轉(zhuǎn)移節(jié)點(diǎn)數(shù)位38， T567D (MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567D)的肝轉(zhuǎn)移節(jié)點(diǎn)數(shù)位 210，也證明 CFP_EzrinT567D 的表達(dá)引起了更多的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生。同時(shí)，由于肝癌細(xì)胞在裸鼠肝臟內(nèi)的轉(zhuǎn)移及癌癥發(fā)展最終導(dǎo)致小鼠體重的減輕， 產(chǎn)生移植瘤9周以后各實(shí)驗(yàn)組小鼠體重比較結(jié)果如圖5D所示，Vec (MHCC97-H/Ad-CFP)的體重為 21. 6士2. 2g, WT (MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin)的體重為 19. 4士3. lg，T567A (MHCC97-H/ Ad-CFP-Ezrin567A)的體重為 20. 4士2. 8g，T567D(MHCC97-H/Ad-CFP_Ezrin56 )的體重為 15. 9士3. 7g;說(shuō)明了 CFP-EZrinT567D對(duì)肝腫瘤轉(zhuǎn)移與疾病的發(fā)展起了促進(jìn)作用。鑒于T567的磷酸化在臨床肝癌組織中的過(guò)表達(dá)及抑制567位蘇氨酸磷酸化對(duì)細(xì)胞浸潤(rùn)能力及在動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的抑制作用，認(rèn)為ferin 567位蘇氨酸磷酸化可作為肝癌轉(zhuǎn)移的預(yù)警指標(biāo)， 同時(shí)干擾567位蘇氨酸磷酸化或干擾567位蘇氨酸活化的eZrinT567A腺病毒可作為肝癌轉(zhuǎn)移的基因治療方案。
權(quán)利要求
1.抑制ferin第567位蘇氨酸磷酸化的物質(zhì)在制備具有抑制腫瘤功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑制Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的物質(zhì)為如下1)或2)中任意一種1)如下權(quán)利要求8所述蛋白或權(quán)利要求9所述編碼基因或權(quán)利要求10所述重組載體或重組腺病毒載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組腺病毒；2)抑制介導(dǎo)Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的信號(hào)通路的物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑制介導(dǎo)Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的信號(hào)通路的物質(zhì)為抑制Mio激酶表達(dá)/ 或活性的物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑制Mio激酶表達(dá)和/或活性的物質(zhì)為如下A)或B)A)Iih0激酶抑制劑Y27632 ；B)Rho激酶siRNA，所述siRNA的一條鏈的核苷酸序列為序列表中的序列1 ； 所述抑制腫瘤為抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和/或擴(kuò)散；所述腫瘤為肝癌。
5.一種具有抑制腫瘤功能的產(chǎn)品，其活性成分為抑制Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于所述抑制Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的物質(zhì)為如下1)或2)中任意一種1)如下權(quán)利要求13或14所述編碼基因或權(quán)利要求15或16所述的重組載體或重組腺病毒；2)抑制介導(dǎo)Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的信號(hào)通路的物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品，其特征在于所述抑制Mio激酶表達(dá)/或活性的物質(zhì)為如下A)或B)A)Iih0激酶抑制劑Y27632 ；B)Rho激酶siRNA，所述siRNA的一條鏈的核苷酸序列為序列表中的序列1 ； 所述抑制腫瘤為抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和/或擴(kuò)散；所述腫瘤為肝癌； 所述產(chǎn)品為藥物。
8.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求8所述蛋白的編碼基因；所述編碼基因?yàn)?)、2)或3)1)序列表中的序列3所示的DNA分子；2)與1)限定的DNA序列至少具有80%同源性且具有相同功能蛋白的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且具有相同功能蛋白的DNA分子。
10.含有權(quán)利要求9所述編碼基因的重組載體或重組腺病毒載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組腺病毒；所述重組載體具體為1)或2)1)所示的重組載體為將權(quán)利要求9所述編碼基因插入pShuttleCMV載體的多克隆位點(diǎn)得到的載體；2)所示的重組載體為將含有權(quán)利要求9所述編碼基因的片段插入pShuttleCMV載體的多克隆位點(diǎn)得到的載體；所述重組腺病毒載體具體為將所述重組載體與pAdeasy-Ι載體同源重組得到的載體； 所述重組腺病毒具體為重組腺病毒載體與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)，裝配得到的腺病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于ezrin磷酸化的物質(zhì)及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了抑制Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的物質(zhì)在制備具有抑制腫瘤功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述抑制Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的物質(zhì)為如下1)或2)中任一一種1)如下所述編碼基因或所述的重組載體或重組腺病毒；2)抑制介導(dǎo)Ezrin第567位蘇氨酸磷酸化的信號(hào)通路的物質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，在肝癌轉(zhuǎn)移中相伴發(fā)生的Ezrin第567位蘇氨酸的磷酸化受Rho激酶(ROCK)調(diào)控，敲除該激酶或者抑制其活性均可以減少肝癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生，在醫(yī)學(xué)及制藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A61P35/04GK102343091SQ20111027940
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月1日
發(fā)明者丁霞, 姚雪彪, 方國(guó)偉, 朱景德, 王冬梅, 鄧輝, 郭振, 陳勇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)