專利名稱：紅曲活性成分的提取、分離方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種中草藥領(lǐng)域內(nèi)的中藥活性組分的提取、分離方法及用途，具體是一種紅曲活性成分的提取、分離方法及用途。
背景技術(shù)：
紅曲米(red yeast rice),又稱紅曲或丹曲，是藥食兩用型傳統(tǒng)中藥材，以粳米或秈米為原料經(jīng)紅曲霉菌發(fā)酵得來，為我國偉大的科學(xué)瑰寶，迄今已有逾千年歷史。早在北宋年間，陶谷撰寫的《清異錄》便對它作為食物防腐劑的作用有了最早記載。而紅曲米的制備工藝及其健脾活血等藥用價值，則在明代李時珍撰寫的《本草綱目》中有了較為完善的記錄。隨著近代對紅曲米的研究不斷深入，它在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)揮的卓越功效逐漸受到亞洲其他國家、甚至歐美地區(qū)科研工作者的高度重視，并不斷探索、闡明其初級與次級代謝物的有益功效。日本遠(yuǎn)藤章博士在1979年的iThe Journal of Antibiotics))第852頁 《Monacolin K, A new hypocholesterolemic agent produced by a monascus species》一文中提到，他成功從紅色紅曲霉(Monascus ruber)中發(fā)現(xiàn)并分離得到Monacolin K(圖1，圖中R基團(tuán)為-CH3),并首次提出Monacolin K具有降低血液膽固醇的作用。經(jīng)證實(shí)，Monacolin K是羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase,HMG-CoA reductase)的一種競爭性抑制劑，它阻礙了 HMG-CoA在其還原酶作用下生成甲羥戊酸 (mevalonate)并最終合成膽固醇和其他產(chǎn)物。近年來，隨著對紅曲中生物活性物質(zhì)研究的不斷發(fā)展，各國的學(xué)者對其進(jìn)行了深人而廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)紅曲能產(chǎn)生許多有用的次級代謝產(chǎn)物，如紅曲色素、膽固醇抑制劑助Lovastatin，及具有降血壓、抗菌、降血氨、抗腫瘤、降糖等生理活性的成分，使傳統(tǒng)的紅曲增添了新的內(nèi)涵。進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Heveret al.在 1999 年的《Journal of Clinical M/triiio/ 〉〉第 69 期 231 頁〈〈Cholesterol—lowering effects of a proprietary Chinese red-yeast rice dietary supplement, American》一文中提至丨J Monacolin K 對 HMG-CoA 還原酶的抑制活性大大優(yōu)于洛伐他汀(Lovastatin)，并且其毒副作用甚微，從而更安全有效地阻斷、減少內(nèi)源性膽固醇的合成。Man et al.在2002年的《ifohc^ar and Cellular Biochemistry、第 233 期 153 頁《Cholestin inhibits cholesterol synthesis and secretion in hepatic cells 0fepG2)》一文中提到，通過臨床試驗證明功能紅曲因其含有強(qiáng)效降脂物質(zhì)，不僅對HMG-CoA還原酶有良好的抑制作用，使得肝細(xì)胞(Hep G2)膽固醇含量降低，從而減少肝細(xì)胞OfeP G2)內(nèi)未酯化的膽固醇和膽固醇酯(cholesteryl ester) 的合成與分泌，進(jìn)而減輕斑塊危險，并且不對肝功能造成擾亂性影響。Hong et al.在2008 年的《JOURNAL OF MEDICINAL FOOD》第 11 期 657 頁《Chinese Red Yeast Rice Versus Lovastatin Effects on Prostate Cancer Cells With and Without Androgen Receptor Over expression》一文中證明了 Lovastatin對激素依賴性前列腺癌(LNCaP)及激素非依賴性前列腺癌(LNCaP-AR)細(xì)胞增生的抑制作用良好；然而相較而言，同劑量濃度的Monacolin K (5. 93 μ Μ)對 LnCaP 細(xì)胞增生抑制作用是 Lovastatin 的 2 倍，而對 LNCaP-AR 型細(xì)胞增生的抑制作用則是Lovastatin的4倍，并且藥物穩(wěn)定性更勝一籌。另外，關(guān)于功能紅曲的其他有益功效如降血壓、治療骨質(zhì)疏松等在近年來也被多次報道，并受到熱切關(guān)注。例如，楊萌等就在文獻(xiàn)中提到了因紅曲霉屬中的許多菌株都不同程度產(chǎn)生維生素D2的前體——麥角固醇，當(dāng)紫外線照射后麥角固醇轉(zhuǎn)化為維生素D2對預(yù)防嬰兒佝僂病及幫助人體磷吸收有明顯作用。資料數(shù)據(jù)顯示，2010-2030年，由于人口老齡化與人口增長等因素，中國心血管疾病發(fā)生數(shù)還將繼續(xù)上升；如不加以重視，2030年中國心血管患者將增加2130萬、心血管死亡人數(shù)將增加770萬。這促使人們對降血脂類藥品、保健品的需求量增加，使得降血脂藥、 食品市場被繼續(xù)擴(kuò)張，尤其帶給具有天然降脂功效的紅曲產(chǎn)品莫大商機(jī)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供了一種紅曲活性成分的提取、 分離方法及用途。通過初步體外蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB (PTPlB)抑制試驗，確認(rèn)本發(fā)明所提供的一類紅曲類PTPlB抑制劑可有效抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB (PTPlB)的活性，可以用于制備治療糖尿病和肥胖類藥品、保健品。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明涉及一種紅曲活性成分的提取、分離方法，包括如下步驟
(a)將紅曲米干燥粉碎成粉后，經(jīng)乙醇提取后，濃縮提取得到紅曲粉提取物；
(b)步驟(a)中的紅曲粉提取物經(jīng)硅膠柱層析梯度洗脫后得到活性組分。優(yōu)選的，步驟(a)中的所述乙醇提取，具體為用相對所述紅曲米干燥粉質(zhì)量8 10 倍量的75%乙醇在40°C條件下提取三次，每次兩個小時。優(yōu)選的，步驟(b)中的所述硅膠柱層析梯度洗脫中所用的洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯，其重量比分別為10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:5。優(yōu)選的，所述步驟(b)中得到的活性組分為6個。本發(fā)明還涉及一種根據(jù)上述的方法制備而得的紅曲類PTPlB抑制劑，所述紅曲類 PTPlB抑制劑為采用重量比為10:1的石油醚和乙酸乙酯的洗脫劑洗脫而得的活性組分。本發(fā)明還涉及一種根據(jù)上述的紅曲類PTPlB抑制劑在制備預(yù)防和治療以PTPlB為靶點(diǎn)的糖尿病或肥胖癥的藥物中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果為本發(fā)明制備而得的極性較小的黃色色素活性部位F1，經(jīng)體外PTPlB活性實(shí)驗證實(shí)，具有較強(qiáng)的PTPlB抑制活性，可用于制備預(yù)防和治療以PTPlB (蛋白酪氨酸磷酸酶1B)為靶點(diǎn)的糖尿病或肥胖癥的藥物。


圖1為Monacolin K的結(jié)構(gòu)式；
圖2為紅曲粉提取、分離及活性測試流程圖； 圖3為紅曲各有效部位體外抑制PTPlB活性結(jié)果示意圖； 圖4為紅曲各有效部位交叉實(shí)驗及細(xì)篩結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1、紅曲活件組分的提取、分離
本發(fā)明中所用的紅曲米購于日本郡是健康食品中心。將紅曲米在60°C條件下干燥12 后，粉碎成粉狀物待用。如圖2所示，將干燥的紅曲粉用8 10倍量75%乙醇在40°C條件下提取三次，每次兩個小時。提取完畢后，過濾去掉殘渣，合并濾液，減壓濃縮后干燥得到紅曲浸膏(即紅曲粉提取物)。紅曲浸膏經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚乙酸乙酯體系梯度洗脫得到六個活性部位； 所用的洗脫劑配比分別為石油醚/乙酸乙酯=10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:5，得到的六個活性部位極性由小到大依次為Fl, F2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5，F(xiàn)6。其中，F(xiàn)l為極性較小的黃色色素成分； F5為極性較大的褐色色素成分，經(jīng)HPLC，LC-MS數(shù)據(jù)分析鑒定為Monacolin K。實(shí)施例2、PTPlB抑制活件測試
對實(shí)施例1所得的各活性部位進(jìn)行PTPlB抑制活性測試，如圖2所示。采用分子生物學(xué)方法，構(gòu)建基因重組的hGST-PTPlB-BL21 Ε. Coli人類PTPlB工程菌(該工程菌已在《ΡΤΡ1Β 抑制劑及合成和在制備治療2型糖尿病藥物中應(yīng)用》公開，公開號CN 102018688 A，
公開日
2011.4. 20)，以GST親和層析柱純化tiGST-PTPlB蛋白質(zhì)，利用含有磷酸的多肽pNPP被蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB (PTPlB)解掉一個磷酸后的產(chǎn)物pNP在波長405nm處有吸收峰的原理， 以PTPlB作用后生成pNP的量表示PTPlB酶活性變化以及化合物對酶活性的抑制情況，計算化合物對PTPlB酶抑制率。測試所用的PTPlB蛋白為重組表達(dá)并純化獲得。PTPlB的活性測定體系在測試溶劑(10 mM Tris, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH=7. 5)中加入 7. 5 μ g/mL PTPlB，6 mM PNPP及溶解或稀釋于DMSO中待測組分，每個測試濃度均設(shè)置3復(fù)孔。采用組分濃度的對數(shù)值對抑制率作回歸方程，計算IC50。本發(fā)明化合物對PTPlB抑制活性結(jié)果如圖3所示，試驗所使用陽性對照樣品為洛伐他汀和辛伐他汀，對圖中數(shù)據(jù)歸納如表1所示
表權(quán)利要求
1.一種紅曲活性成分的提取、分離方法，其特征在于，包括如下步驟(a)將紅曲米干燥粉碎成粉后，經(jīng)乙醇提取后，濃縮提取得到紅曲粉提取物；(b)步驟(a)中的紅曲粉提取物經(jīng)硅膠柱層析梯度洗脫后得到活性組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅曲活性成分的提取、分離方法，其特征在于，步驟(a)中的所述乙醇提取，具體為用相對所述紅曲米干燥粉質(zhì)量8 10倍量的75%乙醇中提取三次， 每次兩個小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅曲活性成分的提取、分離方法，其特征在于，步驟(b)中的所述硅膠柱層析梯度洗脫中所用的洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯，其重量比分別為10:1、 5·1> 3·1、2·1>1.1>1.5 ο
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅曲活性成分的提取、分離方法，其特征在于，所述步驟(b) 中得到的活性組分為6個。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備而得的紅曲類PTPlB抑制劑，其特征在于所述紅曲類PTPlB抑制劑為采用重量比為10:1的石油醚和乙酸乙酯的洗脫劑洗脫所得到的活性組分。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的紅曲類PTPlB抑制劑在制備預(yù)防和治療以PTPlB為靶點(diǎn)的糖尿病或肥胖癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種紅曲活性成分的提取、分離方法及用途。所述方法包括如下步驟將紅曲米干燥粉碎成粉后，經(jīng)乙醇提取后，濃縮提取得到紅曲粉提取物；再經(jīng)硅膠柱層析梯度洗脫后得到活性組分。所述紅曲類PTP1B抑制劑為采用重量比為10:1的石油醚和乙酸乙酯的洗脫劑洗脫所得到的活性組分。該抑制劑可用于制備預(yù)防和治療以PTP1B為靶點(diǎn)的糖尿病或肥胖癥的藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，通過初步體外PTP1B抑制試驗確認(rèn)本發(fā)明所制備的極性較小的黃色色素活性部位F1對PTP1B具有較強(qiáng)的抑制作用，可用于制備預(yù)防和治療以PTP1B為靶點(diǎn)的糖尿病或肥胖癥的藥物。
文檔編號A61K36/899GK102389535SQ20111029761
公開日2012年3月28日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者傅磊, 劉井寶, 劉文陸, 劉晶晶, 姜發(fā)琴, 金焱 申請人:上海交通大學(xué)